基于微流控技術(shù)的疾病標(biāo)志物即時(shí)檢測(cè)研究進(jìn)展

蔣汶君 唐曲 顧錫娟 冀海偉 吳麗 秦玉嶺

（南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 南通 226019）

隨著世界范圍內(nèi)的傳染病、腫瘤和慢性病等疾病的發(fā)病率和死亡率逐年增加，如何構(gòu)建能有效檢測(cè)和監(jiān)測(cè)這些疾病的方法一直是科學(xué)難題[1-2]。目前，疾病診斷的常用方法主要有病理學(xué)檢查、血液學(xué)檢測(cè)和影像學(xué)診斷等，這些檢查方法大多依賴(lài)昂貴的測(cè)試儀器和專(zhuān)業(yè)的操作技術(shù)人員[3]。為避免在檢測(cè)操作過(guò)程中的污染問(wèn)題，通常需要在特定環(huán)境中進(jìn)行。雖然依賴(lài)于組織取樣的病理分析手段具有較高的準(zhǔn)確性，但檢測(cè)結(jié)果的等待時(shí)間長(zhǎng)且為有創(chuàng)操作[4]。依賴(lài)于放射性檢驗(yàn)的技術(shù)對(duì)病人有潛在的輻射，有可能對(duì)患者造成二次傷害[5]。盡管依賴(lài)于血液檢查的液體活檢分析方法具有微創(chuàng)、快捷和易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但也存在技術(shù)復(fù)雜和設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)[6]。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)（Point-of-care testing，POCT）具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

微流控技術(shù)（Microfluidic technology）是一種可精確控制和操控微尺度流體的技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)分析處理全過(guò)程自動(dòng)化和高效化，因其具有檢測(cè)試劑消耗量少、靈敏度高和分析成本低等優(yōu)點(diǎn)[7]，近年來(lái)已成為POCT 領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并在諸多床旁檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。POCT 是指能夠在現(xiàn)場(chǎng)條件下實(shí)現(xiàn)的快速檢測(cè)。近十余年，基于微流控的POCT 設(shè)備發(fā)展迅速，在疾病診斷中顯示出巨大的應(yīng)用前景[8-9]，如已商業(yè)化的用于檢測(cè)妊娠的試紙條和艾滋病自測(cè)試紙等。目前已開(kāi)發(fā)出許多新型檢測(cè)方法，如電化學(xué)檢測(cè)、熒光檢測(cè)、比色檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)、表面等離子體共振檢測(cè)和磁性檢測(cè)等[10]。此外，隨著納米技術(shù)、微機(jī)電系統(tǒng)（Micro-electro-mechanical system，MEMS）技術(shù)和材料科學(xué)的發(fā)展，POCT 設(shè)備種類(lèi)日益增多，如芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-chip，LOC）設(shè)備[11]、盤(pán)上實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（Lab-on-a-disc,LOAD）[12]、微流體紙基設(shè)備（Microfluidic paper-based analytical devices，μPADs）[13]、側(cè)向流動(dòng)設(shè)備（Lateral flow devices）和等溫核酸擴(kuò)增設(shè)備（Isothermal nucleic acid amplification devices，INAA）[14]等，將這些設(shè)備與人工智能結(jié)合，促進(jìn)了基于微流控的POCT 設(shè)備朝著更便攜和更智能的方向發(fā)展。

新型冠狀病毒感染、猴痘病毒的出現(xiàn)凸顯了快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的重要性。傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法結(jié)果存在一定的滯后性，并且需要專(zhuān)業(yè)的操作人員，無(wú)法對(duì)樣本進(jìn)行“即時(shí)即地”分析。基于微流控的POCT設(shè)備已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傳染病或腫瘤檢測(cè)[15-18]，近年來(lái)該領(lǐng)域發(fā)展迅速，出現(xiàn)了大量創(chuàng)新性的研究工作。本文主要介紹了基于微流控的POCT 設(shè)備在傳染病、腫瘤和慢性病診斷應(yīng)用中的最新研究進(jìn)展，并對(duì)其在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 在傳染病診斷中的應(yīng)用

1.1 病毒檢測(cè)

