光敏四面體框架核酸用于活細胞內mRNA的檢測

黃書娟 徐燕 方小軍 路東亮 謝永榮 林美華

1（贛南醫(yī)學院藥學院， 贛州 341000） 2（贛南師范大學化學化工學院， 贛州 341000）

3（中國地質大學（武漢）材料與化學學院， 納米礦物材料及應用教育部工程研究中心， 430074）

作為一類新型三維DNA 納米結構，四面體框架核酸（Tetrahedral framework nucleic acids，tFNAs）是由4 條等物質量單鏈DNA退火形成[1]，具有精確可控、尺寸可調、易修飾、合成產(chǎn)率高以及結構穩(wěn)定性好等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應用于各種靶標分子檢測[2-7]和生物成像[8-11]。研究表明，四面體框架核酸是通過角攻擊姿態(tài)接觸細胞膜[12]，無需轉染試劑輔助，即可被細胞高效攝取。因此，四面體框架核酸常用于細胞內多種靶標分子的檢測[13-16]。

細胞內腫瘤相關信使RNA（Messenger RNA，mRNA）的表達水平與腫瘤進展和預后相關[17]，對其精確檢測和成像有利于疾病的早期診斷[18]。迄今，研究者利用DNA 的可編程性，基于四面體框架核酸設計了分子信標[19-20]、Toehold 介導鏈取代[21]、納米鑷子結構[15]、可變形結構[22]、分子內催化發(fā)夾組裝[23]和熵驅動DNA 放大器[24]等結構用于活細胞內mRNA 的成像。四面體框架核酸一般需要數(shù)個小時才能進入細胞，而進入細胞后且遇到靶標mRNA將立即與之發(fā)生雜交反應，并產(chǎn)生相應的信號變化。傳統(tǒng)的四面體框架核酸探針一直處于“打開”的狀態(tài)，在到達細胞內特定位置前即可完成靶標識別和響應，難以控制反應起點，不能實現(xiàn)在特定時間點檢測活細胞內mRNA 分布，而mRNA 的表達水平和空間分布具有很高的時空依賴性[18,25]。因此，發(fā)展一種可在任意時間點對細胞內靶標mRNA 檢測的框架核酸具有重要意義。

光是一種理想的外部刺激因子，對大部分細胞損傷小，并且可通過時間和空間進行程序性控制[26]。因此，光常被用于調控細胞內核酸活性，如基因表達[27]、DNA 邏輯門[28]、DNA 雜交[29]和DNA 酶活性[30]等。得益于DNA合成技術的發(fā)展，將光響應分子嵌入DNA 中，使DNA 探針的檢測功能處于“關閉”狀態(tài)；在光照下，光響應分子發(fā)生結構變化，將探針“激活”，發(fā)揮其檢測功能[31]。因此，這種光化學方法有助于時空可控的生物分子原位分析。Qiu 等[32]將光敏分子嵌入分子信標中，實現(xiàn)了細胞內mRNA 的時空可控檢測。Chu 等[33]利用上轉換納米粒子作為載體將光響應分子信標運送至細胞內，近紅外光照下激活探針，定點檢測靶標mRNA。Huang[25]和Lin[34]等構建了多種光響應的核酸探針，實現(xiàn)了單細胞水平mRNA 的高時空分辨檢測。

本研究將光響應分子2-硝基芐基嵌入四面體框架核酸內，構建了一種紫外光照遠程操控的新型光敏探針，用于任意時間點活細胞內靶標mRNA 分布的檢測。溶液中存在靶標時，探針熒光強度可由光照時間程序性控制。光敏四面體框架核酸在溶液中能檢測濃度低至約1 nmol/L 的靶標DNA，并可在紫外光照下實現(xiàn)活細胞內反應起點可控的mRNA 檢測。本研究構建的光敏四面體框架核酸在活細胞內mRNA的高時空分辨監(jiān)測方面具有巨大的應用潛力。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LUYOR-365L 型紫外手電筒（美國路陽中國公司）；UV-2600 紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；PTC-200 型PCR 儀（美國MJ Research 公司）；凝膠電泳成像儀（美國Bio-Rad 公司）；FS5 熒光分光光度計（英國愛丁堡公司）；SP8 激光共聚焦熒光顯微鏡（德國萊卡公司）。

