張恒 陳苗 孫善偉 孫曉雷 侯嵩 郭昌勝徐建 孫文軍

1（中國環(huán)境科學研究院環(huán)境健康風險評估與研究中心， 北京 100012）

2（國家環(huán)境保護化學品生態(tài)效應(yīng)與風險評估重點實驗室， 北京 100012）

3（新疆阿克蘇地區(qū)環(huán)境保護監(jiān)測站， 阿克蘇 843000）

4（沃特世科技（上海）有限公司， 上海 201206）

三嗪類農(nóng)藥（Triazine pesticides，TPs）是一類高效選擇性除草劑，具有化學性質(zhì)穩(wěn)定、適用范圍廣等特點[1-2]。TPs 分子具有低水溶性，易吸附到土壤中，并隨著降水、徑流和沉降等方式進入環(huán)境，長期存在于環(huán)境介質(zhì)中[3]。中國、希臘和法國等多個國家[4-6]的地表水和海洋中頻繁檢出三嗪類除草劑。我國長江、黃河、太湖和松花江等重點流域地表水中阿特拉津（一種三嗪類農(nóng)藥）檢出率為100%，平均濃度范圍在7.0～1289.5 ng/L 之間，濃度差異較大[7-8]；其它三嗪類農(nóng)藥（如撲草凈、撲滅津和莠滅凈）在萊州灣海域也均有檢出（未檢出～29.4 ng/L）[9]，其中，撲草凈在黃渤海沿岸海域中最高濃度達627.5 μg/L[6]。TPs 具有一定的致癌性和免疫毒性[10-11]，如阿特拉津可使雄性青蛙雌性化[12]；水中的莠滅凈可能導致腎臟充血、低血壓等疾病[10，13-14]；TPs 可以結(jié)合受體激素，干擾中樞神經(jīng)和大腦發(fā)育[15]。多個國家將阿特拉津、西瑪津和嗪草酮等TPs 列入內(nèi)分泌干擾劑化合物名單[16]，如美國環(huán)保署規(guī)定飲用水中阿特拉津和西瑪津含量分布不得超過3 和4 μg/L[17]，我國《水環(huán)境質(zhì)量標準》（GB 3838—2002）[18]集中式生活飲用水特定項目標準限值中也規(guī)定了三嗪類除草劑阿特拉津的濃度不得超過3 g/L。我國地表水環(huán)境中TPs 殘留情況比較普遍，同時具有濃度差異大的特點，因此，開發(fā)高靈敏度、多種TPs 同時快速測定的方法十分必要。

目前，水體中農(nóng)藥常用的檢測方法包括氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[19]、高效液相色譜法（HPLC）[20]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[21]等。Djozan 等[19-20]使用GC-MS 測定水中阿特拉津、西瑪津、撲滅津和撲草凈，檢出限在20～80 μg/L 之間，HPLC 測定大豆中西瑪津、阿特拉津、莠滅凈、撲滅津和特丁津5 種TPs 的檢出限在0.668～1.16 μg/L 之間。與GC-MS/MS 相比，使用HPCC-MS/MS 對水樣預處理的要求更低，并且該方法具有更低的檢出限、更寬的適用范圍和更好的分析性能[22-23]。李少飛等[24]使用HPLC-MS/MS 測定地表水和地下水中的阿拉特津，檢出限低至20 ng/L。

水體中TPs 的污染物整體賦存水平較低，直接進樣法雖然便捷快速，但難以滿足部分農(nóng)藥類物質(zhì)的靈敏度需求，需富集后測定。常用的富集前處理方法包括固相萃取（Solid phase extraction，SPE）[25]、超聲萃取[26]和索氏萃取[27]等。索氏萃取耗費時間長，有機溶劑使用量大，萃取過程中目標物質(zhì)可能會受熱分解；超聲萃取和固相萃取相較于索氏萃取具有有機溶劑消耗低、萃取效率高的優(yōu)點，但成本高，費時費力。在線固相萃取技術(shù)（Online-SPE）與傳統(tǒng)的固相萃取相比，上樣時間由1～2 h 縮短到幾分鐘，水樣體積由幾百毫升降低至幾毫升，樣品采集、運輸及保存的便捷性顯著提升。同時，Online-SPE 自動化程度高，能夠有效減少人工誤差。目前，該技術(shù)已被用于多種基質(zhì)中藥物殘留的檢測[28-30]。安永生等[31]采用Online-SPE-HPLC-MS 測定水中阿特拉津，進樣量為2.5 mL 時，檢出限為8 ng/L，實際水樣加標回收率為91.6%～101.0%。陳永艷等[32]使用Online-SPE-HPLC-MS/MS 測定水源水和飲用水中典型農(nóng)藥及代謝產(chǎn)物，方法檢出限為0.03～1.5 ng/L， 但107 種農(nóng)藥中僅含5 種TPs。

