李 楠,陸勇澤,,朱光燦,①,李淑萍

(1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210096;2.西藏民族大學(xué)西藏水污染控制與生態(tài)修復(fù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 咸陽(yáng) 712082)

鄉(xiāng)村有機(jī)廢棄物和畜禽糞便經(jīng)處理后可作為有機(jī)肥或生物質(zhì)資源改良土壤環(huán)境,增加有機(jī)質(zhì)、氮、磷等養(yǎng)分,并補(bǔ)充微量元素[1]。好氧堆肥具有高溫期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、周期短、基質(zhì)分解徹底、異味小等優(yōu)點(diǎn)[2],初始溫度保持在30 ℃左右時(shí)嗜溫菌活躍,更有利于分解利用糖和淀粉等有機(jī)物[3],而冬季氣溫過(guò)低易導(dǎo)致堆肥難以啟動(dòng)。

近年來(lái),有學(xué)者利用太陽(yáng)能加快堆肥進(jìn)程和提升肥效。駱?biāo)琜4]利用太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為電能進(jìn)行鼓熱風(fēng)供氧曝氣從而對(duì)堆肥反應(yīng)器進(jìn)行溫度控制以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器內(nèi)的均勻供熱。余芳[3]通過(guò)比較太陽(yáng)能、大棚堆肥裝置和普通堆肥對(duì)相關(guān)因素的影響,發(fā)現(xiàn)使用太陽(yáng)能熱水器為好氧堆肥裝置提供穩(wěn)定熱源可以保證堆肥高效完成。雖然太陽(yáng)能輔助好氧堆肥有利于加快腐熟進(jìn)度和提升肥效,但是環(huán)境溫度較高也會(huì)帶來(lái)更多氮素?fù)p失,趙秀玲等[5]發(fā)現(xiàn)45 ℃條件下牛糞堆肥的氮素?fù)p失高于30 ℃條件下的損失。

堆肥過(guò)程中氮損失主要由于pH升高和堆體溫度較高導(dǎo)致NH3揮發(fā)、硝化產(chǎn)物(如NO3-、NO2-)的浸出以及反硝化導(dǎo)致NO、N2O和N2的排放[6]。姜繼韶等[7]以過(guò)磷酸鈣和腐爛蘋果為添加劑,設(shè)置4個(gè)處理后發(fā)現(xiàn)3%過(guò)磷酸鈣和7.5%腐爛蘋果作為混合添加劑比單純添加過(guò)磷酸鈣或是腐爛蘋果對(duì)氮素保持效果更好。張邦喜等[8]發(fā)現(xiàn)堆肥原料為雞糞、煙末和菌糠的情況下添加5%過(guò)磷酸鈣比添加10%生物炭的固氮效果好。過(guò)磷酸鈣可以直接激活核心功能菌,增加細(xì)菌多樣性和復(fù)雜性,加速堆體腐熟,降低鹽和重金屬離子含量,提高堆肥的種子發(fā)芽指數(shù)(GI)[9]。

太陽(yáng)能輔助好氧堆肥雖然可以促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行,但會(huì)因?yàn)闇囟冗^(guò)高造成氮素?fù)p失更嚴(yán)重。筆者研究利用太陽(yáng)能輔熱并提供新風(fēng),對(duì)新鮮豬糞、雜草和水稻秸稈進(jìn)行好氧堆肥處理,通過(guò)添加不同量過(guò)磷酸鈣探究氮素保持效果,對(duì)堆體理化性質(zhì)和微生物狀況進(jìn)行分析。主要從pH、氮和磷的角度分析過(guò)磷酸鈣對(duì)堆體的影響,并從種的角度分析不同發(fā)酵階段微生物群落組成變化并考察微生物群落結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境因子的關(guān)系,以期為鄉(xiāng)村有機(jī)廢棄物和畜禽糞便資源化利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