1.1.1 新型冠狀病毒

新型冠狀病毒感染對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)，其中，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）具有高傳染性，早期誤診（假陰性）可導(dǎo)致快速社區(qū)傳播[19]。鑒于SARS-CoV-2 感染病例數(shù)量增加迅速、缺乏有效新型冠狀病毒感染疫苗和抗病毒治療方法[20]，陽(yáng)性感染者的快速篩查對(duì)于早發(fā)現(xiàn)和防止疫情進(jìn)一步擴(kuò)大具有重大意義，因此迫切需要研發(fā)一種快速、高通量和高靈敏檢測(cè)SARS-CoV-2 的現(xiàn)場(chǎng)方法。Lin 等[21]設(shè)計(jì)了一種集熒光檢測(cè)分析儀和SARSCoV-2 微芯片于一體的可用于檢測(cè)3 種生物標(biāo)志物（IgG、IgM 和抗原）的微流控免疫檢測(cè)平臺(tái)（圖1A）。該平臺(tái)利用抗體捕獲樣品中的生物標(biāo)志物，形成抗原抗體復(fù)合物，并在毛細(xì)作用下遷移，可與熒光區(qū)被標(biāo)記的二抗進(jìn)行特異結(jié)合，在15 min 內(nèi)根據(jù)芯片內(nèi)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度對(duì)SARS-CoV-2 進(jìn)行識(shí)別。這種新型集成診斷設(shè)備有望在監(jiān)測(cè)新型冠狀病毒感染中發(fā)揮重要作用。側(cè)向流免疫層析測(cè)定（Lateral flow test，LFT）作為新型冠狀病毒抗體血清學(xué)檢測(cè)方法之一，具有成本低、便攜性好和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適合在醫(yī)療資源有限的地區(qū)開(kāi)展使用，但該方法分析時(shí)間易受樣本物理特性的影響，樣本過(guò)于黏稠，則分析耗時(shí)較長(zhǎng)，且此方法需要以固定化抗體作為配體，所選抗體必須具有較高的親和力、敏感性和特異性，因此如何縮短反應(yīng)時(shí)間、提高反應(yīng)效率是今后需著重考慮的問(wèn)題。

圖1 基于微流控技術(shù)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的檢測(cè)：（A）側(cè)向流免疫層析測(cè)試（LFT）[21]；（B）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）[25]；（C）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）[31]Fig.1 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) detection based on microfluidic technology: (A) Lateral flow test (LFT)[21]; (B) Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)[25];(C) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)[31]

近年來(lái)，基于微流控技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly spaced short palindromic repeats，CRISPR）已被用于SARS-CoV-2 檢測(cè)[22-23]。目前，RT-PCR 是診斷COVID-19 的金標(biāo)準(zhǔn)方法[24]，微流控設(shè)備的介入可提高RT-PCR 的檢測(cè)精度，縮短檢測(cè)時(shí)間。Ji 等[25]開(kāi)發(fā)了一種基于RT-PCR 的離心微流控裝置，該裝置包括微流控芯片、驅(qū)動(dòng)電機(jī)、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)，采用LED 光源作為激發(fā)光源，使用帶有發(fā)射濾光片的光電倍增管收集熒光信號(hào)，可在1.5 h 內(nèi)對(duì)SARS-CoV-2 進(jìn)行檢測(cè)（圖1B）。離心微流控通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制液體流動(dòng)，無(wú)需外加設(shè)備控制流體，是一種環(huán)境友好并可降低醫(yī)療壓力的設(shè)備。由于病毒潛伏期和個(gè)體攜帶病毒量的差異以及采樣人員的不規(guī)范操作，都可導(dǎo)致RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，而微流控芯片檢測(cè)過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化可能會(huì)對(duì)改善這些問(wèn)題。為了進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間，Zhang 等[26]研發(fā)了一種無(wú)需核酸擴(kuò)增的方案，并將這種檢測(cè)技術(shù)命名為“MARVE（多路復(fù)用、無(wú)核酸擴(kuò)增、單核苷酸分解的病毒進(jìn)化）”。該檢測(cè)技術(shù)利用Ag+與DNA 探針和脲酶相互作用，將分析整合到可折疊紙基中，通過(guò)改變?nèi)芤簆H 值，利用智能手機(jī)進(jìn)行分析，可在30 min 內(nèi)提供肉眼容易識(shí)別的比色測(cè)定結(jié)果。但是，該方法不能對(duì)SARS-CoV-2 基因中的未知變異進(jìn)行精確鑒定，只能作為一種輔助方法，并且由于缺少核酸擴(kuò)增步驟，因此其敏感度低于RT-PCR。