本研究結(jié)合Online SPE 方便快捷和LC-MS/MS 靈敏度高、分析速率快的優(yōu)勢，從SPE 柱選擇、質(zhì)譜條件和液相色譜條件3 個方面對方法進行優(yōu)化，建立了在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Online SPE-UPLC-MS/MS）同時測定水中15 種TPs 的方法。應(yīng)用本方法對北京溫榆河地表水3 個點位的15 種TPs 進行測定，以考察TPs 在北京市地表水河流中的殘留水平。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

2777C-FLR 在線固相萃取-ACQUITYQSM-BSM 超高效液相色譜儀-Xevo T-QS 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（美國沃特世公司）；Oasis HLB Direct Connect 在線固相萃取柱（20 mm × 2.1 mm， 5 μm， 美國沃特世公司）；ACQUITYUPLC?BEH C18反相色譜柱（50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美國沃特世公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。0.22 μm 聚醚砜水相針式濾頭（美國沃特世公司）。

乙腈、甲醇和甲酸（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）。15 種TPs 標準品購自美國Sigma-Aldrich公司，詳細信息見表1。標準品用甲醇溶解，配制成1000 mg/L 的單標標準儲備液，于-20 ℃保存?zhèn)溆?；將上?5 種TPs 單標用超純水稀釋，配制成各TPs 濃度均為10 mg/L 的混合標準溶液。

表1 15種三嗪類農(nóng)藥（TPs）的物理化學性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of triazine pesticides (TPs)

1.2 樣品采集及前處理

采集北京市溫榆河地表水水樣，置于洗凈的棕色試劑瓶中，于4 ℃保存。水樣加入適量的內(nèi)標標準液（Atrazine-d5，100 μg/L）， 經(jīng)0.22 μm 針式濾頭過濾后，待測。

1.3 Online SPE-UPLC-MS/MS分析參數(shù)

Online SPE 條件 使用Online SPE 模式進樣，進樣體積為1000 μL， 全自動Online SPE 裝置配有兩根Online SPE 柱，交替使用。在0～3.8 min 時，四元泵完成樣品從自動進樣器到Online SPE 柱的富集；4.1 min 時，六通閥切換至分析流路中；4.1～11.0 min 二元泵將富集在Online 萃取柱進行沖洗和活化，Online SPE 裝置流路示意圖見圖1。

UPLC 測定條件 柱溫箱溫度40 ℃；流動相：四元泵用于富集樣品，四元泵流動相A 為純水，B 為乙腈，C 為甲醇。四元泵梯度洗脫程序：0～0.5 min，100% A；0.5～3.8 min，100% A；3.8～4.1 min，100%C；4.1～8.0 min，100% C；8.0～8.1 min，50% A，50% B；8.1～12.0 min，100% A。二元泵用于色譜分析，二元泵流動相A 為乙腈，流動相B 為0.5%甲酸（含10 mmol/L 的醋酸銨）。二元泵洗脫程序：0.0～3.8 min，20% A；3.8～4.1 min，20% A；4.1～5.0 min，20%～50% A；5.0～10.0 min，55% A；10.0～10.1 min，50%～98% A；10.1～12.0 min，98% A；12.0～12.1 min，98%～20% A；12.1～13.0 min，20% A。