堆肥原料為新鮮豬糞、雜草和水稻秸稈,取自江蘇句容陳莊。新鮮豬糞來(lái)自家庭養(yǎng)豬舍,水稻秸稈源自農(nóng)戶家?guī)齑?雜草取自田邊。經(jīng)自然晾曬后的雜草和水稻秸稈采用破碎機(jī)破碎至長(zhǎng)3～5 cm,其中,水稻秸稈用作調(diào)理劑,原料基本性質(zhì)見表1。

表1 堆肥原料的基本性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

堆肥所用裝置為處理規(guī)模0.5 t·d-1的陽(yáng)光堆肥房及相關(guān)土建、電氣、自控裝置,包括陽(yáng)光堆肥房房體、光伏系統(tǒng)、除臭裝置、滲濾液收集處理裝置和通風(fēng)管路。堆肥房屋頂采用透明有機(jī)玻璃覆蓋,光伏系統(tǒng)產(chǎn)生的電能用于供應(yīng)新風(fēng)以及寒冷天氣加熱水箱進(jìn)行暖風(fēng)供應(yīng),多余電能儲(chǔ)存于蓄電池以備陰雨天使用。陽(yáng)光堆肥房結(jié)構(gòu)示意見圖1。

1—陽(yáng)光堆肥房房體;2—進(jìn)出料口;3—太陽(yáng)能光伏板;4—光伏系統(tǒng)控制箱;5—水箱;6—風(fēng)機(jī);7—通風(fēng)管路;8—滲濾液收集槽;9—滲濾液提升泵;10—除臭裝置;11—風(fēng)機(jī);12—排氣管;13—房頂;14—濾網(wǎng)。

根據(jù)堆肥原料的基本性質(zhì),按m(豬糞)∶m(雜草)∶m(稻草)=4∶1∶1的比例,稱取20 kg豬糞、5 kg雜草和5 kg水稻秸稈,控制堆體C/N比值約為25,質(zhì)量含水率約為60%。在陽(yáng)光堆肥房?jī)?nèi)設(shè)置兩組堆體,堆體1添加堆料干重2.5%的過(guò)磷酸鈣,堆體2添加堆料干重5%的過(guò)磷酸鈣。通風(fēng)量為3.22 m3·min-1,前10 d每天翻堆1次,后期每2 d翻堆1次。第1、4、7、10、13、16、19天進(jìn)行取樣,在堆體上、中、下部各取100 g,混合均勻后取50 g在-18 ℃條件下保存,其余在4 ℃條件下保存,以備測(cè)定理化指標(biāo)及進(jìn)行微生物分析,所有測(cè)定重復(fù)3次,并計(jì)算平均值。

1.3 檢測(cè)方法

溫度[10]:每天9點(diǎn)和15點(diǎn)使用手持?jǐn)?shù)顯溫度計(jì)監(jiān)測(cè)堆體內(nèi)部3個(gè)點(diǎn)的溫度,取平均值作為當(dāng)日堆體溫度。pH和電導(dǎo)率(EC)[11]:稱取5.0 g堆肥樣品,按固液比為1∶10加入超純水后,振蕩2 h后以5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心30 min,分別采用雷磁便攜式多參數(shù)分析儀(DZB-718)和柯迪達(dá)筆式電導(dǎo)率儀(CT-3021)測(cè)定上清液pH和EC。含水率[4]:稱量適量樣品置于105 ℃恒溫烘箱中烘至恒重,由前后的質(zhì)量差計(jì)算含水率。有機(jī)質(zhì)[4]:烘箱烘干后的樣品在550 ℃條件下灼燒8 h,由前后質(zhì)量差計(jì)算有機(jī)質(zhì)含量。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮[11]:按固液比為1∶10取5.0 g堆肥樣品加入2 mol·L-1KCl溶液,振蕩2 h后以5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心30 min,取上清液過(guò)0.45 μm孔徑濾膜測(cè)定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。全氮:參考NY 525—2021《有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)》中的方法。全磷和有效磷:參考NY/T 2541—2014《肥料 磷含量的測(cè)定》中的方法。種子發(fā)芽指數(shù)(GI,IG)[7]:按固液比1∶10用超純水浸提堆肥樣品,振蕩2 h后以5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心30 min,取上清液得到堆肥浸提液。在培養(yǎng)皿中放置一層濾紙,并放入20粒小白菜種子,加入10 mL浸提液,對(duì)照組加入10 mL超純水,在25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)2 d后,記錄種子發(fā)芽數(shù)與種子發(fā)芽長(zhǎng)度,IG(%)計(jì)算公式為

