路書山,劉 浩,趙燕洲,屠繼軍,曹 慧①

(1.南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點實驗室,江蘇 南京 210095;2.安徽省宣城市宣州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,安徽 宣城 242099)

中國是農(nóng)業(yè)大國,在生產(chǎn)中通常使用化肥來提高作物產(chǎn)量,但化肥使用強度遠遠超過國際公認的標準[1-2]。長期不合理的化肥使用會導致土壤板結(jié)、養(yǎng)分失調(diào)、病蟲害加劇和環(huán)境污染問題[3-4],進而危害人畜健康,不利于農(nóng)業(yè)高質(zhì)高效生產(chǎn)。菜粕和豆粕作為植物油加工副產(chǎn)品,粗蛋白和氨基酸含量豐富,通常被作為飼料或肥料的原料,但硫苷、單寧和植酸等抗營養(yǎng)因子的存在,使其利用率大大降低[5]。目前,已有多種提高菜籽粕或豆粕利用率的研究。王永紅等[6]利用產(chǎn)蛋白酶菌株嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(StenotrophomonasmaltrophiliaG12,FJ211222)和短小芽孢桿菌(BacilluspumilusK11,FJ211221)混合菌種固體發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸肥料,發(fā)酵過程參數(shù)優(yōu)化后的菜粕蛋白水解度達到13.1%,增加了游離氨基酸和小肽含量。LIU等[7]利用蛋白酶產(chǎn)生菌BacillusflexusNJNPD41作為菌種材料,顯著提高了菜籽粕固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的游離氨基酸和短肽量。WANG等[8]利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株,通過固態(tài)發(fā)酵將豆粕蛋白水解成水溶性低相對分子質(zhì)量產(chǎn)物,產(chǎn)物富含多肽和游離氨基酸,以此發(fā)酵產(chǎn)物作為肥料,在低濃度(ρ=2.5 g·L-1)條件下其對油菜生長有較強的促進作用。

通過施用肥料改善土壤肥力和提高作物品質(zhì)是施肥的最主要目的[9-10]。目前,主要研究的肥料有微生物肥料、復合肥以及有機無機復混肥料等。微生物肥料能通過微生物的生命活動促進植物生長,改良土壤性狀,但微生物肥料存在肥效慢、專性強和貯存期短等問題[11]。復合肥營養(yǎng)元素多,養(yǎng)分含量高,但養(yǎng)分比例固定,難以滿足各類土壤和各種作物的需要,對施肥時間和施肥位置要求較高[12]。有機無機復混肥料含有有機物質(zhì)和無機營養(yǎng),肥料中有機部分的肥效和微生物作用較低,肥效主要是無機化肥的作用[13-14]。氨基酸水溶肥是一類以氨基酸為主體的水溶性肥料,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義[15]。大量研究表明,植物能夠吸收有機氮[16-17],而氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的最小分子,植物可以通過根系和葉片吸收這種有機氮肥[18]。施用氨基酸水溶肥還可以減緩土壤酸化速度[19-20],提升土壤有機質(zhì)的分解和肥料的轉(zhuǎn)化,進一步提升農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì),最終改善土壤質(zhì)量[21-22]。

筆者試驗探究了各種發(fā)酵因素對氨基酸產(chǎn)出的影響,為氨基酸水溶肥的生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)。盡管發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的應用已有很多,但針對不同應用場景該工藝仍需進行改進,以提高生產(chǎn)率和降低生產(chǎn)成本。通過Plackett-Burman試驗、爬坡試驗以及Box-Behnken Design試驗設計[23]并優(yōu)化菜粕和豆粕混合生產(chǎn)氨基酸水溶肥的發(fā)酵工藝,不僅可以減輕污染問題,還可以改善土壤環(huán)境,提高作物品質(zhì),提升農(nóng)業(yè)廢棄物附加值。這對推動氨基酸肥料的發(fā)展與應用,以及促進農(nóng)業(yè)的高質(zhì)、高效和可持續(xù)發(fā)展等都具有重要意義[24]。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

植物乳桿菌:南京農(nóng)業(yè)大學環(huán)境微生物實驗室保藏菌株LactobacillusplantarumG71;酵母菌:安琪酵母股份有限公司生產(chǎn),物料號為12004236;枯草芽孢桿菌:河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司生產(chǎn),登記號為PD20150091。