MS/MS 檢測條件 毛細管電壓設(shè)定為2.15 kV， 離子源溫度為150 ℃，去溶劑化溫度為400 ℃，脫溶劑氣流量為1000 L/h。采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）記錄色譜圖。使用氮氣作為去溶劑化和霧化氣體，碰撞氣為氬氣。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測方法的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制濃度為100 μg/L 的15 種TPs 的單一標準溶液，采用電噴霧正離子模式（ESI+），以準分子離子為母離子，分別對15 種單標溶液進行二級質(zhì)譜掃描，利用沃特世公司軟件的自動調(diào)諧功能對子離子質(zhì)荷比、錐孔電壓和毛細管電壓等參數(shù)進行自動優(yōu)化，選擇豐度較高的兩個碎片離子作為定量離子和定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 15種TPs的質(zhì)譜分析條件Table 2 Mass spectrometry conditions for 15 kinds of TPs

2.1.2 液相色譜分析條件優(yōu)化

十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）類色譜柱是目前最常用的液相色譜分離柱，劉彬等[33]比較了TPs 在ZORBAX Eclipse Plus C18柱和SB-C18柱（后者具有二異丁基側(cè)鏈基團，耐酸性更強）上的分離情況，發(fā)現(xiàn)ZORBAX Eclipse Plus C18柱無法分離西草凈、阿特拉津、撲滅津和莠滅凈，SB-C18柱無法分離阿特拉津和去草凈，但兩種色譜柱都可實現(xiàn)定量分析，其中，SB-C18柱分離時間略長于ZORBAX Eclipse Plus C18。吳春英等[34]利用ACQUITYUPLC?BEH C18反相色譜柱實現(xiàn)了27 種TPs 的完全分離，并且分離的峰形尖銳對稱。因此，本研究選用ACQUITYUPLC?BEH C18反相色譜柱，以獲得較好的色譜保留和色譜峰形。

使用15 種TPs 混合標準溶液，在Open Architecture（OA）模式下，對比了乙腈-0.1%（體積分數(shù)，下同）甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.5%甲酸、甲醇-0.5%甲酸、乙腈-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸銨）和甲醇-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸銨）6 種流動相條件下15 種TPs 的信號強度，結(jié)果表明，流動相為乙腈-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸銨）時，15 種TPs 的信號強度最好。

2.1.3 Online SPE條件優(yōu)化

SPE 柱的填料種類對目標化合物的富集有決定性影響。目前，TPs 進行大體積離線富集時多采用HLB[34-35]和C18[36]SPE 柱，因此，本研究選用XBridge C18和Oasis HLB 這兩種通用型SPE 柱進行對比。優(yōu)化液相色譜梯度洗脫條件后，使用這兩種SPE 柱對目標分析物進行富集，結(jié)果表明，使用Oasis HLB 柱時，極性較強的目標化合物（如撲滅通和撲滅津）的色譜響應(yīng)值更高。因此，本研究選用Oasis HLBSPE 柱進行在線富集。

利用15 種TPs 的混合標準溶液，洗脫溶劑為純甲醇，對比了純水和不同濃度甲酸溶液作為上樣溶劑時，各目標化合物的響應(yīng)強度。如圖2 所示，純水作為上樣溶劑時，除西草凈外，其它14 種TPs 的富集效果較好；0.5%甲酸作為上樣溶劑時，西草凈的富集效果最好，而其它14 種TPs 的富集效果略差。綜合考慮，本研究選取純水作為上樣溶劑。

圖2 15 種TPs 在不同上樣和洗脫體系中的響應(yīng)：（A）上樣溶劑為超純水，洗脫溶劑為乙腈；（B）上樣溶劑為超純水，洗脫溶劑為甲醇；（C）上樣溶劑為0.1%甲酸，洗脫溶劑為甲醇；（D）上樣溶劑為0.5%甲酸，洗脫溶劑為甲醇。Fig.2 Responses of 15 kinds of TPs in different loading and elution systems:(A)Sample loading with ultra-pure water and eluted with acetonitrile; (B) Sample loading with ultra-pure water and eluted with methanol;(C)Sample loading with 0.1%formic acid water and eluted with methanol;(D)Sample loading with 0.5%formic acid water and eluted with methanol.