IG=(rs×ls)/(rc×lc)×100%。

(1)

式(1)中,rs和rc分別為樣品和對(duì)照發(fā)芽比例;ls和lc分別為樣品和對(duì)照發(fā)芽長(zhǎng)度。

氮損失(SN,%)計(jì)算公式為

SN={[N1×M1× (1-W1)]-[N2×M2× (1-W2)]}/[N1×M1× (1-W1)] × 100%。

(2)

式(2)中,N1、N2分別為堆體初始、結(jié)束時(shí)總氮質(zhì)量含量,%;M1、M2分別為堆體初始、結(jié)束時(shí)總質(zhì)量,kg;W1、W2分別為堆體初始、結(jié)束時(shí)質(zhì)量含水率,%[12]。

1.4 高通量測(cè)序

對(duì)所采集樣品16S全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增,利用PacBio平臺(tái)測(cè)序。提取樣本DNA后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和濃度。以稀釋后的基因組DNA為模板,使用帶Barcode的特異引物和高效高保真酶進(jìn)行PCR檢測(cè),確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR產(chǎn)物使用20 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),對(duì)目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物[13]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Qiime軟件計(jì)算Shannon、Simpson、Chao1和Ace指數(shù),采用R軟件繪制NMDS圖并進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,采用Origin軟件繪制理化指標(biāo)[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 堆肥的物理和化學(xué)性質(zhì)

溫度變化可以反映堆肥的進(jìn)程、質(zhì)量、微生物活性和滅菌效果[15]。圖2表明2個(gè)堆體都經(jīng)過(guò)了升溫期、高溫期和降溫腐熟期3個(gè)階段。兩個(gè)堆體升溫均較快,第2天進(jìn)入高溫期,最高溫度均高于55 ℃,穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6 d。高溫期溫度高且穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng),可以殺死病原微生物[16]。高溫期處于52～60 ℃ 水平時(shí)有利于可降解有機(jī)物的快速分解[17],釋放微生物呼吸產(chǎn)生的大量熱量[18],促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和繁殖。堆肥22 d時(shí),2個(gè)堆體溫度均趨于穩(wěn)定。由于天氣原因氣溫波動(dòng)較大,而堆肥房?jī)?nèi)溫度始終維持在40 ℃左右,可見太陽(yáng)能堆肥房保溫效果很好,為堆肥的順利進(jìn)行提供較為合適的環(huán)境溫度。

圖2 堆肥過(guò)程中溫度變化

含水率影響微生物代謝和通氣速率,有助于維持嗜熱相并提供溶解介質(zhì)[19],含水率過(guò)高的堆體趨于厭氧[20]。溫度和有機(jī)質(zhì)互相影響,溫度變化主要受有機(jī)質(zhì)的降解快慢影響,兩者都是影響堆體腐熟的關(guān)鍵因子[21]。圖3表明堆肥過(guò)程中含水率和有機(jī)質(zhì)含量均呈下降趨勢(shì),2個(gè)堆體高溫期下降趨勢(shì)明顯快于其他階段,表明高溫期微生物活動(dòng)更劇烈,有機(jī)物消耗更多,高溫帶來(lái)的水分散失更明顯。前10 d堆體1含水率下降約15個(gè)百分點(diǎn),堆體2下降約17個(gè)百分點(diǎn),堆體2升溫期和高溫期微生物豐度和多樣性更高,有助于含水率的快速下降。在降溫腐熟期溫度降低且趨于穩(wěn)定,含水率下降速度減慢,微生物活動(dòng)減少。堆體1和堆體2初始有機(jī)物含量分別為75.72%和77.27%,堆肥結(jié)束時(shí)分別下降到44.60%和40.56%,下降31.12和36.71個(gè)百分點(diǎn),可見堆體2有機(jī)質(zhì)降解更多,可能是因?yàn)樘砑痈嗟倪^(guò)磷酸鈣為微生物提供更多磷營(yíng)養(yǎng),微生物活動(dòng)更劇烈,從而促進(jìn)微生物對(duì)有機(jī)物的分解。