1.2 酶

堿性蛋白水解酶(50 U·mg-1)和酸性蛋白水解酶(100 U·mg-1)均為上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g·L-1):蛋白胨10 g,酵母膏5 g,牛肉膏10 g,葡萄糖20 g,磷酸氫二鉀2 g,醋酸鈉5 g,檸檬酸三銨2 g,硫酸鎂0.1 g,硫酸錳0.05 g,吐溫-80 1 g;LB培養(yǎng)基(g·L-1):蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉10 g;YPD培養(yǎng)基(g·L-1):蛋白胨20 g,酵母膏10 g,葡萄糖20 g。

1.4 種子液的制備

在250 mL錐形瓶中分裝100 mL上述液體培養(yǎng)基,滅菌后將活化菌種轉(zhuǎn)接到對應的液體培養(yǎng)基中。之后將接種過的MRS培養(yǎng)基(植物乳桿菌)置于37 ℃ 培養(yǎng)箱中,將YPD培養(yǎng)基(酵母菌)置于30 ℃、180 r·min-1搖床中,將LB培養(yǎng)基(枯草芽孢桿菌)置于37 ℃、180 r·min-1搖床中,分別培養(yǎng)24 h,將3個菌株在培養(yǎng)皿中劃線培養(yǎng)獲取單菌落,之后挑取單菌落轉(zhuǎn)移至100 mL液體培養(yǎng)基中,恒溫培養(yǎng)24 h制成種子液,用于菌種發(fā)酵培養(yǎng)。

1.5 菌種發(fā)酵培養(yǎng)液的制備

將上述種子液接種于相對應的100 mL液體培養(yǎng)基中,接種量為1%,繼續(xù)按照上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h,即得到用于發(fā)酵優(yōu)化使用的單菌發(fā)酵培養(yǎng)液。

1.6 正交試驗設計

明確3種菌株的添加比例對發(fā)酵菜粕、豆粕混合物指標的影響,以游離氨基酸增加率作為評價指標。菌株設置3個添加水平,設計L9(34)正交試驗,試驗各因素水平設置為植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和安琪酵母接種量分別為1%、5%和10%。

1.7 發(fā)酵步驟

取7 g菜粕、3 g豆粕和0.01 g堿性蛋白酶裝入100 mL錐形瓶中,各菌種培養(yǎng)液接種比例為1∶1∶1,無菌水按試驗設定的比例接入到發(fā)酵底物中,攪拌均勻,在25 ℃條件下恒溫靜置發(fā)酵,每隔一定時間進行翻料,培養(yǎng)期間每隔12 h用pH計測定pH,當pH<5時加入0.01 g酸性蛋白酶。接種量與料水比的計算:接種量按菌種發(fā)酵培養(yǎng)液體積與發(fā)酵底物的質(zhì)量比計算,料水比按發(fā)酵底物質(zhì)量與去離子水體積比計算。

1.8 pH調(diào)節(jié)與測定方法

將發(fā)酵培養(yǎng)基于搖床中在180 r·min-1、35 ℃條件下混合30 min,取出后靜置30 s,然后測定其pH。試驗時使用0.5 mol·L-1NaOH和0.5 mol·L-1HCl逐滴添加,然后用相同方式檢測是否調(diào)節(jié)至預定值。

1.9 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與測定方法

將發(fā)酵產(chǎn)物置于搖床中在150 r·min-1、35 ℃條件下提取30 min。提取結(jié)束后將錐形瓶內(nèi)所有固液成分移入50 mL離心管中,放入離心機并調(diào)整轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1,4 ℃條件下離心30 min。離心結(jié)束后將上清液移入1 000 mL容量瓶中,將殘渣移入錐形瓶中加入30 mL蒸餾水繼續(xù)提取。重復上述步驟3次,將容量瓶定容至1 000 mL。用茚三酮比色法測定游離氨基酸含量后計算每克物料所生產(chǎn)的游離氨基酸質(zhì)量。

1.10 氨基酸水溶肥各成分的提取與測定

將發(fā)酵產(chǎn)物置于搖床中在150 r·min-1、35 ℃條件下提取30 min。提取結(jié)束后將錐形瓶內(nèi)所有液體及殘渣移入50 mL離心管中,放入離心機并調(diào)整轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1,4 ℃條件下離心30 min。用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀和總氮分析儀測定其中的大量元素和中微量元素含量。