與RT-PCR 相比，LAMP 的優(yōu)點(diǎn)在于可恒溫?cái)U(kuò)增、檢測(cè)時(shí)間短、無(wú)需特殊的PCR 設(shè)備[27-29]。Davidson 等[30]設(shè)計(jì)了一種以唾液為分析樣本的紙基微流控POCT 設(shè)備，基于LAMP 分析可在60 min 內(nèi)檢測(cè)唾液樣本中的SARS-CoV-2，通過(guò)產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顏色變化確定是否感染SARS-CoV-2，并且僅通過(guò)改變LAMP 引物即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體的檢測(cè)。Natsuhara 等[31]設(shè)計(jì)了一種可連續(xù)分配液體的微流控芯片，通過(guò)LAMP 的比色分析可對(duì)每個(gè)腔室的傳染病進(jìn)行檢測(cè)，如新型冠狀病毒感染和甲乙型流感等（圖1C）。將LAMP 整合到微流控系統(tǒng)中可進(jìn)一步減少試劑消耗和降低對(duì)人員操作的要求[32]，但基于LAMP 的比色分析容易產(chǎn)生大量DNA 副產(chǎn)物，有可能會(huì)以氣溶膠的形式造成殘留污染，并且測(cè)試成本較高，需要一定的測(cè)試時(shí)間，其顏色變化與外加熱源有關(guān)。

新型冠狀病毒感染的快速診斷需依賴(lài)于快速、低成本和高靈敏度的檢測(cè)設(shè)備，并且應(yīng)與現(xiàn)有的遠(yuǎn)程醫(yī)療技術(shù)相兼容，以方便數(shù)據(jù)訪問(wèn)和遠(yuǎn)程管理。Farshidfar 等[33]設(shè)計(jì)了一種基于智能手機(jī)的微流控POCT設(shè)備，通過(guò)在智能手機(jī)上設(shè)定相應(yīng)檢測(cè)程序，對(duì)唾液中的SARS-CoV-2 進(jìn)行定量檢測(cè)，有助于在疾病發(fā)展空窗期進(jìn)行早期診斷。通過(guò)將檢測(cè)方法與智能手機(jī)進(jìn)行模塊化結(jié)合，構(gòu)建了一種便攜和用戶(hù)友好的核酸、蛋白質(zhì)或其它生物標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)。

CRISPR 被稱(chēng)為“分子剪刀”，是一種強(qiáng)大的基因編輯技術(shù)[34]。Chen 等[35]開(kāi)發(fā)了一種雙CRISPR/Cas12a輔助的逆轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（Reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RAA）檢測(cè)的離心微流控平臺(tái)。該平臺(tái)可在30 min 內(nèi)自動(dòng)檢測(cè)1 copy/μL 的新冠病毒，實(shí)現(xiàn)了SARS-CoV-2 的快速、現(xiàn)場(chǎng)、自動(dòng)化和超靈敏的檢測(cè)，可用于傳染病的居家快速檢測(cè)。CRISPR 技術(shù)檢測(cè)時(shí)間短且不依賴(lài)復(fù)雜設(shè)備，但該技術(shù)的脫靶效應(yīng)（Off-target effect）和crRNA 的設(shè)計(jì)復(fù)雜性會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.1.2 人類(lèi)免疫缺陷病毒的檢測(cè)

艾滋病（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）作為一種常見(jiàn)的傳染病，由于缺乏有效的疫苗和抗病毒藥物，其治療仍是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。盡管幾種潛在的疫苗正處于臨床試驗(yàn)的不同階段[36]，但大多數(shù)患者由于無(wú)法獲得即時(shí)診斷而不清楚自身狀況，并且在感染早期很難將人類(lèi)免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染的一系列癥狀與普通感冒發(fā)燒引起的癥狀區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此艾滋病的POCT對(duì)公共衛(wèi)生至關(guān)重要。目前，商業(yè)化的艾滋病自測(cè)試紙屬于初篩檢測(cè)，易受到自身免疫系統(tǒng)疾?。ㄈ缂t斑狼瘡）、病原微生物感染（如甲肝、乙肝）和腫瘤（如淋巴瘤）的影響而造成假陽(yáng)性[37]。Yang 等[38]研發(fā)了帶有手持式光學(xué)讀取器的一次性微流體免疫測(cè)定盒，采用間接免疫測(cè)定法，通過(guò)與膠體金納米顆粒結(jié)合的葡萄球菌蛋白A（SPA）從尿液樣本中捕獲HIV 抗體，利用毛細(xì)作用力通過(guò)側(cè)向流動(dòng)免疫層析來(lái)實(shí)現(xiàn)尿液HIV 檢測(cè)，是一種簡(jiǎn)單、快速和靈敏的HIV POCT 裝置，但手持式設(shè)備成本較高（70 美元），人群適用性仍有待進(jìn)一步考察。

1.2 寄生蟲(chóng)的檢測(cè)