圖3 堆肥過(guò)程中堆體含水率、有機(jī)質(zhì)、pH和EC的變化

pH控制在6.7～9.0水平有利于堆肥過(guò)程中微生物活動(dòng),當(dāng)pH>7.5時(shí),氨揮發(fā)導(dǎo)致的氮損失將明顯增加[22]。由圖3可知,pH先下降后上升,過(guò)磷酸鈣作為酸性肥料,加入堆體后會(huì)顯著降低堆體pH,同時(shí)過(guò)磷酸鈣會(huì)與堆肥過(guò)程中產(chǎn)生的銨離子反應(yīng)生成磷酸銨而減少氨揮發(fā),從而實(shí)現(xiàn)氮素保持[23]。堆肥20 d前后,pH值保持穩(wěn)定,堆體1穩(wěn)定在7.6左右,堆體2穩(wěn)定在7.5左右。堆體2的EC總體高于堆體1,堆體2的EC先增大后趨于平緩;而堆體1則先增大后減小隨后呈激增趨勢(shì),激增可能是受物料分解、離子沉淀和硝化作用等綜合作用的影響[2]。堆體1和堆體2的初始EC分別為2.39和2.91 mS·cm-1,結(jié)束時(shí)分別為4.13和4.59 mS·cm-1。觀察微生物群落變化發(fā)現(xiàn),雖然增加過(guò)磷酸鈣添加量可降低堆肥pH(堆體2的pH小于堆體1),但是并未抑制微生物活性,堆體2氮素保持效果更好。有研究指出堆肥EC值超過(guò)4.0 mS·cm-1可能會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)不利,但施用鈣含量高的堆肥可以改善土壤性能,因?yàn)镃a2+具有強(qiáng)的陽(yáng)離子交換能力,可以避免土壤pH呈強(qiáng)堿性,并且對(duì)鹽堿土而言,施用Ca2+含量高的添加劑或肥料可以顯著降低土壤中Na+含量,具有鹽土改良作用[11]。

堆肥中無(wú)機(jī)氮主要以銨態(tài)氮形式存在,銨態(tài)氮含量取決于溫度、pH和氨化細(xì)菌活性[24]。2個(gè)堆體中銨態(tài)氮含量總體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)(圖4)。在升溫期和高溫期,2個(gè)堆體銨態(tài)氮含量增加幅度均最大,含氮物質(zhì)被微生物迅速降解,氮素以銨態(tài)氮形式存在,銨態(tài)氮含量迅速升高。堆體1和堆體2中銨態(tài)氮含量上升率分別為63.4%和64.3%,而硝態(tài)氮在這期間保持較低水平。經(jīng)過(guò)高溫階段,pH值上升,銨態(tài)氮以氨氣形式大量損失導(dǎo)致其含量逐漸降低。隨著高溫期的結(jié)束,溫度下降,硝化菌活性逐漸增強(qiáng)[25],硝化作用使得銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮,同時(shí)堆料pH呈堿性加大氨氣揮發(fā)從而導(dǎo)致銨態(tài)氮含量下降。至堆肥20 d時(shí),堆體1銨態(tài)氮含量下降4.3%,堆體2則上升12.4%,可見添加5%過(guò)磷酸鈣比添加2.5%過(guò)磷酸鈣對(duì)銨態(tài)氮的保持更有利。初始堆料中未檢出硝態(tài)氮,堆肥7 d后,硝態(tài)氮開始出現(xiàn),并持續(xù)增加直至堆肥結(jié)束。該現(xiàn)象表明在堆肥前期高溫不利于硝化細(xì)菌的生長(zhǎng),各個(gè)堆體中硝態(tài)氮含量無(wú)明顯變化,降溫期溫度趨于適中(低于40 ℃),硝化細(xì)菌增殖使硝態(tài)氮含量明顯上升[26],最終,兩個(gè)堆體中硝態(tài)氮含量分別為0.29和0.33 mg·g-1。

