夏方山, 王 勃, 陰禹舟, 李尹琳, 岑慧芳, 朱慧森

(山西農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院, 山西 太谷 030801)

硒是人類和動物身體健康不可或缺的微量元素,是人類和動物機體抗氧化和免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)發(fā)揮作用的重要活性成分,被稱為“抗癌之王”[1-2]。人類機體內(nèi)一旦硒缺乏就會誘導克山病、大骨節(jié)病、白肌病、不孕等一系列疾病的發(fā)生[3]。然而,硒在人類或動物體內(nèi)無法自主合成,必須從食物中獲取,致使土壤缺硒造成的人類健康問題是世界各國共同關注的一個公共衛(wèi)生焦點[1,4-5]。因此,如何科學生產(chǎn)富硒動植物產(chǎn)品,解決人體缺硒問題是當下食物安全研究的熱點領域之一[6-7]。研究發(fā)現(xiàn),適宜的硒處理不僅能促進小麥(Triticumaestivum)[8]、水稻(Oryzasativa)[9-10]、玉米(Zeamays)[11]、燕麥(Avenasativa)[12]等植物的生長發(fā)育,還能提高其硒含量、產(chǎn)量和品質(zhì),從而能夠為人類提供豐富的優(yōu)質(zhì)富硒食物來源。植物體內(nèi)抗氧化能力的提升是外源硒處理實現(xiàn)上述功能的重要原因,這已在玉米[11]、花生(Arachishypogaea)[13]、白術(Atractylodesmacrocephala)[14]、黃精(Polygonatumsibiricum)[15]、葡萄(Vitisvinifera)[16]及青花菜(Brassicaoleracea)[17]等多種植物中得到證實。然而,過度的硒處理也會導致植物發(fā)生劇烈的生理變化及物質(zhì)轉換,從而降低其產(chǎn)量[12,18]。所以,硒濃度、作用時間及處理方式就成為了決定富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)成敗的關鍵因素[19-20]。種子引發(fā)是一種控制濃度及作用時間最簡單、經(jīng)濟而有效的生物強化策略,其不僅能促進植物種子的萌發(fā)及其幼苗的生長發(fā)育,還能提高植物的逆境適應能力[21-22]。因此,硒引發(fā)已被廣泛用作富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的生物強化策略[4,23]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值豐富、適口性好、消化率高等優(yōu)良特點,成為享譽全球的“牧草之王”[24-25],是近年來“中央一號”文件和“糧改飼”等政策優(yōu)先發(fā)展的牧草資源[26]。牧草中硒含量不僅與草食動物飼養(yǎng)及畜群健康有密切關系,還會間接影響到人類的身體健康,因而富硒苜蓿草產(chǎn)品生產(chǎn)受到世界各國的共同關注[27]。適量施硒不僅能促進紫花苜蓿的生長發(fā)育,還可提高其飼草產(chǎn)量和品質(zhì),而過量施硒則相反[28-29]。目前,紫花苜蓿富硒策略研究已經(jīng)涉及土壤施肥[30]、葉面噴施[28]及種子引發(fā)[23,31]等多種形式。研究發(fā)現(xiàn),土壤基施和葉面噴施硒肥既可增加紫花苜蓿葉片的抗氧化能力,又可提高紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)[28-30]。硒引發(fā)也能提高紫花苜蓿種子的抗氧化能力[31],但其對不同品種紫花苜蓿種子抗氧化能力的影響存在差異[20],而且紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力對硒引發(fā)如何響應尚未見報道。因此,試驗以發(fā)芽第10 d的紫花苜蓿幼苗為材料,分析不同濃度亞硒酸鈉溶液引發(fā)不同時間后其幼苗抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化的變化規(guī)律,以期揭示硒濃度和引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的影響,為富硒紫花苜蓿產(chǎn)品的科學生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試紫花苜蓿品種為‘偏關苜蓿’,種子由山西農(nóng)業(yè)大學草類植物育種與種子科學實驗室于2018年10月在校內(nèi)試驗站收集,并密封保存于—20℃種子庫內(nèi)至2021年3月試驗進行。

1.2 硒引發(fā)處理

將飽滿均勻的紫花苜蓿種子分別置于濃度為0,0.5,1.0,2.0,4.0和8.0 mmol·L-1的亞硒酸鈉溶液中(亞硒酸鈉溶液濃度篩選參照參考文獻[31]),在20℃條件下浸泡0(CK),3,6,9和12 h后,用蒸餾水快速沖洗3遍,并用濾紙吸收種子表面水分后于25℃黑暗條件自然風干至含水量為10%(鮮重基礎)左右,于4℃條件下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 發(fā)芽試驗