磷酸鹽緩沖液（PBS，0.2 mol/L， 中國上海生工生物工程公司）；5 × TBE 緩沖液（tris-硼酸，EDTA，上海生工生物工程公司）；胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；人乳腺癌細胞系MCF-7（上海細胞庫）。所用DNA 序列如表1 所示，均采用高效液相法純化（上海生工生物工程公司）。

表1 本研究中使用的DNA序列Table 1 DNA sequences used in this work

1.2 實驗方法

1.2.1 光敏四面體框架核酸的合成

將單鏈DNA 溶解，用紫外-可見分光光度計測量260 nm 處吸收值，計算濃度，并稀釋至100 μmol/L。根據(jù)文獻[4]，將形成四面體結構的4 條單鏈S1～S4 與光響應莖環(huán)結構PC-LOOP 在10 mmol/L PBS 溶液中等比例混合，配制成終濃度為1 μmol/L 的溶液，將其放入PCR 儀中，95 ℃加熱10 min，然后降溫至4 ℃并保持10 min 以上，即得到光敏四面體框架核酸結構。

1.2.2 凝膠電泳表征

用1×TBE 緩沖液配制10%（m/V）聚丙烯酰胺凝膠。將制備好的光敏四面體框架核酸和四面體、雙鏈、單鏈DNA 形成的對照結構加至凝膠上樣口，80 V 恒電壓電泳2 h。電泳結束后，凝膠在Gelred 染料中浸泡15 min， 然后置于凝膠成像儀中拍照。

1.2.3 光敏四面體框架核酸對紫外光的響應

在10 nmol/L 靶標DNA 存在下，50 nmol/L 光敏四面體框架核酸用365 nm 紫外光（光強密度7000 μW/cm2）照射30 s， 然后用熒光分光光度計動力學模式監(jiān)測熒光變化2 min， 再用紫外光照射30 s，測定熒光強度變化，如此交替進行7 次。此外，在560 nm 光激發(fā)下，用發(fā)射模式監(jiān)測不同光照時間下570～620 nm 的熒光強度。

1.2.4 溶液中不同濃度靶標DNA的檢測

將50 nmol/L 光敏四面體框架核酸與不同濃度的靶標DNA 混合，用365 nm 紫外光照射樣品3 min。樣品在室溫下反應1 h 后，用發(fā)射模式檢測熒光強度。對于TAMRA 基團，采用560 nm 光激發(fā)，發(fā)射范圍570～620 nm， 記錄峰位于585 nm 處的熒光強度。對于FAM 基團，采用488 nm 光激發(fā)，發(fā)射范圍500～560 nm， 記錄520 nm 處的熒光強度。

1.2.5 光敏四面體框架核酸穩(wěn)定性測試

將1 μmol/L 光敏四面體框架核酸與等體積的含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基孵育不同時間，然后采用電泳表征納米結構的穩(wěn)定性。

1.2.6 細胞培養(yǎng)及激光共聚焦成像

將MCF-7 細胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細胞分散在一次性培養(yǎng)皿中，置于37 ℃含5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育12 h。細胞用PBS 緩沖液洗3 次，然后用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋光敏四面體框架核酸（100 nmol/L），37 ℃孵育6 h。PBS 緩沖液洗3 次后，加入新鮮培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡63×物鏡對細胞成像。用365 nm 紫外光照細胞3 min，然后將細胞置于培養(yǎng)箱中孵育30 min，采用激光共聚焦顯微鏡成像。對于TAMRA 基團，采用561 nm 光激發(fā)，測量570～685 nm 的熒光光譜。對于FAM 基團，采用488 nm 光激發(fā)，測量493～560 nm 的熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