根據(jù)表2中堆肥前后堆肥全氮含量、質(zhì)量以及含水率的變化計(jì)算可得堆體1氮損失為22.64%,堆體2氮損失為17.44%,可見,增加5%過(guò)磷酸鈣更有利于減少堆肥過(guò)程中的氮素?fù)p失。

表2 堆肥前后全氮和質(zhì)量變化

堆肥過(guò)程中無(wú)論磷的形態(tài)如何變化,其總量不變,且隨著有機(jī)質(zhì)的分解出現(xiàn)濃縮效應(yīng),全磷含量隨著反應(yīng)的進(jìn)行不斷升高(圖5)。過(guò)磷酸鈣添加量與堆體初始全磷含量呈正相關(guān),堆肥20 d時(shí),兩個(gè)堆體全磷含量分別增加26.9%和9.3%。堆肥初期有效磷主要來(lái)自過(guò)磷酸鈣中有效態(tài)無(wú)機(jī)磷,因而堆體2中有效磷初始含量高于堆體1,至堆肥結(jié)束時(shí)堆體1中有效磷含量較初期降低2.3%,堆體2有效磷含量降低18.3%。兩個(gè)堆體高溫期有效磷含量先降低隨后升高,降低原因可能是有效態(tài)磷與堆肥中金屬離子反應(yīng)生成難溶性化合物,使得有效磷含量顯著降低,添加的過(guò)磷酸鈣越多,該反應(yīng)則越劇烈,有效磷含量降低也越多。隨后有效磷含量升高是因?yàn)橐追纸庥袡C(jī)物轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿佑袡C(jī)酸,活化了過(guò)磷酸鈣中部分礦物態(tài)無(wú)機(jī)磷,使得堆肥中有效磷活性升高。李帆等[27]通過(guò)設(shè)置不同的過(guò)磷酸鈣添加量來(lái)探究其對(duì)堆肥過(guò)程中磷形態(tài)變化的影響,發(fā)現(xiàn)豬糞堆肥過(guò)程降低了磷的有效性,使其向不易于被植物直接吸收利用的形態(tài)轉(zhuǎn)化,筆者試驗(yàn)中堆肥有效磷含量占全磷比例逐漸降低與該結(jié)論相符合。堆肥中磷的有效性降低,從另一個(gè)角度表明速效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為緩效態(tài),降低了其堆放或施入土壤后遷移流失的風(fēng)險(xiǎn)。

GI可反映植物生長(zhǎng)抑制物質(zhì)的降解情況。隨著堆肥的進(jìn)行,兩個(gè)堆體C/N比值呈下降趨勢(shì),而GI則逐漸上升(圖6)。

圖6 堆肥過(guò)程中C/N比值和種子發(fā)芽指數(shù)(GI)變化

高溫期堆體2微生物群落豐度和多樣性更高,促進(jìn)對(duì)物料有機(jī)物的分解,C/N比值下降速率更快。至堆肥結(jié)束時(shí),堆體2的C/N比值為11.91,低于堆體1(C/N比值為14.67),均達(dá)到一般腐熟堆肥的C/N比值范圍[28]。隨著堆肥過(guò)程的進(jìn)行,GI逐漸上升,意味著生物毒性漸漸下降。堆肥初始狀態(tài)GI小于50%,7 d后GI仍小于70%,種子發(fā)芽受到抑制作用。堆肥8 d左右,堆體2的GI超過(guò)70%,表明堆肥初步腐熟,而10 d時(shí)堆體1的GI才超過(guò)70%。至19 d時(shí),2個(gè)處理GI均超過(guò)100%。C/N值和GI均表明堆肥已經(jīng)達(dá)到完全腐熟。