1.11 Plackett-Burman試驗分析

采用PB(Plackett-Burman)試驗,分析發(fā)酵時間(A)、起始pH(B)、料水比(C)、接種量(D)和翻料間隔(E)對發(fā)酵生產(chǎn)游離氨基酸的影響。上述5個影響因子分別取高和低2個水平,以發(fā)酵液中游離氨基酸含量作為因變量,采用Minitab 17軟件設計12組試驗。每組設置3個重復,各因素的高低水平如下:培養(yǎng)時間,120、216 h;起始pH,6、9;料水比,1∶3、1∶7;接種量,3%、7%;翻料間隔,12、24 h。

1.12 最陡爬坡試驗分析

根據(jù)1.11節(jié)所述通過PB試驗結(jié)果篩選出3個顯著影響因子,參考各個顯著因子的正負效應值并結(jié)合實際情況,確定最陡爬坡試驗設計的方向及步長。以最陡爬坡試驗結(jié)果的最大游離氨基酸含量,作為下一步Box-Behnken Design(BBD)試驗分析的中心點。

1.13 BBD試驗

采用Expert Design 8.1軟件對3個因素進行BBD試驗設計,制作其對游離氨基酸含量影響的響應面曲線。BBD試驗設計的各因素設置及水平如下:發(fā)酵時間,192、216、240 h;起始pH,8、9、10;料水比,1∶6、1∶7、1∶8。

1.14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

正交試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0中單因素分析比較平均值,結(jié)合 Duncan、LSD和S-N-K等方法進行多重比較,以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株接種量對氨基酸含量的影響

對以氨基酸含量作為評價指標的正交結(jié)果進行極差分析。由表1可知,3個菌株的最佳組合為植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的培養(yǎng)液體積比為1∶1∶1。極差分析結(jié)果顯示,3株菌對氨基酸含量影響的大小順序為植物乳桿菌>枯草芽孢桿菌>酵母菌。正交試驗結(jié)果包含該最佳組合,其游離氨基酸含量為36.4 g·kg-1,明顯高于其他處理。主體間效應檢驗結(jié)果見表2。

表2 各菌株不同水平氨基酸含量方差分析

由表2可知,3株菌的不同添加比例對試驗結(jié)果具有顯著影響(P<0.05)。對于植物乳桿菌1%接種量水平試驗組氨基酸含量顯著高于5%和10%接種量水平(P<0.05);枯草芽孢桿菌1%接種量水平試驗組氨基酸含量顯著高于5%接種量水平(P<0.05),但與10%接種量水平之間差異不顯著(P>0.05);酵母菌3個接種量水平試驗組之間氨基酸含量差異不顯著(P>0.05)。

2.2 PB試驗各因素的主要效應分析

通過PB試驗共得到12組結(jié)果,具體試驗設計及結(jié)果見表3。PB試驗回歸系數(shù)t檢驗(表4)顯示,培養(yǎng)時間(A)、pH(B)和料水比(C)的t值分別為4.60、2.60和3.58,其P值分別為0.004、0.041和0.012,P值均小于0.05。因素D(接種量)和E(翻料間隔)回歸系數(shù)不為零的假設成立,且因素A、B和C對游離氨基酸產(chǎn)量有顯著影響。

表3 PB試驗設計和游離氨基酸含量

表4 PB試驗回歸系數(shù)

為明確各因素對于固體發(fā)酵的影響程度,制作標準化效應的Pareto圖,結(jié)果見圖1。由圖1可知,各因素對于游離氨基酸產(chǎn)量均產(chǎn)生影響,影響程度大小依次為A>C>B>D>E,其中,A、B和C對于固體發(fā)酵有顯著影響。因此,認為A、B和C是影響水溶性氨基酸含量的主要因素,后期試驗選取這3個因素進行。

A為培養(yǎng)時間,B為pH,C為料水比,D為接種量,E為翻料間隔。虛線為顯著性參考線。

2.3 最陡爬坡試驗分析

通過PB試驗篩選出A、B和C3個具有顯著性影響的因子,但還需要通過PB試驗擬合方程系數(shù)的正負值來確定最陡爬坡試驗的方向和步長,從而設計爬坡試驗。試驗結(jié)果見表5,最大游離氨基酸含量出現(xiàn)在第4組,表明此時A、B和C水平接近最優(yōu)點,故選取此水平(培養(yǎng)時間為216 h,起始pH為9.0,料水比為1∶7)作為后續(xù)BBD試驗的中心點。