如圖1A 所示，光敏四面體框架核酸由四面體DNA 納米結構與光響應的莖環(huán)結構（PC-LOOP）雜交形成。其中，四面體的1 個頂點延伸出15 個堿基（與莖環(huán)結構的延長處互補），并在末端標記淬滅基團（BHQ2）；莖環(huán)結構的莖與環(huán)之間以光響應分子（2-硝基芐基，PC linker）連接，環(huán)與剩余的莖設計成靶標序列的互補序列，并在末端標記熒光基團（TAMRA）。選擇與腫瘤增殖相關的MnSOD mRNA 為模型靶標。四面體框架核酸與莖環(huán)結構雜交形成光敏四面體框架核酸，熒光基團和淬滅基團距離靠近，發(fā)生能量共振轉移，探針的熒光被淬滅。當其進入細胞后，在無紫外光輻照背光下，莖環(huán)結構具有良好的熱力學穩(wěn)定性（ΔG=-30.12 kJ/mol，NUPACK 計算），光敏四面體框架核酸不能與靶標mRNA 發(fā)生雜交反應而處于“潛伏”狀態(tài)。如圖1B 所示，在紫外光照射下，硝基芐基接頭發(fā)生裂解（圖2），莖環(huán)結構被破壞，形成具有Toehold 的DNA 雙鏈，與靶標mRNA 發(fā)生Toehold 介導的鏈取代反應。因此，通過紫外光照可以實現(xiàn)細胞內mRNA 的檢測。

圖1 （A）光敏四面體框架核酸（tFNA）自組裝示意圖；（B）光敏tFNA 用于細胞內mRNA 可控檢測原理圖Fig.1 (A) Illustration of the assembly of photoresponsive tetrahedral framework nucleic acids (tFNA);(B) Illustration of the photoresponsive tFNA for detection of mRNA in living cells with temporal control

圖2 （A）光敏莖環(huán)結構在紫外光照下被破壞，暴露出立足點；（B）插在莖環(huán)中的光敏連接器結構和光切反應Fig.2 (A) Upon UV irradiation, the structure of stem-loop is destroyed, exposing the toehold; (B) Chemical structure and principle of photo cleavage of linker incorporated in stem-loop

2.2 光敏四面體框架核酸合成和表征

將5 條DNA 按照等物質的量（等摩爾）混合，通過一步法退火合成了光敏四面體框架核酸（tFNA），并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳表征。如圖3 所示，隨著DNA 鏈條數(shù)增加，形成結構的泳動速率逐漸降低，tFNA 在泳道的遷移速率最慢（Lane 6），說明光敏四面體框架核酸合成成功，并且產(chǎn)率大于85%。

圖3 （A）光敏tFNA 的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，泳道1 是20 bp 的DNA marker；（B）A 圖中泳道2～6中條帶強度和遷移位置的定量分析Fig.3 (A)Native polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the assembly of photoresponsive tFNA,Lane 1 is 20 bp Marker; (B) Quantitative analyses of migration and intensity of each band in lanes 2-6 in Fig.3A

2.3 傳感器可行性驗證

考察了光敏四面體框架核酸在溶液中對靶標DNA 的響應情況（圖4A）。當溶液中只有光敏tFNA時，溶液的熒光較弱；加入靶標DNA后溶液熒光無明顯增加，說明莖環(huán)結構的熱力學性能穩(wěn)定，無法與靶標發(fā)生雜交反應；用紫外光繼續(xù)照射溶液30 s 后，溶液的熒光增強為原來的2 倍以上（圖4B），說明光敏四面體與靶標DNA 雜交反應可以通過紫外光照觸發(fā)。當溶液中存在靶標DNA 但無紫外光照時，即使反應進行1 h， 熒光變化率F/F0（F為任意時刻溶液的熒光，F(xiàn)0為溶液的初始熒光）穩(wěn)定在1 左右（圖4C），表明光敏tFNA 在無紫外光照下無法與靶標結合。通過實時測定溶液熒光變化可以發(fā)現(xiàn)，在靶標不存在條件下，紫外光照3 min，F(xiàn)/F0基本不變；加入10 nmol/L 靶標DNA 并光照30 s 后，F(xiàn)/F0迅速增加（圖4D），即光敏tFNA 對靶標響應需要紫外光引發(fā)。光敏tFNA 溶液進行紫外光照后，加入非特異性DNA，溶液的熒光無明顯變化，說明光敏tFNA 對紫外光響應具有靶標特異性。上述實驗結果表明，此傳感器的檢測原理是可行的。

