曹 嫄，李 宇，張克英，盧 通，韓東暉，李程彬，何偉翔，趙曉龍，徐志成，秦衛(wèi)軍，楊力軍(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院：門診部，泌尿外科，陜西 西安 7003)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)占所有惡性腫瘤的3%～5%，發(fā)病率居第16位，死亡率居第17位[1]。早期RCC患者主要以根治性手術治療為主且預后較好，而進展期RCC預后較差且缺乏有效的治療方法[2]。研究表明，RCC的進展與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關，且總體免疫細胞浸潤更豐富的患者預后更好[3]。然而，免疫細胞類型多樣，不同免疫細胞在腫瘤惡性進展中的作用存在差異[4]。闡明具體的免疫細胞類型與腫瘤預后的相關性，并進一步指導臨床決策意義重大。為此，本研究利用生物信息學方法，對檢索自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫的RCC數(shù)據(jù)進行免疫細胞浸潤量化和預后分析，以揭示免疫微環(huán)境與RCC惡性進展的相關性，為RCC預后預測和臨床決策提供可靠的評價指標。

1 對象與方法

1.1 對象

895例RCC患者基因表達數(shù)據(jù)和相應患者的臨床信息，檢索自TCGA數(shù)據(jù)庫，包括腎透明細胞癌、腎乳頭狀癌和腎嫌色細胞癌。臨床信息包括：生存時間、生存狀態(tài)、年齡、性別、病理分期、TNM分期等。通過Perl軟件將單個條目的TCGA數(shù)據(jù)整合成數(shù)據(jù)矩陣。利用R軟件的limma程序包將重復測量的基因數(shù)據(jù)取均值并替換，得到基因表達矩陣。

1.2 方法

1.2.1 基于CIBERSORT算法的免疫細胞量化 利用R軟件的CIBERSORT程序包和LM22特征基因表達矩陣，對上述RCC基因表達矩陣進行分析，量化得到每個患者腫瘤組織中22種免疫細胞的腫瘤浸潤分數(shù)。根據(jù)每種免疫細胞腫瘤浸潤分數(shù)的范圍，以中位數(shù)值作為截斷值，將患者分為該免疫細胞的高浸潤組和低浸潤組。將CIBERSORT算法循環(huán)運行100次以提高量化分析的準確性。以P<0.05為閾值，篩選量化合格的患者，繪制免疫細胞占比柱狀圖，并進行后續(xù)分析。根據(jù)上述分析策略，我們分別構建了3種分組策略：靜息樹突狀細胞高浸潤組(285人)和低浸潤組(286人)；靜息肥大細胞高浸潤組(286人)和低浸潤組(286人)；活化型CD4+記憶性T細胞高浸潤組(285人)和低浸潤組(284人)。

1.2.2 免疫細胞浸潤與RCC預后的相關性分析 利用R軟件基于患者ID號，將上述免疫細胞量化結果與臨床信息逐一匹配。利用R軟件的survival程序包分析不同類型的免疫細胞腫瘤浸潤程度與RCC患者生存時長的相關性，并通過Kaplan-Meier生存曲線進行可視化分析。

1.2.3 免疫細胞浸潤與RCC臨床特征的相關性分析 利用R軟件beeswarm程序包的Wilcoxon秩和檢驗，分析不同類型的免疫細胞腫瘤浸潤程度與RCC臨床特征，如病理分期、TNM分期等腫瘤惡性程度指標的相關性。利用R軟件的barplot函數(shù)繪制小提琴圖。

2 結果

2.1 樹突狀細胞、肥大細胞、活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤程度與患者生存相關

比較RCC組織中各類免疫細胞腫瘤浸潤程度較癌旁組織的差異發(fā)現(xiàn)，樹突狀細胞、肥大細胞、活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤程度顯著增高(圖1A)。進一步的生存分析結果提示，樹突狀細胞和肥大細胞的腫瘤浸潤程度與患者預后呈正相關(圖1B～C)，而活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤程度則與患者預后呈負相關(圖1D)。

