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      毫針?biāo)俅谭?lián)合頸舒顆粒治療氣滯血瘀型頸性眩暈的效果

      2023-10-08 10:11:12馬小閔張春嬌孫敦坡尚國超黃謙
      實用醫(yī)學(xué)雜志 2023年16期
      關(guān)鍵詞:毫針頸性椎動脈

      馬小閔 張春嬌 孫敦坡 尚國超 黃謙

      南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院1針灸科,2檢驗科,3耳鼻喉科(江蘇連云港 222000)

      頸性眩暈是臨床常見的一種眩暈類型,主要因頸椎骨質(zhì)退行改變,椎動脈受到刺激或壓迫后血液流變性改變,使大腦供血不足而致,臨床多表現(xiàn)為眩暈、視物旋轉(zhuǎn)、步態(tài)不穩(wěn),嚴(yán)重者可出現(xiàn)耳鳴、無法睜眼、惡心、頭痛、嘔吐等癥狀[1-2]。近年隨著生活、工作方式的變化(長期使用電腦、電視、手機等),頸性眩暈發(fā)病率明顯升高,頸性眩暈發(fā)病率在3.8%~17.6%,約50%頸椎病患者有眩暈癥狀,且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢[3]。目前西醫(yī)針對頸性眩暈主要采取對癥治療、延緩病情的治療方針,臨床多使用緩解血管痙攣藥物、手術(shù)等方法治療,但存在無法徹底根治、長期療效不理想、副作用大、風(fēng)險高等問題[4]。近年來中醫(yī)在頸性眩暈治療方面取得一定效果[5-6]。中醫(yī)學(xué)將頸性眩暈歸屬于“頸痹”、“眩暈”范疇,氣滯血瘀是頸性眩暈中醫(yī)診斷分型中較為常見的一種證型,肝腎虧虛、氣血不足是該病發(fā)生的內(nèi)在原因,外邪入侵、勞損、外傷是該病的主要誘因,治療應(yīng)以行氣活血、通經(jīng)止痛為主要原則[7]。中醫(yī)治療頸性眩暈具有經(jīng)濟、創(chuàng)傷小、起效快及無毒副作用等優(yōu)點,越來越被患者所接受。頸舒顆粒是臨床常用的中成藥制劑,具有活血化瘀、溫經(jīng)通竅止痛之功,在治療頸性眩暈方面具有一定功效,但其單藥臨床療效有限[8]。相關(guān)研究[9]指出頸部纖維結(jié)構(gòu)炎癥反應(yīng)可刺激頸交感神經(jīng),促使椎基底動脈收縮、供血不足,繼而誘發(fā)眩暈。針刺療法作為中國歷史悠久的傳統(tǒng)療法,可疏通經(jīng)脈、調(diào)暢氣血、鎮(zhèn)靜安神,且副作用小、患者耐受性良好?;陬i性眩暈證型、病機,筆者認(rèn)為毫針?biāo)俅谭?lián)合頸舒顆粒治療氣滯血瘀型頸性眩暈可獲取滿意效果,但目前尚缺乏有關(guān)報道,本研究特針對該問題開展研究,以便為臨床治療氣滯血瘀型頸性眩暈提供更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

      1 資料與方法

      1.1 一般資料選取2019年11月至2022年8月南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院收治的106 例氣滯血瘀型頸性眩暈患者為研究對象,以隨機數(shù)字表法分觀察組、對照組,每組各53 例。兩組臨床資料對比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)(編號:2019-35),患者及家屬知情并同意配合本研究。

      表1 兩組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups ±s

      表1 兩組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups ±s

      組別例數(shù)女年齡(歲)病程(年)對照組觀察組t/χ2值P值53 53性別(例)男23 25 0.152 0.696 30 28 57.2 ± 7.9 56.1 ± 7.7 0.726 0.470體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)23.19 ± 1.86 23.37 ± 1.77 0.510 0.611 4.89 ± 0.91 4.96 ± 0.85 0.409 0.683

      1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

      1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《眩暈診治多學(xué)科專家共識》[10]中頸性眩暈診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)眩暈/頭暈;(2)頸部疼痛不適,有壓點痛;(3)頭頸部活動后癥狀加重(或旋頸試驗陽性);(4)影像學(xué)檢查顯示頸椎退行性改變、椎基底供血不足;(5)排除前庭神經(jīng)炎、顱腦疾病等其他原因?qū)е碌难灐?/p>