發(fā)芽條件及發(fā)芽率的計算參照國際種子檢驗協(xié)會制定的種子檢驗規(guī)程(2019)[32]進行,隨機選取100粒引發(fā)后的種子,放入鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿并加入5 mL蒸餾水,于20℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,最終獲得試驗所需幼苗樣品。每個處理重復4次。

1.4 生理指標測定

粗酶液提取參照Kibiza等[33]的方法,發(fā)芽第10 d準確稱取0.1 g幼苗,冰浴研磨后上清液于4℃條件保存?zhèn)溆谩３趸锲缁?Superoxide dismutase,SOD)活性參照Rao等[34]的方法測定,過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性參照Aebi[35]的方法測定,抗壞血酸過氧化物酶(Aseorbate peroxidase,APX)活性參照Nakano等[36]的方法測定,谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)活性參照Madamanchi等[37]的方法測定,丙二醛(Maloddialdehyde,MDA)含量參照Bailly等[38]的方法測定,可溶性蛋白含量采用南京建成科技有限公司所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 22.0軟件對紫花苜蓿幼苗的各項指標數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,多重比較(P<0.05)則采用Duncan’s法進行,最終以平均值±標準誤方式表示結果。

2 結果與分析

2.1 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗SOD活性的影響

由表1可知,濃度為0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1時,紫花苜蓿幼苗的SOD活性隨引發(fā)時間的延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,均顯著高于CK(P<0.05),并在引發(fā)12 h時顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05);濃度為1.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時,紫花苜蓿幼苗SOD活性隨引發(fā)時間的延長呈先升高后下降的趨勢,濃度為1.0 mmol·L-1時引發(fā)9 h顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05),濃度為2.0 mmol·L-1時引發(fā)3 h和6 h顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05),濃度為4.0 mmol·L-1時引發(fā)3 h和6 h顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05),而引發(fā)12 h時顯著低于其他引發(fā)時間(P<0.05),濃度為8.0 mmol·L-1時引發(fā)3 h顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05),引發(fā)12 h時顯著低于其他引發(fā)時間(P<0.05)。相同引發(fā)時間下,紫花苜蓿幼苗SOD活性均隨濃度的增加呈先升高后下降的趨勢;引發(fā)3 h時,在濃度為1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05);引發(fā)6 h時,在濃度為1.0 mmol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05);引發(fā)9 h時,在濃度為0.5 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1時顯著高于濃度為0 mmol·L-1時(P<0.05),并在濃度為2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時顯著低于濃度為0 mmol·L-1時(P<0.05);引發(fā)12 h時,在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于試驗中所有處理時(P<0.05),而在濃度為8.0 mmol·L-1時低于試驗中所有處理時。

表1 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗SOD活性的影響

2.2 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗CAT活性的影響

由表2可知,濃度為0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1時,紫花苜蓿幼苗的CAT活性隨引發(fā)時間的延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,均顯著高于CK(P<0.05);濃度為1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1時,隨引發(fā)時間的延長呈先升高后下降的趨勢,濃度為1.0 mmol·L-1時引發(fā)9 h顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05),濃度為2.0 mmol·L-1時引發(fā)3 h顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05);濃度為4.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1時,紫花苜蓿幼苗CAT活性隨引發(fā)時間的延長而下降,均在引發(fā)12 h顯著低于其他引發(fā)時間(P<0.05)。相同引發(fā)時間下,紫花苜蓿幼苗CAT活性均隨濃度的增加呈先升高后下降的趨勢;引發(fā)3 h時,紫花苜蓿幼苗CAT活性在濃度為1.0 mmol·L-1時顯著高于0.5 mmol·L-1外的其他濃度(P<0.05);引發(fā)6 h和9 h時,在濃度為2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時顯著低于濃度為0 mmol·L-1時(P<0.05);引發(fā)12 h時,在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于試驗中所有處理時(P<0.05),而在濃度為8.0 mmol·L-1時顯著低于試驗中所有處理時(P<0.05)。