A：腎透明細胞癌及正常樣本中各種免疫細胞占比的柱狀圖；B～D：分別為靜息樹突狀細胞、靜息肥大細胞、活化型CD4+記憶性T細胞構成水平的Kaplan-Meier生存曲線，3組生存曲線的P值均<0.05。圖1 靜息樹突狀細胞、靜息肥大細胞、活化型CD4+記憶性T細胞的浸潤程度與患者生存率相關

2.2 靜息樹突狀細胞的浸潤程度與腫瘤分期和分級均呈負相關

對靜息樹突狀細胞的腫瘤浸潤程度與RCC患者的臨床病理參數(shù)進行相關性分析，結果提示：臨床分期越高，靜息樹突狀細胞的腫瘤浸潤程度越低，即高浸潤靜息樹突狀細胞的RCC患者腫瘤主要為T1～T2期，而低浸潤主要為T3～T4期(圖2A)。與之相一致的，病理分級越高，靜息樹突狀細胞的腫瘤浸潤程度越低，即高浸潤的病理分級主要為Ⅰ和Ⅱ級，低浸潤主要為Ⅲ和Ⅳ級(圖2B)。

A：T1～T4期RCC患者的靜息樹突狀細胞的腫瘤浸潤量；B：Ⅰ～Ⅳ級RCC患者的靜息樹突狀細胞的腫瘤浸潤量。 aP<0.05。圖2 靜息樹突狀細胞的浸潤程度與腫瘤分期和分級均呈負相關

2.3 靜息肥大細胞的腫瘤浸潤程度與腫瘤分期和分級均呈負相關

對靜息肥大細胞的腫瘤浸潤程度與RCC患者的臨床病理參數(shù)進行相關性分析，結果提示：腫瘤分期和分級評分越高，靜息肥大細胞的腫瘤浸潤程度越低，即從G1到G4期靜息肥大細胞腫瘤浸潤量逐漸下降(P<0.05，圖3A)。與之相一致的，病理分級越高，靜息肥大細胞的腫瘤浸潤程度越低，即從Ⅰ級到Ⅳ級靜息肥大細胞腫瘤浸潤量逐漸下降(P<0.05，圖3B)。靜息肥大細胞的腫瘤浸潤量與T分期、M分期具有相同的負相關關系(P<0.05，圖3C～D)。

A：G1～G4期RCC患者的靜息肥大細胞的腫瘤浸潤量；B：Ⅰ～Ⅳ級RCC患者的靜息肥大細胞的腫瘤浸潤量；C：T1～T4期RCC患者的靜息肥大細胞的腫瘤浸潤量；D：M0～M1期RCC患者的靜息肥大細胞的腫瘤浸潤量。aP<0.05。圖3 靜息肥大細胞的浸潤程度與腫瘤分期和分級均呈負相關

2.4 活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤程度與腫瘤分期和分級均呈正相關

對活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤程度與RCC患者的臨床病理參數(shù)進行相關性分析，結果提示：腫瘤分期和分級評分越高，CD4+活化記憶T細胞腫瘤浸潤程度越高，即從G1到G4期活化型CD4+記憶性T細胞腫瘤浸潤量逐漸升高(圖4A)。與之相一致的，病理分級越高，活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤程度越高，即從Ⅰ級到Ⅳ級活化型CD4+記憶性T細胞腫瘤浸潤量逐漸升高(圖4B)?；罨虲D4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤量與TNM分期具有相同的正相關關系(圖4C～E)。

A：G1～G4期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤量；B：Ⅰ～Ⅳ期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤量；C：T1～T4期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤量；D：N0～N1期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤量；E：M0～M1期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤量。 aP<0.05。圖4 活化型CD4+記憶性T細胞的腫瘤浸潤程度與腫瘤分期和分級均呈正相關