      1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南·中醫(yī)病證部分》[11]中診斷標(biāo)準(zhǔn):辨證氣滯血瘀型;主癥:頭暈?zāi)垦?,視物旋轉(zhuǎn);次癥:頸項活動不利伴壓痛、惡心嘔吐、眼球震顫、耳鳴耳聾,視物模糊;舌脈:舌質(zhì)黯紫,可伴瘀斑、瘀點,舌苔薄白或薄黃,脈弦緊或弦澀;主癥必備,次癥≥ 2 項即可診斷。

      1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)(1)年齡> 18 歲;(2)認(rèn)知及醫(yī)患溝通正常、具有自主行為能力;(3)近1 個月內(nèi)未系統(tǒng)性治療;(4)患者及家屬對本研究知情同意,已簽署同意書。符合上述所有標(biāo)準(zhǔn)的病例納入本研究。

      1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)(1)其他原因?qū)е碌难灒唬?)伴顱內(nèi)病變、惡性腫瘤、傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾病;(3)重要臟器功能嚴(yán)重障礙;(4)頸椎有手術(shù)、骨折、脫位史及頸椎解剖結(jié)構(gòu)先天異常;(5)伴嚴(yán)重肢體功能障礙;(6)伴神經(jīng)根型、脊髓型頸椎病及急性感染;(7)有不良嗜好(酗酒、吸毒等);(8)處于妊娠期或哺乳期;(9)自然失訪、無法配合完成本研究者。

      1.5 治療方法兩組均給予常規(guī)對癥治療,包括臥床休息、減少體位變化、避免不良聲/光刺激。對照組在常規(guī)治療措施上服用頸舒顆粒(國藥準(zhǔn)字Z20010153,安徽精方藥業(yè)股份有限公司),溫開水沖服,每次6 g,每天3 次。觀察組在對照組基礎(chǔ)上給予毫針?biāo)俅谭ㄖ委煟喝“贂?、頭維、風(fēng)池、天柱、頸夾脊、頸百勞、大椎、肩井、肩中俞、肩外俞、供血穴,常規(guī)酒精消毒,使用一次性無菌針灸針(0.4 mm×60 mm,華佗牌蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),右手捏住針柄下段,左手拇指、食指用無菌棉球捏住針體下段,針尖接觸皮膚穴位時雙手同時用力以直刺或斜刺形式快速進針,以1~2 mm 幅度進行提插手法刺激,足量刺激后立即快速出針、止血,全程刺激時間在2 min 內(nèi),毫針?biāo)俅? d一次。兩組均持續(xù)治療8 周后評價效果。

      1.6 觀察指標(biāo)

      1.6.1 中醫(yī)證候評分評估患者治療前后中醫(yī)證候評分,主癥2 項,每項0~6 分(輕、中、重分別為2、4、6 分);次癥5 項,每項0~3 分(輕、中、重分別為1、2、3 分);分?jǐn)?shù)越高表示病情越嚴(yán)重。

      1.6.2 眩暈改善情況患者治療前后采用眩暈殘障程度評定量表(dizziness handicap inventory,DHI)[12]評估眩暈情況,DHI 量表包括軀體、情緒和功能3 個維度,總分0~100 分,總分?jǐn)?shù)越高表示眩暈障礙越嚴(yán)重。

      1.6.3 臨床療效參照《中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[13]中眩暈療效標(biāo)準(zhǔn)評價治療效果:(1)治愈:治療后頭暈?zāi)垦!⒁曃镄D(zhuǎn)等癥狀消失,中醫(yī)證候評分降低≥ 90%,影像學(xué)檢查顯示椎基底動脈供血恢復(fù)正常;(2)顯效:治療后頭暈?zāi)垦!⒁曃镄D(zhuǎn)等癥狀基本消失,中醫(yī)證候評分降低≥ 70%且< 90%,椎基底動脈供血基本恢復(fù)正常;(3)有效:治療后頭暈?zāi)垦?、視物旋轉(zhuǎn)等癥狀減輕,中醫(yī)證候評分降低≥ 30%且< 70%,椎基底動脈供血改善但仍供血不足;(4)無效;治療后頭暈?zāi)垦!⒁曃镄D(zhuǎn)等癥狀無明顯減輕或加重,中醫(yī)證候評分降低< 30%,椎基底動脈供血未改善。總有效率=(治愈+顯效+有效)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

      1.6.4 外周血炎癥因子情況患者治療前后采集空腹靜脈血液,離心分離收集血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、C 反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP),試劑盒購自四川省邁克科技有限責(zé)任公司。

      1.6.5 血管舒縮因子變化情況患者治療前后采集空腹靜脈血液,離心分離收集血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),采用硝酸鹽還原酶法測定血清一氧化氮(nitric oxide,NO),試劑盒購自四川省邁克科技有限責(zé)任公司。