2.2 過(guò)磷酸鈣對(duì)堆體微生物群落的影響

2.2.1微生物群落豐度和多樣性

圖1顯示,堆肥0～2、2～7和8～20 d分別為堆肥升溫期、高溫期和降溫腐熟期,采集2個(gè)堆體堆肥1、4、7、10、13、16和19 d時(shí)共14個(gè)堆肥樣品(堆體1:樣品SRS1.1～SRS1.7;堆體2:樣品SRS2.1～SRS2.7)進(jìn)行高通量測(cè)序,以進(jìn)一步闡明過(guò)磷酸鈣添加量對(duì)太陽(yáng)能輔助好氧堆肥中微生物群落的影響。Chao1和Ace數(shù)值越大,意味著細(xì)菌群落豐度越高,Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小表明細(xì)菌群落多樣性越高[29]。表3表明堆體2微生物群落豐度明顯大于堆體1,堆體2微生物群落多樣性總體大于堆體1,可見較高的過(guò)磷酸鈣添加量提高了微生物群落豐度和多樣性。隨著堆肥發(fā)酵,同一堆體中微生物豐度和多樣性呈先升高后降低再升高趨勢(shì)。高溫期微生物豐度和多樣性有所提升,降溫腐熟期微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化,導(dǎo)致豐度和多樣性降低。

表3 堆肥過(guò)程中微生物群落豐度與多樣性指數(shù)

2.2.2微生物群落的NMDS分析

無(wú)度量多維標(biāo)定法(NMDS)統(tǒng)計(jì)是一種排序方法,通常應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究。圖7中每個(gè)點(diǎn)表示1個(gè)樣品,點(diǎn)間距離表示差異程度。脅迫系數(shù)(stress)可用來(lái)分析結(jié)果的優(yōu)劣,stress小于0.2,表明樣品間差異程度較明顯[30]。

圖7 NMDS分析圖

如圖7所示,stress值為0.077,說(shuō)明樣品間差異明顯。同組不同時(shí)期樣本相距較遠(yuǎn),尤其是升溫期與高溫期和降溫腐熟期在不同象限,表明堆肥各階段微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。不同組相同時(shí)期的樣本也相距較遠(yuǎn),表明不同過(guò)磷酸鈣添加量也會(huì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。

2.2.3堆肥過(guò)程中微生物群落的演替

微生物群落在不同堆體的不同階段均表現(xiàn)出明顯變化。微生物群落在門分類水平上的分布見圖8。優(yōu)勢(shì)菌群包括厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria),在木質(zhì)纖維素分解、有機(jī)質(zhì)礦化和堆肥中碳氮循環(huán)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,其中,厚壁菌門是多糖水解和纖維素降解的重要貢獻(xiàn)者,相對(duì)豐度之和約占總量的90%以上[31]。在升溫期和高溫期,堆體2中厚壁菌門豐度為51.4%～92.6%,明顯高于堆體1中豐度(30.6%～61.1%)。高溫期堆體2有機(jī)質(zhì)分解速度也更快,表明厚壁菌門豐度和熱量釋放之間存在耦合[32]。變形菌門和擬桿菌門能夠促進(jìn)丁酸、丙酸和葡萄糖等小分子的降解[33]。2個(gè)堆體中擬桿菌門豐度在升溫期和高溫期迅速增加,在降溫腐熟期逐漸減少,隨后趨于穩(wěn)定。在進(jìn)入降溫腐熟期之前擬桿菌門豐度變化不大,在降溫腐熟期有所升高,總體變化在2%～35%之間。在降溫腐熟期擬桿菌門豐度高于高溫期,證實(shí)其對(duì)高溫的抵抗力缺乏[34]。低豐度的門包括浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)。可見,增加過(guò)磷酸鈣添加量對(duì)厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門的影響較為顯著,添加5%過(guò)磷酸鈣可以增加微生物豐度,加速有機(jī)質(zhì)分解,使得堆體2的C/N比值低于堆體1,促進(jìn)堆體的腐熟。