表5 最陡爬坡試驗設計和結(jié)果

2.4 BBD試驗結(jié)果分析

利用Expert Design進行BBD試驗設計,共得到17組結(jié)果,具體試驗設計和結(jié)果見表6。通過對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到響應值(氨基酸產(chǎn)量)對影響發(fā)酵反應的關(guān)鍵因素(A、B和C)的多元二次回歸方程:R1(氨基酸產(chǎn)量)=2.55+0.026×A+0.017×B+7.625E-00×C+0.010×A×B+4.000E-003×A×C+4.250E-003×B×C-0.19×A2-0.078×B2-0.052×C2。模型顯示差異達極顯著水平(P<0.01),表明用回歸方程描述各因素與因變量之間的關(guān)系時,因變量與各因素之間的關(guān)系顯著,說明該模型可靠。而失擬項未達顯著水平(P=0.313 9),表明該方程的擬合度和可信度都很高,可用于預測該發(fā)酵試驗的最大游離氨基酸產(chǎn)量(表7)。

表6 BBD試驗設計和結(jié)果

表7 BBD試驗設計方差分析

響應面立體分析結(jié)果(圖2)表明,各因素間交互作用對發(fā)酵生產(chǎn)游離氨基酸能力有影響,各因素水平存在游離氨基酸生產(chǎn)的最佳值。利用Expert Design 8.1軟件模擬計算最優(yōu)工藝參數(shù)可得,最大游離氨基酸的極值點編碼:發(fā)酵時間,217.68 h;起始pH,9.12;料水比,1∶7.008。該模型預測的游離氨基酸產(chǎn)量最優(yōu)結(jié)果可達76.4 g·kg-1。為了驗證模型的預測氨基酸含量與實際氨基酸含量的擬合程度,采用優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數(shù)重復試驗3次,所得平均游離氨基酸產(chǎn)量達到(76.8±1.5) g·kg-1。實際氨基酸含量與理論值較為接近,表明模型有效。

R1為氨基酸產(chǎn)量;A為發(fā)酵時間;B為起始pH;C為料水比。

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物水溶物主要成分分析

發(fā)酵產(chǎn)物中氮、磷和鉀質(zhì)量分數(shù)分別為0.453%、0.098 8%和0.257%,中量元素(Ca+Mg+S)和微量元素(Fe+Mn+Zn+Cu+B)質(zhì)量分數(shù)分別為0.132%和0.002 43%。采用氨基酸自動分析儀檢測出17種氨基酸,苯丙氨酸(Phe)質(zhì)量分數(shù)最高,為0.106 8%,其后依次為精氨酸(Arg)和亮氨酸(Leu),其質(zhì)量分數(shù)分別為0.085 5%和0.081 3%(表8)。

表8 發(fā)酵產(chǎn)物水溶物主要成分分析

3 討論

不同發(fā)酵參數(shù)如pH、接種量、培養(yǎng)時間和料液比等會對菌株的生長代謝以及菜粕和豆粕分解能力造成影響。為提高菌株的生長能力和水溶性氨基酸產(chǎn)量,采用正交試驗、PB試驗和BBD試驗對發(fā)酵參數(shù)進行優(yōu)化,以充分發(fā)揮混合菌株的代謝能力,提高發(fā)酵產(chǎn)物得率。

固體發(fā)酵過程中基質(zhì)含水量、pH、發(fā)酵時間、通氣量和混菌組成等對發(fā)酵產(chǎn)物有著很大影響[25]。筆者研究中PB試驗表明,發(fā)酵時間、pH及料水比可顯著影響發(fā)酵結(jié)果。發(fā)酵時間是影響發(fā)酵效果的一個重要因素[26]。選擇合適的發(fā)酵時間,不但能有效地提高發(fā)酵效率,還能減少因發(fā)酵過度而產(chǎn)生的不必要浪費。筆者研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵時間會顯著影響氨基酸含量,隨著時間的增加,氨基酸含量呈先增高后降低趨勢,這說明微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸并非是時間越長越好,這與多數(shù)研究結(jié)果[5]一致。這可能是由于時間延長,發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)大量微生物會優(yōu)先利用被分解的小分子蛋白合成自身微生物菌體蛋白。pH的變化可引起細胞膜電荷發(fā)生變化致使膜的通透性改變,從而影響微生物對于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力,以及改變營養(yǎng)物質(zhì)的可給性,影響代謝過程中酶的活性[27]。料水比是影響微生物活性的重要因素,水分過高會導致基質(zhì)黏性增加并減少基質(zhì)內(nèi)氣體交換,但能促進基質(zhì)內(nèi)營養(yǎng)成分和菌體的流動性[28];而基質(zhì)水分過低會影響乳酸菌活性,菌體生長受到抑制,酶的產(chǎn)量減少[29]。筆者試驗中最佳料水比為1∶7.008,這一研究結(jié)果雖比多數(shù)研究者的報道高,但在氨基酸的最終產(chǎn)量上,游離氨基酸含量達到76.8 g·kg-1,高于多數(shù)研究結(jié)果[5]。筆者研究還發(fā)現(xiàn),接種量對氨基酸含量和其他指標的影響不顯著,這可能是因為隨著時間的延長,各接種量最終都會達到一個基質(zhì)容量內(nèi)的最大微生物量[30]。