瘧疾是由人類(lèi)瘧原蟲(chóng)感染引起的寄生蟲(chóng)病，診斷方法有光學(xué)顯微鏡直接觀察法、PCR 和快速診斷測(cè)試（Rapid diagnostic test，RDT）[39]等，這些診斷方法需要專(zhuān)業(yè)的操作人員對(duì)感染的細(xì)胞進(jìn)行觀察，不適用于資源匱乏地區(qū)。因此，研發(fā)高靈敏、操作簡(jiǎn)單和安全的瘧原蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)是十分必要的。Malpartida-Cardenas 等[40]研究了一種針對(duì)Kelch 13 基因的新型分子檢測(cè)方法，通過(guò)基于LAMP 反應(yīng)的電化學(xué)方法檢測(cè)溶液的pH 值的變化，能夠快速和特異性地檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)瘧疾。該方法首次使用來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)臨床分離物的DNA 樣本，在芯片上進(jìn)行DNA 定量檢測(cè)，并進(jìn)一步驗(yàn)證了與抗青蒿素瘧疾相關(guān)的C580Y 單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）檢測(cè)結(jié)果，可用于資源有限地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)瘧疾的快速篩查。Ghosh 等[41]開(kāi)發(fā)了一種可與智能手機(jī)聯(lián)用的微通道毛細(xì)管流動(dòng)分析（Microchannel capillary flow assay，MCFA）平臺(tái)，用于自動(dòng)檢測(cè)瘧疾生物標(biāo)志物（Plasmodium falciparum histidine rich protein 2，PfHRP2）。MCFA平臺(tái)可針對(duì)不同生物標(biāo)記物進(jìn)行定制，但該平臺(tái)耗電量大，運(yùn)行10 min 將消耗高達(dá)6%的手機(jī)電量，在不給智能手機(jī)持續(xù)充電的情況下僅可連續(xù)對(duì)16 個(gè)瘧疾樣本進(jìn)行檢測(cè)，因此在后續(xù)設(shè)備的優(yōu)化過(guò)程中，需考慮如何在節(jié)省電量的情況下同時(shí)進(jìn)行高通量檢測(cè)。

1.3 細(xì)菌的檢測(cè)

人感染細(xì)菌后，會(huì)發(fā)生一系列生理或病理變化。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌是引起細(xì)菌感染的常見(jiàn)病原菌，常規(guī)檢測(cè)方法主要為微生物培養(yǎng)法，通過(guò)形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等方法對(duì)微生物進(jìn)行鑒定[42]。這些方法通常需要3～5 d 才能對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)，不能滿足急性感染病的快速診斷要求。Xue 等[43]研發(fā)了一種以二氧化錳納米花（MnO2NFs）作為標(biāo)記物的微流控比色生物傳感器。該傳感策略將免疫磁性納米顆粒（MNPs）、樣品和MnO2NFs 在螺旋微混合器中充分混合孵育，形成MNP-細(xì)菌-MnO2夾心復(fù)合物，在微流控芯片的分離室進(jìn)行磁捕獲，然后注入H2O2-TMB 底物，使夾心復(fù)合物上的MnO2NFs 被模擬酶催化，生成黃色產(chǎn)物，用智能手機(jī)對(duì)其圖像進(jìn)行測(cè)量和處理，從而確定沙門(mén)氏菌的數(shù)量（圖2A）。該裝置利用MnO2NFs 作為信號(hào)探針，可對(duì)生物信號(hào)進(jìn)行有效放大，但是該研究并未進(jìn)行實(shí)際臨床樣本的檢測(cè)。Zhang 等[44]研發(fā)了一種基于LAMP 的嵌入式紙基微芯片，通過(guò)離心力將大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌均勻分布到反應(yīng)室中，引入鈣黃綠素?zé)晒夥肿訉?duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)更換試劑，芯片同樣可用于其它領(lǐng)域的核酸分析，但該芯片缺少大腸桿菌O157∶H7 和金黃色葡萄球菌相應(yīng)臨床樣本的驗(yàn)證，在臨床樣本中是否存在基質(zhì)效應(yīng)仍有待考察。微流控芯片在樣品分離、核酸擴(kuò)增等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，但需注意在檢測(cè)過(guò)程中多重食源性病原體之間的交叉污染。

圖2 （A）沙門(mén)氏菌比色檢測(cè)生物傳感器示意圖[43]；（B）結(jié)核分枝桿菌（MTB）DNA 光熱生物傳感示意圖[46]Fig.2 (A)Schematic of detection of Salmonella by colorimetric biosensor[43];(B)Illustration of Mycobacterium tuberculosis (MTB) DNA photothermal biosensing[46]