利用15 種TPs 的混合標準溶液，上樣溶劑為純水，對比了100%乙腈和100%甲醇作為洗脫溶劑時，各目標化合物的響應(yīng)強度。如圖2 所示，上樣溶劑為純水、洗脫溶劑為純甲醇時，15 種TPs 的信號強度最好。不同上樣和洗脫體系下15 種TPs 的響應(yīng)結(jié)果見圖2，15 種TPs 的色譜圖見圖3（序號對應(yīng)的化合物同表1）。

圖3 15 種TPs 的色譜圖，上樣濃度為1 ng/L，上樣溶劑為超純水，洗脫溶劑為甲醇，流動相為乙腈-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸銨）Fig.3 Chromatograms of 15 kinds of TPs at concentration level of 1 ng/L. Sample is loaded with ultra-pure water and eluted with methanol. Mobile phase is acetonitrile-0.5% formic acid water (containing 10 mmol/L ammonium acetate)

2.2 方法的分析性能

2.2.1 線性關(guān)系和檢出限

配制1～100 ng/L 系列15 種TPs 的混合標準溶液，采用優(yōu)化的色譜條件進行檢測，以峰面積對質(zhì)量濃度做線性回歸，15 種TPs 在各自濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.994）。采用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋標準溶液的方法，確定檢出限和定量限，結(jié)果見表3。15 種TPs 的檢出限（LOD，S/N=3）為0.001～0.036 ng/L， 定量限（LOQ，S/N=10）為0.003～0.108 ng/L。

表3 15種TPs的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear equations, linear correlation coefficients, limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of 15 kinds of TPs

2.2.2 回收率和精密度

在陰性水樣（超純水）中加入混合標準溶液，加標水平分別為10、20 和50 ng/L， 水樣經(jīng)過0.22 μm聚醚砜水相針式濾頭過濾后測定，計算樣品的加標回收率。由圖4 可知，超純水水樣中15 種TPs 的加標回收率在69.7%～103.0%之間，RSD 在3.13%～9.98%之間，。

圖4 15 種TPs 的加標回收率和精密度Fig.4 Spiking recoveries and precisions of 15 kinds of TPs (n=6)

2.2.3 實際樣品分析

采用上述方法測定北京市溫榆河3 個地點的地表水樣品中15 種TPs 的殘留量（WY1～WY3，采集時間為2021 年11 月6 日），以驗證方法的實用性。樣品采集后，加入適量內(nèi)標，采用0.22 μm 聚醚砜水相針式濾頭過濾后，采用建立的Online SPE-UPLC-MS/MS 進行測定，結(jié)果見圖5。3 個水樣中，WY1 和WY3中15 種TPs 均有檢出， WY2 中僅苯嗪草酮未檢出， TPs 的總檢出濃度分別為64.49、71.35 和97.41 ng/L。根據(jù)《水環(huán)境質(zhì)量標準》（GB 3838—2002）[18]中集中式生活飲用水特定項目標準限值規(guī)定，TPs 中阿特拉津的濃度不得超過0.003 mg/L， 本次檢測的所有樣品均未超標。樣品中去異丙基阿特拉津、滅蠅胺和撲草凈的環(huán)境濃度較高，溫榆河兩岸有大量農(nóng)田和城市園林綠化帶[37]，農(nóng)業(yè)耕作[38]使用的除草劑可能是溫榆河河水中TPs 的直接和主要來源。

圖5 溫榆河河水中TPs 濃度的分布圖Fig.5 Distribution of TPs concentration in the Wenyu River water

3 結(jié)論

采用Online SPE 富集凈化方法，結(jié)合UPLC-MS/MS 法實現(xiàn)了地表水中15 種TPs 殘留的同時測定，樣品經(jīng)0.22 μm 針式濾頭過濾后即可進樣分析。本方法15 種TPs 的線性關(guān)系良好（R2＞0.994），檢出限在0.001～0.036 ng/L 之間，定量限為0.036～0.108 ng/L。與常規(guī)TPs 檢測方法相比，本方法具有分析通量高、檢出限低、精確度高、檢測時間短和分析效率高等特點，適用于地表水中痕量TPs 的快速測定。