圖4 （A）溶液中光敏tFNA 檢測靶標DNA 示意圖；（B）光敏tFNA 在不同條件下的熒光光譜曲線；（C）在靶標存在和無紫外光照射下，實時監(jiān)測光敏tFNA 熒光變化率（F/F0）的變化，內插圖為與靶標反應1 h前后溶液的熒光光譜曲線；（D）實時監(jiān)測光敏tFNA 的F/F0 在不同條件下的變化；（E）在紫外光照射下，光敏tFNA 與非特異性DNA 反應前后的熒光光譜曲線Fig.4 (A) Illustration of the photoresponsive tFNA for detection of the target DNA in buffer solution;(B) Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA in different conditions; (C) Real-time monitoring of changes of fluorescence (F/F0) in the presence of target DNA but without UV irradiation, inset shows the representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA before and after incubation with target molecule for 1 h; (D) Real-time monitoring of changes of F/F0 in different conditions; (E) Representative fluorescence spectra of the photoresponsive tFNA before and after incubation with random DNA under UV irradiation

2.4 紫外光照時間的優(yōu)化

光敏四面體框架核酸對靶標DNA 的響應是由紫外光照引發(fā)的，光照強度對探針活性具有重要影響，靶標DNA 存在時，固定紫外光強密度，控制光照時間，研究體系熒光變化。采用紫外光照射（固定30 s）和關、閉交替的方式，實時監(jiān)測溶液的F/F0的變化。如圖5A 所示，隨著光照次數(shù)增加，F(xiàn)/F0先增大，當?shù)? 次光照時，F(xiàn)/F0最大，之后保持穩(wěn)定。因此，可通過光照時間程序性控制光敏四面體框架核酸的活性。記錄不同的紫外光照時長激發(fā)后體系的熒光光譜。如圖5B 所示，當10 nmol/L 靶標DNA 存在時，隨著紫外光照從5 s 延長到200 s，熒光強度不斷增強，并在200 s 時達到飽和。此結果與實時熒光監(jiān)測的結果一致，表明光敏四面體框架核酸可被遠程控制的光照強度程序性激活，并且光照3 min 即可在靶標存在時使信號達到最大值。后續(xù)實驗選擇紫外光照3 min，光密度7000 μW/cm2。

圖5 （A）靶標DNA 存在時，通過精確控制紫外光打開和關閉狀態(tài)，實時監(jiān)測光敏tFNA 的F/F0 的變化；（B）靶標DNA（10 nmol/L）存在時，不同光照時間的光敏tFNA 的熒光光譜Fig.5 (A) Real-time monitoring of the changes of F/F0 by precise control of UV irradiation state (on or off) in the presence of target DNA;(B)Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA in the presence of target DNA (10 nmol/L) at different UV irradiation time

2.5 傳感器的分析性能

考察了光敏四面體框架核酸對溶液中模擬mRNA（即同序列的DNA）的檢測性能。如圖6A 所示，紫外光激活后，隨著靶標DNA 濃度增加，熒光強度先逐漸增強后趨于穩(wěn)定。熒光峰（585 nm）強度與靶標DNA 濃度的關系如圖6B 所示，檢測靶標DNA 濃度的線性范圍為1.64～25 nmol/L，線性方程為F585=3007.9+521.7C（R2=0.992，n=3），檢出限為1.64 nmol/L（3σ）。與其它基于四面體DNA 納米結構檢測DNA的方法相比[35]，光敏tFNA 具有更高的靈敏度。