圖9顯示2個(gè)堆體不同階段屬水平微生物組成和相對(duì)豐度。2個(gè)堆體中微生物群落結(jié)構(gòu)相似,但因過(guò)磷酸鈣添加量不同而在豐度上有明顯差異。堆肥系統(tǒng)中最豐富的幾個(gè)屬分別為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和根瘤菌屬(Chelativorans)。葡萄球菌屬中大部分為松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri),其在畜牧養(yǎng)殖中被視為機(jī)會(huì)性致病菌,在2個(gè)堆體中該菌屬豐度至腐熟期均降為0。假黃色單胞菌屬主要由臺(tái)灣假黃單胞菌(Pseudoxanthomonastaiwanensis)構(gòu)成,具有反硝化作用,在堆體2中其豐度低于堆體1。芽孢桿菌屬和根瘤菌屬在固氮方面很有效[35],對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[36]。堆體2中芽孢桿菌屬豐度遠(yuǎn)大于堆體1。黃桿菌屬是典型的反硝化細(xì)菌,極小單胞菌屬(Pusillimonas)能夠促進(jìn)反硝化作用[6]。在堆肥過(guò)程中黃桿菌屬豐度呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì),堆體1中其豐度在高溫期末達(dá)到31.59%,而堆體2其豐度在腐熟期達(dá)到峰值3.49%。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,德庫(kù)菌屬(Desemzia)豐度趨于0。在高溫期和降溫腐熟期堆體2中氨桿菌(Ammonibacillus)豐度明顯高于堆體1,氨桿菌是一種嗜熱細(xì)菌,需要消耗NH4+-N作為氮源,不利用硝酸鹽和亞硝酸鹽[37],也就是說(shuō),氨桿菌數(shù)量的增加與對(duì)NH4+-N利用程度的提高有關(guān)[38]。綜上,過(guò)磷酸鈣的添加更有利于抑制假黃色單胞菌屬、極小單胞菌屬、黃桿菌屬等反硝化菌的生長(zhǎng),促進(jìn)具有氮素保持作用的芽孢桿菌屬和根瘤菌屬的生長(zhǎng),使得堆體2的氮素保持效果更好。

圖10顯示不同堆肥階段2個(gè)堆體中種水平微生物的組成和相對(duì)豐度,2個(gè)堆體中優(yōu)勢(shì)菌種大致相同。在升溫期優(yōu)勢(shì)菌種為松鼠葡萄球菌,其在畜牧養(yǎng)殖中被視為機(jī)會(huì)性致病菌,陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)和鉛黃腸球菌(Enterococcuscasseliflavus)也是致病菌,至腐熟期致病菌豐度趨于0。在高溫期和降溫腐熟期優(yōu)勢(shì)菌種均為臺(tái)灣假黃單胞菌和熱酸芽孢桿菌(Bacillusthermolactis)。臺(tái)灣假黃單胞菌好氧、嗜熱,參與反硝化反應(yīng)過(guò)程,僅還原亞硝酸鹽產(chǎn)生N2O,50 ℃時(shí)或在好氧和微氧條件下具有更高的反硝化活性[39]。在高溫期堆體2中該菌種豐度遠(yuǎn)小于堆體1,產(chǎn)生的N2O更少,氮素?fù)p失更少。熱酸芽孢桿菌具有固氮能力,中度嗜熱,兼性厭氧,其在堆體2中豐度明顯高于堆體1。胺芽胞桿菌(Ammoniibacillusagariperforans)需要銨作為氮源,而不利用硝酸鹽和亞硝酸鹽[37],在高溫期和降溫腐熟期堆體2中其豐度明顯高于堆體1。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)具有固氮能力[35],對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[36],在降溫腐熟期堆體2中該菌種豐度更高。地獄芽孢桿菌(Bacillusinfernus)嚴(yán)格厭氧[40],堆體2中其豐度激增,表明在升溫期和高溫期翻堆和空氣的供應(yīng)仍有待提高。通過(guò)觀察堆肥過(guò)程中微生物群落組成可以發(fā)現(xiàn),隨著堆肥的進(jìn)程致病菌數(shù)量趨于0,提高過(guò)磷酸鈣添加量有利于提高具有氮素保持效果的菌種豐度,抑制臺(tái)灣假黃單胞菌等反硝化菌的生長(zhǎng),因而堆體2對(duì)氮素保持效果更好。