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的常用檢測(cè)方法有痰涂片、痰培養(yǎng)和分子檢測(cè)等[45]。近年來(lái)，基于分子檢測(cè)的結(jié)核病診斷技術(shù)發(fā)展迅速，鑒于常規(guī)的利用MTB DNA 檢測(cè)對(duì)MTB 的潛在感染進(jìn)行早期診斷的方法需要昂貴的測(cè)試儀器和專(zhuān)業(yè)的操作人員，Zhou 等[46]基于紙基微流控技術(shù)設(shè)計(jì)了一種低成本光熱生物傳感方法（圖2B）。DNA 捕獲探針經(jīng)過(guò)修飾固定在紙基上，靶序列被DNA 捕獲探針捕獲，然后與AuNP 標(biāo)記的檢測(cè)探針結(jié)合，形成夾心復(fù)合物，AuNP 在H2O2存在下催化TMB 氧化反應(yīng)生成TMB 的氧化產(chǎn)物（OX-TMB），OX-TMB 可作為強(qiáng)光熱劑在808 nm 激光照射下將目標(biāo)濃度信息轉(zhuǎn)換為溫度信號(hào)，使用溫度計(jì)可對(duì)紙基設(shè)備上的MTB DNA 進(jìn)行DNA 溫度計(jì)測(cè)量。這是首次嘗試對(duì)紙基混合微流控器件進(jìn)行光熱分析，該方法構(gòu)思巧妙，但需考慮在測(cè)量過(guò)程中出現(xiàn)的熱損耗，因此應(yīng)盡可能選用高精度的熱敏元件。

2 在腫瘤診斷中的應(yīng)用

腫瘤診斷和治療仍是一項(xiàng)全球性的醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)，目前常用診斷方法包括腫瘤標(biāo)志物檢查、病理學(xué)檢測(cè)和影像學(xué)診斷，這些檢測(cè)方法價(jià)格昂貴且結(jié)果等待時(shí)間長(zhǎng)，不利于家庭自檢和便攜化檢測(cè)，而小型便攜式的檢測(cè)手段有利于及早發(fā)現(xiàn)腫瘤，提高治愈率，延長(zhǎng)患者壽命。Lim 等[47]研發(fā)了一種基于微流控芯片的外泌體mRNA 傳感器（Exosomalmrna sensor，exoNA），通過(guò)集成微流控芯片和3D 水凝膠納米結(jié)構(gòu)，對(duì)血液中乳腺癌相關(guān)的外泌體ERBB2 進(jìn)行檢測(cè)，有望用于乳腺癌的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)?；诖呋l(fā)夾組裝（Catalytic hairpin assembly，CHA）的探針由脂質(zhì)體攜帶被物理包埋在水凝膠中，水凝膠遇水膨脹，保持多孔結(jié)構(gòu)，加入使脂質(zhì)體降解的Triton X-100，探針被釋放出來(lái)，從臨床樣本中分離的外泌體被分解，靶基因與探針組之間的CHA 反應(yīng)被激活進(jìn)而放大熒光信號(hào)（圖3A）。該設(shè)備利用真空驅(qū)動(dòng)的無(wú)電源微流控芯片，通過(guò)對(duì)微量流體精確控制，提高了反應(yīng)靈敏度和準(zhǔn)確性，此外，該策略還克服了現(xiàn)有基因診斷方法的局限性，有利于建立液體活檢和預(yù)后監(jiān)測(cè)等現(xiàn)場(chǎng)診斷平臺(tái)。

圖3 （A） exoNA 傳感芯片示意圖[47]；（B）微流控設(shè)備聯(lián)合氣體壓力計(jì)對(duì)肺癌進(jìn)行檢測(cè)示意圖[51]Fig.3 (A)Schematic of exoNA sensing chip[47];(B)Schematic of microfluidic-based device combined with gas pressure bioassay for lung cancer detection[51]