圖6 （A）紫外光照射后，光敏tFNA 對溶液中不同濃度靶標DNA 響應的熒光光譜；（B）585 nm 處熒光強度與靶標DNA 濃度的關系曲線，內插圖為線性曲線；（C）紫外光照射后，光敏tFNA 對相同濃度的靶標DNA（包括完全互補序列、單堿基錯配和雙堿基錯配序列）響應的熒光曲線，未加靶標DNA 的樣品作為對照組；（D）光敏tFNA 與培養(yǎng)基孵育不同時間的凝膠電泳圖，泳道1 為含有tFNA 的緩沖溶液，泳道2～8 分別為孵育0、1、2、4、12、24 和36 h 的tFNAFig.6 (A)Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA responding to various concentrations of target DNA in buffer after UV irradiation;(B)Fluorescence intensity at 585 nm vs concentration of target DNA,the inset is the calibration cueve;(C)Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA responding to the same concentration of various targets after UV irradiation, including perfect matched, single base mismatched, and two base mismatched targets, the group without target DNA is set as the control; (D) Native polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the photoresponsive tFNA mixed with DMEM for different time.Lane 1 is tFNA in buffer, and lanes 2-8 correspond to different mixed time (0, 1, 2, 4, 12, 24 and 36 h),respectively

采用光激活的光敏tFNA 分別對完全互補配對（Perfect matched）、單堿基錯配（Single base mismatched）和雙堿基錯配（Two bases mismatched）DNA 序列進行檢測。結果表明，只有與完全互補配對的靶標DNA反應后，熒光才會明顯增強（圖6C），這說明光敏tFNA 對靶標識別具有良好的特異性。

探針在復雜環(huán)境的穩(wěn)定性是進行細胞內檢測的重要前提。將光敏tFNA 與等體積的含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基孵育，并用凝膠電泳表征，考察不同孵育時間下的探針穩(wěn)定性。如圖6D 所示，隨著孵育時間延長，四面體框架核酸依然能保持穩(wěn)定，即使孵育36 h，也僅有非常少量的四面體框架核酸發(fā)生降解。這表明在培養(yǎng)基中，光敏tFNA 結構可保持穩(wěn)定至少36 h， 可用于細胞內mRNA 的檢測。

2.6 活細胞內mRNA的光控檢測

光敏四面體框架核酸與乳腺癌（MCF-7）細胞孵育6 h 后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察明場成像和561 nm 發(fā)射波長下的熒光成像。如圖7A-a 所示，TAMRA通道未出現(xiàn)熒光。采用紫外光照射3 min，再將細胞孵育0.5 h 后，細胞內出現(xiàn)明顯的TAMRA 紅色熒光信號（圖7A-b）。本實驗條件下的紫外光照對細胞活性無明顯影響（圖7B）。飛秒雙光子激光可以提供更好的三維空間定位，增加成像深度[25]，在時間和空間上控制光敏tFNA 的激活。利用雙光子激光（740 nm）照射指定的細胞，可在單細胞水平上選擇性地激活指定細胞（圖7A-c）。這說明光敏tFNA 無需轉染試劑即可進入細胞，并且只有在紫外光下才能激活探針，實現(xiàn)細胞內mRNA 時空可控的檢測。

圖7 （A） MCF-7 細胞與光敏tFNA 孵育的激光共聚焦顯微鏡圖：TAMRA通道、與明場疊加通道分別在（a）無紫外光照、（b）紫外光照射和（c）雙光子激光選擇性紫外光照條件下的共聚焦圖，標尺為20 μm；（B） MTT 法檢測不同條件下MCF-7 細胞的活性：單獨培養(yǎng)基、加3 min 紫外光照、培養(yǎng)基加光敏tFNA、培養(yǎng)基加光敏tFNA 及3 min 紫外光照Fig.7 (A)Confocal laser microscopy images of MCF-7 cells incubated with the photoresponsive tFNA,images of the TAMRA channel and the overlap under the conditions of (a) without UV irradiation, (b) with UV irradiation,and(c)selectively activated by two-photon laser,scale bar is 20 μm;(B)MTT assays of MCF-7 cells treated with the culture medium,3 min of UV irradiation photoresponsive tFNA and photoresponsive tFNA with UV irradiation, respectively