      1.6.6 椎基底動脈血流動力學(xué)改善情況患者治療前后,采用經(jīng)顱彩色多普勒超聲(Multi-Dop x 型,德國DWL 公司)檢測椎基底動脈收縮期最大血流速度,包括左側(cè)椎動脈、右側(cè)椎動脈、基底動脈。

      1.6.7 安全性統(tǒng)計治療期間出血、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)發(fā)生情況。

      1.7 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件,正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較采用獨立樣本t檢驗或配對樣本t檢驗;計數(shù)資料以構(gòu)成比或率(%)表示,比較做χ2檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 兩組治療前后中醫(yī)證候評分比較兩組治療前的主癥、次癥中醫(yī)證候評分對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),兩組治療后的主癥、次癥中醫(yī)證候評分均低于治療前(P< 0.05),觀察組治療后的主癥、次癥中醫(yī)證候評分均低于對照組(P< 0.05),見表2。

      表2 兩組治療前后中醫(yī)證候評分結(jié)果Tab.2 TCM syndrome scores before and after treatment of the two groups±s,分

      表2 兩組治療前后中醫(yī)證候評分結(jié)果Tab.2 TCM syndrome scores before and after treatment of the two groups±s,分

      注:與治療前比較,aP < 0.05

      組別例數(shù)對照組觀察組t值P值治療后6.08 ± 1.13a 5.51 ± 0.92a 2.848 0.005 53 53主癥治療前7.27 ± 1.23 7.53 ± 1.19 1.106 0.271治療后2.95 ± 0.41a 2.58 ± 0.39a 4.760 0.000次癥治療前10.36 ± 1.67 10.44 ± 1.71 0.244 0.808

      2.2 眩暈改善情況兩組治療前DHI 評分、ESCV評分對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),兩組治療后的DHI 評分均低于治療前(P< 0.05),觀察組治療后的DHI 評分低于對照組(P< 0.05),見表3。

      表3 兩組眩暈改善情況的比較Tab.3 Comparison of vertigo improvement between the two groups±s,分

      表3 兩組眩暈改善情況的比較Tab.3 Comparison of vertigo improvement between the two groups±s,分

      注:與治療前比較,aP < 0.05

      組別例數(shù)DHI評分治療前51.28 ± 6.38 50.04 ± 5.97 1.033 0.304對照組觀察組t值P值治療后22.01 ± 4.07a 19.83 ± 3.82a 2.843 0.005 53 53

      2.3 臨床療效觀察組總有效率高于對照組(P< 0.05),見表4。

      表4 兩組臨床療效Tab.4 Comparison of clinical efficacy between the two groups例(%)

      2.4 外周血炎癥因子情況兩組治療前TNF-α、IL-6、CRP 對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),兩組治療后TNF-α、IL-6、CRP均低于治療前(P< 0.05);觀察組治療后的TNF-α、IL-6、CRP 均低于對照組(P< 0.05),見表5。

      表5 兩組治療前后外周血炎癥因子變化結(jié)果Tab.5 Changes of peripheral blood inflammatory factors before and after treatment between the two groups ±s

      表5 兩組治療前后外周血炎癥因子變化結(jié)果Tab.5 Changes of peripheral blood inflammatory factors before and after treatment between the two groups ±s

      注:與治療前比較,aP < 0.05

      組別例數(shù)TNF-α(pg/mL)治療前98.54 ± 13.15 96.38 ± 12.97 0.851 0.397治療后41.12 ± 7.02a 36.97 ± 6.31a 3.201 0.002 IL-6(pg/mL)治療前41.35 ± 6.62 40.72 ± 6.49 0.495 0.622治療后22.04 ± 3.35a 19.98 ± 3.06a 3.305 0.001對照組觀察組t值P值治療后9.04 ± 1.65a 7.93 ± 1.32a 3.824 0.000 53 53 CRP(mg/L)治療前18.24 ± 3.12 17.32 ± 2.83 1.590 0.115

      2.5 血管舒縮因子變化情況兩組治療前的ET-1、5-HT、NO 對比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),兩組治療后的ET-1、5-HT 均低于治療前,NO 均高于治療前(P< 0.05),觀察組治療后的ET-1、5-HT 均低于對照組,NO高于對照組(P< 0.05),見表6。

      表6 兩組治療前后血管舒縮因子變化結(jié)果Tab.6 Changes of vasomotor factors before and after treatment in the two groups ±s

      表6 兩組治療前后血管舒縮因子變化結(jié)果Tab.6 Changes of vasomotor factors before and after treatment in the two groups ±s