表2 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗CAT活性的影響

2.3 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗APX活性的影響

由表3可知,濃度為0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1時,紫花苜蓿幼苗的APX活性隨引發(fā)時間的延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,均顯著高于CK(P<0.05);濃度為1.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時,隨引發(fā)時間的延長呈先升高后下降的趨勢;濃度為1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1時均顯著高于CK(P<0.05),并分別在引發(fā)9 h和3 h時顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05);濃度為4.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1時引發(fā)3 h時最高,濃度為4.0 mmol·L-1時引發(fā)9 h和12 h顯著低于CK(P<0.05)。相同引發(fā)時間下,紫花苜蓿幼苗APX活性均隨濃度的增加呈先升高后下降的趨勢;引發(fā)3 h時,在濃度為1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05),但濃度為8.0 mmol·L-1時顯著低于濃度為0 mmol·L-1時(P<0.05);引發(fā)6 h和9 h時,在濃度為1.0 mmol·L-1時顯著高于濃度為0 mmol·L-1時(P<0.05),并在濃度為2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時顯著低于濃度為0 mmol·L-1時(P<0.05);引發(fā)12 h時,在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于試驗中所有處理時(P<0.05),而在濃度為8.0 mmol·L-1時顯著低于試驗中所有處理時(P<0.05)。

表3 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗APX活性的影響

2.4 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗GR活性的影響

由表4可知,濃度為0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1時,紫花苜蓿幼苗的GR活性隨引發(fā)時間的延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,除濃度為0 mmol·L-1引發(fā)3 h外均顯著高于CK(P<0.05);濃度為1.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時,隨引發(fā)時間的延長呈先升高后下降的趨勢;濃度為1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1時均顯著高于CK(P<0.05),濃度為1.0 mmol·L-1時在引發(fā)9 h時顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05),濃度為2.0 mmol·L-1時在引發(fā)3 h時顯著高于引發(fā)6 h外的其他時間(P<0.05);濃度為4.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1時均在引發(fā)3 h時最高,顯著高于CK(P<0.05)。相同引發(fā)時間下,紫花苜蓿幼苗GR活性均隨濃度的增加呈先升高后下降的趨勢;引發(fā)3 h時,在濃度為2.0 mmol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05);引發(fā)6 h時,在濃度為1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1時顯著高于其他濃度時(P<0.05),濃度為8.0 mmol·L-1時顯著低于濃度為0 mmol·L-1時(P<0.05);引發(fā)9 h時,在濃度為1.0 mmol·L-1時顯著高于其他濃度時(P<0.05),濃度為8.0 mmol·L-1時顯著低于濃度為0 mmol·L-1時(P<0.05);引發(fā)12 h時,在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于試驗中所有處理時(P<0.05),在濃度為2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時顯著低于濃度為0 mmol·L-1時(P<0.05),并在濃度為8.0 mmol·L-1時顯著低于試驗中所有處理時(P<0.05)。

表4 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗GR活性的影響

2.5 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗MDA含量的影響

由表5可知,濃度為0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1時,紫花苜蓿幼苗的MDA含量隨引發(fā)時間的延長呈先升高后降低的趨勢,濃度為0 mmol·L-1時,除引發(fā)3 h外均顯著高于CK(P<0.05),濃度為0.5 mmol·L-1時,除引發(fā)3 h外均顯著低于CK(P<0.05);濃度為1.0 mmol·L-1時,隨引發(fā)時間的延長呈先升高后下降再升高的趨勢,引發(fā)6 h和9 h時顯著低于其他引發(fā)時間(P<0.05),而引發(fā)12 h時顯著高于其他引發(fā)時間(P<0.05);濃度為2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時,隨引發(fā)時間的延長呈升高趨勢,均顯著高于CK(P<0.05)。相同引發(fā)時間下,引發(fā)3 h時,紫花苜蓿幼苗MDA含量均隨濃度的增加呈上升趨勢;引發(fā)6 h～12 h時,均隨濃度的增加呈先下降后升高的趨勢;引發(fā)6 h和9 h時,在濃度為0.5 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1時顯著低于其他濃度(P<0.05),在濃度為2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05);引發(fā)12 h時,在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著低于試驗中所有處理時(P<0.05),在濃度為1.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1時顯著高于濃度為0 mmol·L-1(P<0.05),并在濃度為8.0 mmol·L-1時顯著高于試驗中所有處理時(P<0.05)。

表5 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗MDA含量的影響

2.6 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗抗氧化性能的雙因素方差分析

雙因素方差分析表明(表6),不同硒濃度對紫花苜蓿幼苗SOD,APX,GR和MDA均有顯著影響(P<0.05),不同硒引發(fā)時間紫花苜蓿幼苗SOD,CAT,APX,GR和MDA均有顯著影響(P<0.05),而硒濃度和引發(fā)時間的交互作用則對SOD,CAT,APX,GR和MDA均有極顯著影響(P<0.01)。