2.7 傳感器的普適性

基于DNA 精準的堿基互補配對方式，設計了針對另一個靶標mRNA（GAPDH）的光敏tFNA，分別用FAM 和Dabcly 標記莖環(huán)結構和四面體結構，驗證本傳感器的普適性。在靶標DNA 存在和紫外光照下，光敏tFNA 的熒光強度明顯增強（圖8A）。熒光動力學監(jiān)測結果表明，靶標不存在時，紫外光照3 min，熒光無明顯增加；加入靶標DNA后，熒光增強約1 倍（圖8B）。這說明針對GAPDH mRNA 的光敏tFNA 與靶標發(fā)生雜交反應受紫外光調控，與前面檢測MnSOD mRNA 的探針一致。檢測了溶液中不同濃度靶標DNA 的熒光強度，在紫外光激活下，體系熒光強度隨著靶標濃度的增加而增強（圖9A），GAPDH DNA 的檢出限為1.41 nmol/L（3σ）（圖9B），與前面光敏tFNA 對mRNA 的檢測結果相符，說明光敏tFNA 傳感器具有較高靈敏度。

圖8 （A）光敏tFNA 在紫外光照和靶標DNA 存在下的熒光增強；（B）實時監(jiān)測光敏tFNA 的F/F0 在不同條件下的變化Fig.8 (A) Upon UV irradiation, the enhancement of fluorescence intensity of photoresponsive tFNA in the presence of target DNA; (B) Real-time monitoring of the changes of F/F0 under different conditions

圖9 光敏tFNA 傳感器普適性驗證:（A）紫外光照射后，光敏tFNA 對溶液中不同濃度靶標DNA（GAPDH）響應的熒光光譜曲線；（B）520 nm 處熒光強度與靶標DNA 濃度的校正曲線，內插圖是靶標DNA 濃度在0～30 nmol/L 范圍內與熒光強度的線性曲線；FAM 通道、與明場疊加通道分別在（C）無紫外光照和（D）紫外光照條件下的共聚焦圖;（E）TAMRA通道、FAM 通道、與明場疊加通道在紫外光照條件下的共聚焦圖，標尺為20 μmFig.9 Verification of the generality of the proposed sensor: (A) Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA responding to various concentrations of target DNA (GAPDH) in buffer after UV irradiation;(B)Corresponding calibration plot of the fluorescence intensity at 520 nm vs concentration of target DNA,the inset indicates the linear fitting for different target concentrations from 0 to 30 nmol/L;Images of FAM channel and the overlap(C)without UV irradiation,and(D)with UV irradiation;(E)Images of TAMRA channel,FAM channel and the overlap under the condition of UV irradiation. Scale bar is 20 μm

將此光敏tFNA 用于檢測活細胞內靶標GAPDH mRNA。如圖9C 所示，F(xiàn)AM 通道未出現(xiàn)明顯熒光。采用紫外光照射細胞3 min，再孵育0.5 h，細胞內出現(xiàn)明顯的FAM 綠色熒光信號（圖9D）。將MnSOD 和GAPDH mRNA 的兩種光敏tFNA 等比例混合，并與MCF-7 孵育，經(jīng)紫外光激活后，再將細胞孵育0.5 h，用共聚焦顯微鏡成像。如圖9E 所示，兩個通道都出現(xiàn)熒光信號，說明光敏tFNA 可用于細胞內兩種mRNA 的同時檢測，這證明了光敏tFNA 對細胞內mRNA 的可控檢測具有普適性。

3 結論

構建了一種光響應的四面體框架核酸探針，此探針具有四面體框架核酸的結構穩(wěn)定性以及免轉染試劑進入細胞的優(yōu)點，還具有光敏分子遠程時空可控激活的優(yōu)點。通過遠程紫外光照可以程序性激活四面體框架核酸的活性，控制識別靶標的起始時間；在最佳光照條件下，探針可在溶液中檢出低至1 nmol/L的靶標DNA。光敏tFNA 檢測活細胞內靶標mRNA 可由光照控制，具有高時空可控性以及檢測任意時間點mRNA 分布的潛力，為研究mRNA 的轉錄和降解等行為提供了新方法。