不同菌株配比對發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的效果有明顯影響。王永紅等[6]等使用兩株產(chǎn)蛋白酶菌株嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌和短小芽孢桿菌,以菜粕為原料進行固體發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸肥料,最終獲得53.99 g·kg-1的游離氨基酸含量,但未進行兩株菌混菌比例的優(yōu)化。另外,多數(shù)研究者使用的混菌均為細菌,而筆者試驗使用的混菌包含真菌和細菌,真菌在發(fā)酵過程中菌絲直接刺入固體基質(zhì),這對原材料的利用有著更為積極的作用[31]。

不同的優(yōu)化步驟也會對最終優(yōu)化結(jié)果產(chǎn)生影響。與李燕等[32]的研究結(jié)果相比,在菌株優(yōu)化上筆者試驗采用真菌與細菌的混菌,并對菌株進行了優(yōu)化選擇;在發(fā)酵的各因素水平優(yōu)化上,多數(shù)研究僅開展了單因素及正交試驗,未提前對影響因素進行顯著性篩選。雖然最終優(yōu)化結(jié)果的發(fā)酵時間較短,能加速生產(chǎn),但存在對不顯著因素進行優(yōu)化的可能,這對提升最終產(chǎn)量起到消極作用;在氨基酸的最終產(chǎn)量上,李燕等[32]將菜粕脫毒后得到的氨基酸含量低于筆者試驗結(jié)果,但對菜粕進一步水解后,氨基酸含量大大提升?？梢?通過對氨基酸發(fā)酵進行優(yōu)化后,采用理化方法可進一步提升發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量。

通過優(yōu)化試驗,筆者發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵處理后終產(chǎn)物水溶肥中微量、中量元素及氨基酸含量較為豐富,植物體內(nèi)微量元素多為酶的組成成分,而中量元素具有參與調(diào)節(jié)植物代謝、合成葉綠素和作為酶的活化劑等功能[33-34]。氨基酸具有促進作物新陳代謝、提高光合作用速率、迅速補充作物多種營養(yǎng)元素、調(diào)控作物營養(yǎng)生長等多種功效。氨基酸除了可以被植物更好地吸收利用外,還可以與中、微量元素形成穩(wěn)定性強的螯合物,減少元素之間的拮抗作用,增加植物對中、微量元素的吸收[35]。

4 結(jié)論

筆者試驗以豆粕和菜粕為原料,采用混合發(fā)酵工藝生產(chǎn)氨基酸水溶肥,通過對發(fā)酵工藝進行多步優(yōu)化,探究最佳發(fā)酵參數(shù)。利用PB試驗篩選出具有顯著性影響的發(fā)酵因素為發(fā)酵時間、起始pH和料水比,顯著性由高到低依次為發(fā)酵時間、料水比和起始pH。通過BBD試驗,得到顯著影響因素和游離氨基酸含量之間的回歸曲線,進一步通過Expert Design繪制顯著影響因素交互作用對游離氨基酸含量的響應面曲線,結(jié)果顯示最佳發(fā)酵組合為發(fā)酵時間217.68 h,起始pH 9.12,料水比1∶7.008,接種量3%,翻料間隔24 h。經(jīng)驗證,游離氨基酸產(chǎn)量達到76.8 g·kg-1。上述研究結(jié)果對于農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用以及發(fā)展生態(tài)高值農(nóng)業(yè)和提升土壤質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實意義。