人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）已成為宮頸癌等疾病中公認(rèn)的病毒致癌因子，HPV16 和HPV18 的持續(xù)感染通常與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[48]，HPV 分型檢測(cè)和液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（Thin-prep cytology test，TCT）為宮頸癌的常用篩查手段，取樣操作可能會(huì)引起患者不適，并且依賴(lài)于熟練的操作人員。雖然HPV 分子檢測(cè)已成為鑒定病毒感染和確定其特定類(lèi)型的重要方法，但目前對(duì)于HPV 的感染診斷仍需要復(fù)雜儀器和繁瑣的操作過(guò)程，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。Appidi 等[49]研發(fā)了一種可原位形成金納米粒子的無(wú)標(biāo)記比色技術(shù)（Label-free colorimetric technique，C-ColAur）用于臨床樣本的檢測(cè)，敏感性為96.42%，特異度為87.5%，可在1 min 內(nèi)對(duì)宮頸癌進(jìn)行定性檢測(cè)，這也是金納米粒子首次應(yīng)用于比色策略中作為篩查宮頸癌的手段，該技術(shù)在腫瘤護(hù)理點(diǎn)檢測(cè)方面顯示出巨大的應(yīng)用前景。Zhao 等[50]建立了一種集微流控芯片、離心平臺(tái)、溫度控制板和熒光檢測(cè)器于一體的檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)將細(xì)胞裂解、核酸純化、等溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)集成到一個(gè)裝置，在40 min 內(nèi)對(duì)5 種高危HPV（16、18、39、45、52）進(jìn)行檢測(cè)，該裝置比常規(guī)qPCR 分析速度更快、診斷通量更大（可同時(shí)進(jìn)行40 個(gè)LAMP 反應(yīng)）、所用試劑更少。這些技術(shù)在資源有限的地區(qū)具有替代qPCR 檢測(cè)的潛力，但僅能對(duì)宮頸癌進(jìn)行快速定性或半定量檢測(cè)，無(wú)法做到準(zhǔn)確測(cè)定HPV 病毒載量，因此檢測(cè)性能還有待提高。

Shi 等[51]研發(fā)了一種將多通道芯片與便攜式氣體壓力計(jì)相結(jié)合的微流控設(shè)備，對(duì)肺癌進(jìn)行篩查。設(shè)計(jì)了4 種DNA 四面體探針作為捕獲探針，固定在芯片不同區(qū)域，4 種與肺癌相關(guān)的miRNA 與捕獲探針特異結(jié)合，使用環(huán)形烘箱洗掉通道中的未結(jié)合試劑，通過(guò)便攜式氣壓計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)，氣體壓力與miRNA的濃度對(duì)數(shù)之間存在線性關(guān)系，這是便攜式氣壓計(jì)首次應(yīng)用到紙芯片中作為肺癌的篩查手段（圖3B）。來(lái)自生物體液的外泌體已成為一種潛在的新型腫瘤標(biāo)志物，Yu 等[52]提出了另一種高度集合的外泌體分離檢測(cè)（Exosome separation and detection，ExoSD）芯片，該芯片從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離外泌體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)高靈敏地檢測(cè)來(lái)自于胃癌細(xì)胞的外泌體，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌的早期診斷。ExoSD 芯片已被證明是可用于外泌體分離和監(jiān)測(cè)的前沿平臺(tái)，該平臺(tái)可將技術(shù)擴(kuò)展到其它細(xì)胞來(lái)源的外泌體或細(xì)胞分離的檢測(cè)過(guò)程?；谖⒘骺丶夹g(shù)的外泌體分析方法具有檢測(cè)時(shí)間短、試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，可在一定程度上滿足大量臨床樣本中外泌體的快速檢測(cè)要求，但通常需要與注射器和熒光檢測(cè)儀等配套設(shè)備結(jié)合使用，在一定程度上限制了使用場(chǎng)景。

基于微流控的POCT 設(shè)備作為一種新興技術(shù)在腫瘤早期診斷中顯示出良好的應(yīng)用前景，也可以用于腫瘤治療，如Kim 等[53]模擬了經(jīng)腦轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌的腦腫瘤微環(huán)境，并構(gòu)建3D 微流控裝置，開(kāi)發(fā)了一種可單獨(dú)收集多種細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，該模型為精準(zhǔn)治療和臨床前評(píng)估針對(duì)轉(zhuǎn)移和耐藥腫瘤的全新治療方案提供了一種潛在的藥物篩選模型。目前，通過(guò)建立腫瘤微環(huán)境模型進(jìn)行抗癌藥物篩選已成為研究熱點(diǎn)，但大多數(shù)篩選平臺(tái)仍處于初級(jí)發(fā)展階段，因此實(shí)驗(yàn)前需要更復(fù)雜、更準(zhǔn)確地建模，才能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供可靠的支撐，腫瘤芯片不僅可推動(dòng)各種新型免疫治療技術(shù)的發(fā)展，還可作為連接體外平臺(tái)和動(dòng)物模型之間的橋梁。

3 在慢性病診斷中的應(yīng)用

慢性病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)已達(dá)到流行病的比例[54]，大多數(shù)慢性?。ㄌ悄虿　⒏哐獕?、冠心病、肺病和腎病等）通常難以一次性治愈，加之欠發(fā)達(dá)地區(qū)缺乏及時(shí)的醫(yī)療服務(wù)，常造成慢性病患者得不到及時(shí)有效的診斷而耽誤治療[55]，因此，慢性病的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)顯得尤為重要。