      注:與治療前比較,aP < 0.05

      組別例數(shù)ET-1(ng/L)治療前130.21 ± 18.35 128.16 ± 19.14 0.563 0.575治療后108.03 ± 13.46a 102.95 ± 11.34a 2.101 0.038 5-HT(μg/L)治療前50.49 ± 6.38 49.27 ± 6.14 1.003 0.318治療后45.13 ± 5.02a 42.06 ± 4.73a 3.240 0.002對照組觀察組t值P值治療后36.13 ± 5.87a 39.27 ± 6.04a 2.714 0.008 53 53 NO(μmol/L)治療前32.24 ± 4.72 33.02 ± 4.56 0.865 0.389

      2.6 椎基底動脈血流動力學(xué)改善情況兩組治療前左側(cè)椎動脈、右側(cè)椎動脈、基底動脈血流速度對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),兩組治療后左側(cè)椎動脈、右側(cè)椎動脈、基底動脈血流速度均高于治療前(P< 0.05),觀察組治療后左側(cè)椎動脈、右側(cè)椎動脈、基底動脈血流速度均高于對照組(P<0.05),見表7。

      表7 兩組治療前后椎基底動脈血流動力學(xué)變化結(jié)果Tab.7 Results of vertebrobasilar hemodynamics before and after treatment in the two groups±s,cm/s

      表7 兩組治療前后椎基底動脈血流動力學(xué)變化結(jié)果Tab.7 Results of vertebrobasilar hemodynamics before and after treatment in the two groups±s,cm/s

      注:與治療前比較,aP < 0.05

      組別例數(shù)左側(cè)椎動脈血流速度治療前38.24 ± 5.19 39.01 ± 5.23 0.761 0.448治療后45.67 ± 8.01a 49.25 ± 8.27a 2.264 0.026基底動脈血流速度治療前40.35 ± 7.28 41.31 ± 7.03 0.691 0.491 53 53對照組觀察組t值P值治療后44.32 ± 6.52a 46.99 ± 6.81a 2.062 0.042右側(cè)椎動脈血流速度治療前37.85 ± 5.22 37.19 ± 5.47 0.635 0.527治療后43.24 ± 7.03a 46.21 ± 6.94a 2.189 0.031

      2.7 兩組安全性兩組治療期間均未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。

      3 討論

      頸性眩暈的具體發(fā)病機制較為復(fù)雜,前庭系統(tǒng)迷路缺血、頸部軟組織損傷、頸部感覺神經(jīng)傳導(dǎo)紊亂、頸部交感神經(jīng)激惹紊亂等均與該病發(fā)生關(guān)系密切,此外前庭系統(tǒng)迷路對供血不足十分敏感,其短暫缺血是引發(fā)眩暈的又一重要因素[14-15]。椎動脈被軟組織或骨組織壓迫、牽拉可影響腦組織血供,頸部旋轉(zhuǎn)運動時則椎動脈代償不足,椎基底動脈血流速度減慢,機體可能出現(xiàn)前庭迷路缺血、血液循環(huán)障礙,進而誘發(fā)眩暈[16]。西醫(yī)對于頸性眩暈多采取對癥治療,雖然藥物或物理治療改善患者前庭功能以緩解癥狀,但無法徹底治愈。中醫(yī)講究辨證論治、標(biāo)本兼治,中醫(yī)治療包括針刺、推拿、內(nèi)服藥等,特別是針?biāo)幝?lián)合治療頸性眩暈具有多靶點、多方式、多途徑的優(yōu)勢,不僅可明顯緩解眩暈,還可對眩暈其他兼癥具有良好效果。