圖10 堆肥過(guò)程中在種水平上的微生物群落組成

2.2.4微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性

選擇35個(gè)細(xì)菌菌種進(jìn)一步探討堆肥過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子(溫度T、pH、含水率MC、有機(jī)質(zhì)OM、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、GI)的相關(guān)性,并作Spearman相關(guān)熱圖(圖11)。松鼠葡萄球菌、陰溝腸桿菌、鉛黃腸球菌、金黃桿菌(ChryseobacteriumspA5)、臺(tái)灣假單胞菌(Pseudomonasformosensis)和融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)豐度與T、MC和OM之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),甚至有的呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),而與硝態(tài)氮和GI呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。松鼠葡萄球菌、陰溝腸桿菌、鉛黃腸球菌和金黃桿菌都是致病菌,其隨著堆肥的進(jìn)行和含水率、有機(jī)質(zhì)含量的降低而消失。隨著致病菌的消失GI得以提升,因而其與GI呈負(fù)相關(guān)。臺(tái)灣假單胞菌是反硝化菌,在堆肥后期NO3-含量顯著上升,過(guò)磷酸鈣中PO43-也會(huì)抑制反硝化反應(yīng)[11],因而其豐度與硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論

(1)2個(gè)堆體GI均大于100%,C/N比值也達(dá)到腐熟要求。2個(gè)堆體高溫期均持續(xù)6 d,堆體2含水率和有機(jī)質(zhì)含量下降速率均快于堆體1,可見堆體2微生物活性更高。種水平微生物群落變化表明,在高溫期病原微生物豐度迅速下降,到堆肥20 d時(shí),病原微生物豐度趨于0。到堆肥20 d時(shí),全磷含量分別增加26.9%和9.3%,隨著過(guò)磷酸鈣添加量的增加,有效磷含量有所降低,分別降低2.3%和18.3%。2個(gè)堆體氮損失分別為22.64%和17.44%,可見堆體2氮素保持效果更好,添加5%過(guò)磷酸鈣有更好的保氮效果。

(2)結(jié)合微生物群落變化可以發(fā)現(xiàn),添加過(guò)磷酸鈣引起的pH降低并未抑制微生物活性,在堆體2的pH更低的情況下,堆體2微生物群落豐度和多樣性更高。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,總體豐度和多樣性呈先升高后降低再升高趨勢(shì),不同階段微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯變化,添加5%過(guò)磷酸鈣的堆體2微生物豐度和多樣性更高,有機(jī)質(zhì)含量降解較多。

(3)厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門豐度會(huì)隨著過(guò)磷酸鈣添加量的增加而變化,加速有機(jī)質(zhì)分解。添加5%過(guò)磷酸鈣更有利于抑制反硝化菌種的生長(zhǎng),促進(jìn)芽孢桿菌屬和根瘤菌屬的生長(zhǎng),因而堆體2的氮素保持效果更好。致病菌隨著堆肥的進(jìn)行和含水率、有機(jī)質(zhì)含量的降低而消失,GI隨之升高,因而其豐度與T、MC和OM之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系,而與硝態(tài)氮含量和GI呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。反硝化菌臺(tái)灣假單胞菌豐度則與硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)。