糖尿病是一種由多病因引起的代謝紊亂性疾病，血糖水平是監(jiān)測(cè)糖尿病的重要參數(shù)。糖尿病患者通常伴有一種或多種并發(fā)癥，高脂血癥是最常見(jiàn)也是最重要的一種，可誘發(fā)心血管疾病，同時(shí)檢測(cè)血糖、甘油三酯和總膽固醇的含量可以更好地監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展。Li 等[56]研發(fā)了基于智能手機(jī)的扇形微流控裝置，通過(guò)離心將血清樣本均勻分配到4 個(gè)反應(yīng)室中，使用帶有LED 光源的智能手機(jī)對(duì)體系中過(guò)氧化物酶-H2O2產(chǎn)生的顏色變化進(jìn)行捕捉和分析，同時(shí)檢測(cè)葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇3 項(xiàng)指標(biāo)。該裝置通過(guò)與智能手機(jī)聯(lián)用，使糖尿病、高脂血癥檢測(cè)更加便攜化和智能化。連續(xù)、實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)血糖有利于糖尿病治療，Pu 等[57]提出了一種基于柔性電子學(xué)的表皮生物微流控技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了可穿戴式葡萄糖檢測(cè)，通過(guò)增強(qiáng)皮膚滲透性，能夠在短時(shí)間內(nèi)以較小的電流密度透皮提取足夠的透皮間質(zhì)液（Transdermal interstitial fluid，ISF），從而有效減少長(zhǎng)期侵入式采血所引起的皮膚刺激。近年來(lái)，新興的可穿戴設(shè)備促進(jìn)了汗液、唾液和尿液等生物標(biāo)志物的檢測(cè)，這些設(shè)備使慢性病檢測(cè)能夠以一種低成本、高通量、無(wú)需專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持的方式出現(xiàn)在護(hù)理點(diǎn)檢測(cè)平臺(tái)。

慢性腎臟疾?。–hronic kidney disease，CKD）也是醫(yī)療保健系統(tǒng)重要的檢測(cè)工作，盡早識(shí)別危險(xiǎn)因子或找到合適的生物標(biāo)記物有助于在發(fā)病前實(shí)施早期治療。Rossini 等[58]基于比色法研發(fā)了一種可對(duì)尿液肌酐和尿酸進(jìn)行定量檢測(cè)的微流控紙基分析裝置，目標(biāo)產(chǎn)物濃度與顏色強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。Fan 等[59]構(gòu)建的微流控紙基芯片平臺(tái)可對(duì)唾液中尿酸濃度進(jìn)行定量測(cè)定，利用尿酸和鐵氰化鉀組成氧化還原系統(tǒng)，通過(guò)Fe3＋與反應(yīng)產(chǎn)物亞鐵氰化鉀進(jìn)行顯色，該裝置不僅解決了背景信號(hào)干擾的問(wèn)題，還將靈敏度提高了近2 個(gè)數(shù)量級(jí)，利用兩個(gè)不同品牌的智能手機(jī)進(jìn)行拍照，以比色卡為基準(zhǔn)消除不同手機(jī)之間的色差，確保檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和普適性（圖4A）。該平臺(tái)通過(guò)擬合手機(jī)拍攝的色卡RGB 值和參考灰階色卡的RGB 值對(duì)手機(jī)拍攝的圖片顏色進(jìn)行校正，但不同品牌手機(jī)中的相機(jī)參數(shù)會(huì)有差異，手機(jī)拍照呈現(xiàn)的并非原圖，容易受色卡的打印色差、樣本的顯色差異等因素影響，應(yīng)考察多款手機(jī)，以評(píng)估其普適性。此外，尿白蛋白、尿素氮和胱抑素C 等均可作為慢性腎臟疾病的輔助指標(biāo)，若同時(shí)進(jìn)行多重生物標(biāo)志物檢測(cè)，可有效提高慢性腎臟疾病的檢出率。

圖4 （A）唾液尿酸比色檢測(cè)流程[59]；（B）急性心肌梗死（AMI）光熱生物傳感示意圖[61]Fig.4 (A) Schematic illustration of colorimetric test process for saliva uric acid[59]; (B) Schematic diagram of photothermal biosensing in acute myocardial infarction (AMI)[61]