3 討論

RCC是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，復發(fā)率和轉移率均較高且進展期預后較差[5]。為了在疾病早期篩選出腫瘤進展高風險的患者，需要找出具有臨床意義的預后指標，從而對于此類患者進行更好的監(jiān)測和管理。目前臨床常用的仍是基于患者的影像學資料進行臨床分期，根據(jù)術后病理檢查進行病理分級[6]。然而RCC患者的個體差異大，即使是同一腫瘤的內(nèi)部也表現(xiàn)出顯著的區(qū)域性差異，因此我們需要更多更精細化的預后指標來指導臨床工作[7]。

近年來，腫瘤免疫微環(huán)境的研究被廣泛展開，RCC的腫瘤免疫微環(huán)境與腫瘤進展密切相關[8]。本研究對腎細胞癌中免疫細胞的腫瘤浸潤特點進行了分析。結果顯示，樹突狀細胞、肥大細胞、活化的CD4+記憶性T細胞腫瘤浸潤量與RCC患者的預后和臨床分級分期具有相關性，且這三種免疫細胞在腎細胞癌的進展中發(fā)揮著完全不同的作用。腫瘤免疫微環(huán)境中的細胞串擾一直備受研究者的關注[9]，本研究不僅為RCC的早期篩查和風險評估提供參考，同時將為腎細胞腫瘤免疫微環(huán)境的研究提供新的思路。

樹突狀細胞主要發(fā)揮抗原呈遞的作用。在腫瘤微環(huán)境中，存在各種作用于樹突狀細胞的抑制性細胞因子，導致樹突狀細胞功能異常，進而使腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[10]。因此樹突狀細胞的免疫浸潤增多有助于人體獲得性免疫系統(tǒng)的激活，產(chǎn)生更強的抗腫瘤作用，這解釋了本研究關于高浸潤樹突狀細胞與預后呈正相關的發(fā)現(xiàn)。

肥大細胞是固有免疫細胞的重要組成部分[11]。研究表明瘤內(nèi)肥大細胞在非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)的癌巢基質細胞中占有優(yōu)勢，并與NSCLC患者生存率相關[12]。人體內(nèi)肥大細胞具有兩種表型，其中一種含有類胰蛋白酶，而另一種包含類胰蛋白酶及糜酶。類胰蛋白酶主要位于黏膜上皮及固有層中，而類胰蛋白酶及糜酶主要位于皮膚及結締組織中。瘤內(nèi)的此兩種表型對于NSCLC的生存率均有改善，提示肥大細胞能參與到抗腫瘤免疫過程中。肥大細胞可通過分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)促進T淋巴細胞增殖，而通過TNF促進生長的T淋巴細胞又可正反饋促進肥大細胞增殖，兩者共同發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，肥大細胞可通過脫顆粒釋放蛋白酶破壞腫瘤基質，腫瘤細胞外基質及細胞結構受到破壞，從而抑制腫瘤的生長浸潤[13]。

受到抗原刺激后，CD4+T細胞主要識別外源性抗原肽并分化為調(diào)節(jié)性T細胞[14]。本研究發(fā)現(xiàn)活化的CD4+記憶性T細胞所占比例隨著臨床分期的增加呈上升趨勢，表明隨著疾病進展，患者的免疫功能在不斷惡化，機體對腫瘤細胞的殺傷作用也在逐漸減弱。調(diào)節(jié)性T細胞在高分化、中分化和低分化患者中的表達水平有顯著差異，提示機體對低分化的腫瘤細胞殺傷作用弱，對高分化的腫瘤細胞殺傷作用強[15]。

本研究通過生物信息學分析方法，分析22種腫瘤浸潤淋巴細胞亞群與臨床的分級分期和預后具有重要關聯(lián)，這些關聯(lián)能夠幫助篩選出腫瘤進展高風險的RCC患者，并給予早期干預和臨床指導。3種與預后密切相關的免疫細胞，不僅提供診斷和預測價值，同時可能是良好的治療靶點。本研究進一步揭示構成腫瘤微環(huán)境的臨床和生物學意義，但是對于RCC的具體作用機制及臨床預后價值的探討仍需進一步研究證實。