表6 硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗抗氧化性能的雙因素方差分析

3 討論

硒是調(diào)控植物體內(nèi)抗氧化等代謝反應的重要微量元素,對于植物的逆境損傷修復和富硒生物強化具有重要作用[39],因而適宜的硒處理能促進植物種子的萌發(fā)及其幼苗生長[14-15]。外源硒濃度和引發(fā)時間是造成種子引發(fā)中出現(xiàn)雙重效應的關鍵因素,一般低濃度或短時間的引發(fā)處理產(chǎn)生促進作用,而高濃度或長時間引發(fā)則往往產(chǎn)生抑制作用[20,31]。研究發(fā)現(xiàn),外源硒引發(fā)對紫花苜蓿種子活力也具有雙重效應,低濃度(0.5 mmol·L-1)的硒引發(fā)促進了紫花苜蓿種子的萌發(fā),其中濃度為0.5 mmol·L-1引發(fā)12 h時其種子發(fā)芽率顯著高于CK(P<0.05),而高濃度則抑制其萌發(fā)[31]。本試驗中,硒濃度和引發(fā)時間的交互作用則對SOD,CAT,APX,GR和MDA均有極顯著影響(P<0.01),而且低濃度(0.5 mmol·L-1)的硒引發(fā)(3 h～12 h)提高了紫花苜蓿幼苗的SOD,CAT,APX和GR的活性,這是因為低濃度硒處理既提高了植物的抗氧化能力[4],又促進了種子內(nèi)蛋白質(zhì)及多糖等貯藏大分子物質(zhì)的分解[40],從而為其萌發(fā)過程中細胞分裂提供了充足的能量和物質(zhì)基礎。然而試驗發(fā)現(xiàn),紫花苜蓿幼苗的MDA含量在低濃度(0.5 mmol·L-1)引發(fā)時出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,這可能是因為低濃度硒引發(fā)使種子發(fā)生了一定程度的吸脹損傷,且初期抗氧化酶活性的升高尚不足以修復這種損傷,因而出現(xiàn)了MDA含量升高的現(xiàn)象[41],直到引發(fā)12 h時紫花苜蓿幼苗內(nèi)抗氧化酶活性的升高才能修復其吸脹損傷。

植物體內(nèi)抗氧化能力的下降造成了其細胞內(nèi)引起脂質(zhì)過氧化損傷的活性氧自由基(Reactive oxide species,ROS)含量升高,表現(xiàn)為其細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷的標志性產(chǎn)物MDA含量上升[42]。試驗中,高濃度(≥4.0 mmol·L-1)硒引發(fā)時間越長,紫花苜蓿幼苗內(nèi)的SOD,CAT,APX和GR活性越低,其MDA含量則越高,說明高濃度硒引發(fā)降低了紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力,進而導致其脂質(zhì)過氧化損傷加劇,這與硒引發(fā)對紫花苜蓿種子抗氧化性能的影響研究結論相似[20,31]。此外,這在外源硒處理對玉米[11]、花生[13]、白術[14]、黃精[15]及青花菜[17]等植物幼苗氧化酶活性的影響研究中也到了證實。這可能是因為低強度的外源硒處理通過調(diào)控植物細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的防御能力,及時地保持了其體內(nèi)ROS動態(tài)平衡,緩解了細胞膜系統(tǒng)的脂質(zhì)過氧化損傷,從而表現(xiàn)為其MDA的產(chǎn)生相對較少。過量的硒不僅誘導了引起細胞膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化損傷的ROS增多,還對種子內(nèi)所有需要硫的反應部位產(chǎn)生毒害[43-44],將植物體內(nèi)無機態(tài)的硒轉化成有機態(tài)的硒代半胱氨酸,并與非特異性蛋白質(zhì)結合而干擾其正常功能的發(fā)揮,最終使植物體內(nèi)的代謝平衡出現(xiàn)紊亂,從而影響了植物的生長發(fā)育[17,43]。本試驗中,硒濃度為0.5 mmol·L-1引發(fā)12 h時,紫花苜蓿幼苗細胞內(nèi)SOD,CAT,APX和GR活性均保持最高水平,而其MDA含量卻最低,因而這可能是紫花苜蓿草產(chǎn)品富硒生產(chǎn)的最佳處理。

4 結論

外源硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的影響與其濃度及引發(fā)時間均有密切關系。低濃度(≤1.0 mmol·L-1)的外源硒引發(fā)能提高紫花苜蓿幼苗的抗氧化性能,從而降低其脂質(zhì)過氧化損傷;高濃度長時間引發(fā)(≥4.0 mmol·L-1,12 h)時,紫花苜蓿幼苗的抗氧化性能下降,而其脂質(zhì)過氧化損傷加劇。濃度為0.5 mmol·L-1的亞硒酸鈉溶液引發(fā)12 h時是提高紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的最佳處理。