急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）已成為近年來(lái)人類(lèi)面臨的主要疾病風(fēng)險(xiǎn)之一，肌鈣蛋白（Troponin，Tn）是心肌損傷的特異性標(biāo)志物，可在急性癥狀出現(xiàn)前幾天逐漸升高至納克水平[60]，Yu 等[61]研發(fā)了基于低成本熱敏纖維紙的光熱生物傳感系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)級(jí)聯(lián)酶聯(lián)反應(yīng)放大目標(biāo)信號(hào)，使用含有熱變色染料的功能纖維紙作為傳感器，將目標(biāo)信號(hào)轉(zhuǎn)化為激光照射下的熱信號(hào)，設(shè)計(jì)便攜式高通量靶標(biāo)蛋白監(jiān)測(cè)設(shè)備，以滿足護(hù)理點(diǎn)檢測(cè)Tn 的需要（圖4B）。該方法可促進(jìn)便攜式生物傳感器中熱變色材料的開(kāi)發(fā)，但僅對(duì)單一心臟生物標(biāo)志物進(jìn)行測(cè)定，在早期AMI 階段不足以說(shuō)明問(wèn)題。為了克服這種局限，Lim 等[62]研發(fā)了一種快速微流控紙基設(shè)備，可同時(shí)檢測(cè)多種生物標(biāo)記物，如糖原磷酸化酶同工酶、肌鈣蛋白和肌酸激酶，該設(shè)備通過(guò)毛細(xì)作用將目標(biāo)檢測(cè)物分流到單獨(dú)檢測(cè)區(qū)，在10 min 內(nèi)通過(guò)比色定量測(cè)定檢測(cè)區(qū)靶標(biāo)濃度。該設(shè)備顯著縮短了分析時(shí)間，并降低了多重心臟生物標(biāo)記物的檢測(cè)成本，但該設(shè)備產(chǎn)物顯色不均，定量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步改進(jìn)。

表1 總結(jié)了基于微流控的POCT 設(shè)備在傳染病、腫瘤和慢性病檢測(cè)和診斷中的應(yīng)用情況。

表1 基于微流控的即時(shí)檢測(cè)（POCT）設(shè)備在傳染病、腫瘤和慢性病檢測(cè)和診斷中的應(yīng)用Table 1 Applications of microfluidic-based point-of-care testing (POCT) devices in detection and diagnosis of infectious diseases, tumors and chronic diseases

4 總結(jié)與展望

隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，基于微流控技術(shù)的POCT 設(shè)備已被應(yīng)用于傳染病、腫瘤和慢性病檢測(cè)等領(lǐng)域，并與智能手機(jī)或其它檢測(cè)器件結(jié)合，大數(shù)據(jù)、5G 技術(shù)、人工智能和遠(yuǎn)程醫(yī)療的出現(xiàn)使得該技術(shù)展現(xiàn)出巨大應(yīng)用前景。微流控技術(shù)具有集成小型化、自動(dòng)化、高通量、試劑損耗量少、樣本需求量低和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，微流控器件已成為發(fā)展POCT 的首選。

雖然基于微流控技術(shù)的POCT 設(shè)備提供了強(qiáng)大且快速的檢測(cè)方法，但仍面臨許多挑戰(zhàn)。分析前需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，以降低測(cè)量過(guò)程中產(chǎn)生的誤差。樣本來(lái)源多樣化，如尿液、全血、血漿、汗液、糞便和唾液等的理化性質(zhì)不同，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理后才可作為檢測(cè)設(shè)備的目標(biāo)分析物，這對(duì)于非醫(yī)務(wù)專(zhuān)業(yè)人員是個(gè)挑戰(zhàn)。傳染性疾病POCT 未來(lái)的發(fā)展可能更加側(cè)重使用原始臨床樣本，無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理。從分析診斷的角度來(lái)看，需要進(jìn)一步拓展和設(shè)計(jì)以提高診斷設(shè)備特異性和靈敏度，減少假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果，此外還需提高設(shè)備的穩(wěn)定性和檢測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性。從檢測(cè)方法來(lái)看，大多數(shù)檢測(cè)方法仍以比色檢測(cè)為主，因此如何有效消除背景干擾也是需要解決的問(wèn)題。未來(lái)還需建立更多比色結(jié)果數(shù)據(jù)庫(kù)，編程到智能手機(jī)或其它附件中，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度。從市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力來(lái)看，成熟的微流控產(chǎn)品研發(fā)成本高、回報(bào)周期長(zhǎng)、資金需求大，并且在欠發(fā)達(dá)地區(qū)缺乏相應(yīng)指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)和行為準(zhǔn)則，而這些對(duì)于行業(yè)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)都是十分必要的。因此，微流控行業(yè)需借鑒其它行業(yè)的成功經(jīng)驗(yàn)，加大對(duì)微流控領(lǐng)域的生物醫(yī)學(xué)投資，制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)措施和行為指南，使得該項(xiàng)技術(shù)能夠盡早投入臨床使用。