      中醫(yī)認(rèn)為針刺療法具有疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀、行氣止痛功效,針刺療法能夠以松至通,進而緩解頸部肌肉痙攣,改善椎基底動脈供血[17]。本研究顯示毫針?biāo)俅谭?lián)合頸舒顆粒治療氣滯血瘀型頸性眩暈可增強臨床療效。筆者認(rèn)為與以下原因有關(guān):從解剖結(jié)構(gòu)而言,供血穴深層包含動脈血管,毫針?biāo)俅坦┭軌蛑边_椎動脈,促使頸性眩暈患者椎動脈血管擴張,進而改善頸椎局部血液循環(huán),增大椎基底動脈的血流速度,使腦組織供血量增多,促進腦細(xì)胞功能恢復(fù),進而改善眩暈癥狀;中醫(yī)認(rèn)為頸性眩暈病位在腦,腦為髓海、督脈入絡(luò)于腦,因此毫針?biāo)俅處p頂之百會穴可清頭目、止眩暈;毫針?biāo)俅填^維穴可調(diào)節(jié)頭部氣機;毫針?biāo)俅田L(fēng)池、天柱穴能夠疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀,調(diào)暢患者頸項部氣血;毫針?biāo)俅填i夾脊、肩井、肩中俞、肩外俞穴可松解肩胛肌肉群,疏導(dǎo)頸項、肩胛部氣血;毫針?biāo)俅檀笞怠㈩i百勞、供血穴可舒筋活絡(luò)、活血化瘀、行氣止痛;以上諸穴相配,共奏止暈定眩之功。鄒婷等[18]研究指出,針刺供血穴能夠激發(fā)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng),改善神經(jīng)遞質(zhì)分泌及局部腦組織血流量,從而緩解眩暈癥狀。胡小梅等[19]研究指出,針刺頸夾脊穴可明顯提升椎動脈血流速度,進而改善椎動脈供血情況,進而緩解眩暈癥狀。郭輝等[20]研究指出,針刺風(fēng)池穴具有雙向調(diào)節(jié)椎基底動脈血流作用。觀察組治療后左側(cè)椎動脈、右側(cè)椎動脈、基底動脈血流速度均高于對照組,提示毫針?biāo)俅谭?lián)合頸舒顆粒治療氣滯血瘀型頸性眩暈可改善椎基底動脈血流動力學(xué),與觀察組療效更佳相互印證,也與毫針?biāo)俅谈纳苹颊咦祫用}供血相互印證。

      IL-6 是臨床常見炎癥因子,可通過介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能等途徑引發(fā)眩暈[21];頸椎局部血供不足可引發(fā)頸椎局部組織水腫及炎癥反應(yīng),CRP 過量分泌[22];TNF-α 能夠通過影響脂質(zhì)代謝、破壞血腦屏障等途徑引發(fā)眩暈[23]。本研究顯示毫針?biāo)俅谭?lián)合頸舒顆粒治療氣滯血瘀型頸性眩暈可抑制外周血炎癥因子合成,筆者認(rèn)為可能是因為毫針?biāo)俅袒颊哐ㄎ桓纳祁i椎局部血液循環(huán),有助于減輕患者頸椎局部組織水腫及炎癥,進而抑制炎癥因子合成、分泌。

      血管活性物質(zhì)失衡是導(dǎo)致眩暈的重要原因[24],5-HT 具有改善腦微循環(huán)、抑制腦血管痙攣、降低血液黏滯度等功效,可改善內(nèi)耳微循環(huán)及腦供血不足誘發(fā)的眩暈;ET-1 可促進腦血管收縮致腦組織缺血缺氧,使頸性眩暈患者出現(xiàn)頭暈癥狀,此外ET-1 也可增強5-HT 的收縮血管功效;NO 可通過促進環(huán)磷酸鳥苷表達,抑制鈣介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈磷酸化,起到舒張血管作用。本研究顯示觀察組治療后的ET-1、5-HT 均低于對照組,NO 高于對照組,提示毫針?biāo)俅谭?lián)合頸舒顆粒治療氣滯血瘀型頸性眩暈可改善血管收縮、舒張功能,進而改善椎動脈供血情況,增大患者腦血流量,以便達到治療眩暈的效果。KIM 等[25]研究指出,全血高切黏度、全血低切黏度越大,血液通過毛細(xì)血管所需的時間越長,血液流動速度也就越慢,最終可能導(dǎo)致血流停滯,可直接引發(fā)臟器的血液供應(yīng),進而可引發(fā)眩暈等一系列癥狀。

      綜上所述,毫針?biāo)俅谭?lián)合頸舒顆粒治療氣滯血瘀型頸性眩暈可增強臨床療效,抑制外周血血炎癥因子合成,改善血管舒縮因子、椎基底動脈血流動力學(xué),且安全性良好。本研究創(chuàng)新點在于筆者基于頸性眩暈證型、病機,采用毫針?biāo)俅谭ǎ⒙?lián)合頸舒顆粒治療氣滯血瘀型頸性眩暈獲取了滿意效果。受時間、精力、經(jīng)濟等方面限制,本研究仍存在不足之處,本研究局限為單中心研究,樣本量、隨訪時間有限,未觀察到復(fù)發(fā)情況,后續(xù)將進一步開展更多基礎(chǔ)與臨床研究探討毫針?biāo)俅谭ㄔ跉鉁鲂皖i性眩暈患者中的具體作用機制,并探討其長期療效。

      【Author contributions】MA Xiaomin performed the experiments and wrote the article.SUN Dunpo performed the experiments.MA Xiaomin,SHANG Guochao and ZHANG Chunjiao revised the article.HUANG Qian designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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