洋甘菊總黃酮體外抗腫瘤活性研究

龍 婷,波拉提·馬卡比力,蘭 衛(wèi)*,王 瑩

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,新疆 烏魯木齊 830004;3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830002)

癌癥是全球死亡率最高的疾病之一,其特征是由于啟動劑的作用導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)制異常或 DNA 突變,從而導(dǎo)致細(xì)胞不受控制異常生長[1]。多種強(qiáng)效合成抗癌藥物被用于臨床治療癌癥,在殺死腫瘤細(xì)胞的同時對正常細(xì)胞的毒副作用較嚴(yán)重,此外腫瘤細(xì)胞也易產(chǎn)生耐藥性。研究表明,可通過單獨或組合使用天然化合物來克服抗癌藥物相關(guān)的不良反應(yīng)[2],其中針對黃酮類化合物的研究較多[3]。

洋甘菊(MatricariachamomiliaL.),又稱母菊,維藥名巴木乃,是菊科植物德國洋甘菊的干燥全草或花序,采收于夏秋季,是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和民間常用藥材之一[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,洋甘菊具有抗腫瘤[5]、抗病毒、氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)、抗焦慮、抗抑郁[6]、降血糖血脂[7-8]、抑菌等作用。目前,關(guān)于洋甘菊抗腫瘤活性的研究報道較少?；诖?作者采用CCK-8法研究洋甘菊總黃酮(MCTF)對人肺癌細(xì)胞A549、人胃癌細(xì)胞 AGS、人宮頸癌細(xì)胞HeLa及SiHa、人食管癌細(xì)胞 Eca-109及TE-1、人肝癌細(xì)胞HepG2體外增殖的抑制作用,并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測洋甘菊總黃酮對SiHa細(xì)胞周期分布及凋亡率的影響,為后續(xù)進(jìn)一步探究洋甘菊抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

洋甘菊,經(jīng)鑒定為德國洋甘菊的干燥全草。人肺癌細(xì)胞A549、人胃癌細(xì)胞AGS、人宮頸癌細(xì)胞HeLa及SiHa、人食管癌細(xì)胞Eca-109及TE-1、人肝癌細(xì)胞HepG2,均由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院提供。

0.25%胰蛋白酶(批號 2186974)、胎牛血清(FBS,批號70101002),美國Gibco公司;DMEM培養(yǎng)基(批號SH30022.01)、磷酸鹽緩沖液(PBS,批號SV30010),美國Hyclone公司;青霉素+鏈霉素雙抗(批號Bj111995904),Biosharp公司;二甲基亞砜(DMSO,批號EZ6789B127),德國BioFroxx公司;細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(CCK-8,批號BA00208),北京博奧森生物技術(shù)有限公司;周期檢測試劑盒(PI,批號40301ES60),翊圣生物公司;凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC,批號AO2001-02P-G),天津三箭生物技術(shù)公司。

SW-XJ-2F型超凈臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;371型直熱式CO2恒溫培養(yǎng)箱,Thermo公司;TDL-5-A型低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;IX71-5-12FL/PH型倒置熒光三目顯微鏡,Roperscientific公司;Benchmurk PLUS型全波長酶標(biāo)儀,Bio-Rad公司;TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡,德國Leica公司;AB104-N型電子分析天平,上海Mettler-Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 MCTF的提取

在課題組前期研究[9]的基礎(chǔ)上,取適量洋甘菊粉末,按料液比1∶12(g∶mL)加入70%乙醇回流提取2 h,提取3次,合并提取液,濃縮;濃縮液經(jīng)D-101/AB-8 大孔吸附樹脂純化,收集洗脫液;60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,干燥,得到含量為56%(UV)[10]的MCTF。

1.2.2 儲備液的制備

稱取MCTF約 50 mg,溶于0.5 mL DMSO中,振蕩搖勻,封口后儲存于4 ℃環(huán)境中。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

A549、AGS、HeLa、SiHa、Eca-109、TE-1和HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后分別接種于含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日換液,及時傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 MCTF抗腫瘤活性的測定

分別取對數(shù)生長期的A549、AGS、HeLa、SiHa、Eca-109、TE-1和HepG2細(xì)胞,用PBS緩沖液清洗2次,加入1 mL胰蛋白酶消化60 ～ 90 s,然后加入2～3 mL新鮮培養(yǎng)基終止消化,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,再加入1 mL DMEM培養(yǎng)基吹打均勻,制成單細(xì)胞懸液。單細(xì)胞懸液以每孔5×104個·mL-1接種至96孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,長至40%～50%時,棄培養(yǎng)基,每孔加入100 μL不同濃度(25、50、100、150、200、300、450、600,μg·mL-1)的MCTF溶液,設(shè)置正常對照組(不加MCTF溶液)和空白組(不加腫瘤細(xì)胞),每孔設(shè)置3個復(fù)孔;分別在培養(yǎng)箱中孵育24 h、48 h后,棄培養(yǎng)基,加入100 μL 10%CCK-8試劑,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h,采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm 處吸光度(OD)。按式(1)計算樣品對細(xì)胞增殖的抑制率,并通過Graphpad 軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC50),以IC50值作為評價MCTF對不同腫瘤細(xì)胞的毒性指標(biāo)。

(1)

1.2.5 SiHa細(xì)胞的分組及培養(yǎng)

SiHa細(xì)胞懸液以2×106個·mL-1接種至6孔板中,設(shè)置正常對照組、順鉑組(15 μg·mL-1)、MCTF給藥組(25、50、100,μg·mL-1),每組設(shè)置3 個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后,給藥48 h,觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 PI 單染法檢測細(xì)胞周期變化

SiHa細(xì)胞懸液以2×106個·mL-1接種至6孔板中,設(shè)置正常對照組、順鉑組(15 μg·mL-1)、MCTF給藥組(25、50,μg·mL-1),每組設(shè)置3 個復(fù)孔,貼壁24 h后,給藥24 h;棄培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗1次,胰蛋白酶消化,1 000 r·min-1離心5 min;棄上清,用PBS緩沖液再次洗滌,1 000 r·min-1離心5 min;棄去上清,加入預(yù)冷的70%乙醇0.5 mL,在-20 ℃冰箱中靜置12～24 h。 將固定好的細(xì)胞1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,用PBS緩沖液清洗2次,再加入0.5 mL PI染色液,避光染色15 min后上機(jī)檢測。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

分組及給藥方式同1.2.6方法,收集消化后的SiHa細(xì)胞懸液于對應(yīng)的EP管中,1 500 r·min-1離心5 min,棄上清并彈勻細(xì)胞;加入2 mL PBS緩沖液,離心5 min后,棄上清,重復(fù)操作2次;將細(xì)胞重懸于500 μL Binding Buffer中,分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI染色液,輕輕混勻,37 ℃避光染色10 min,并在1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,重復(fù)3次,按式(2)計算SiHa細(xì)胞總凋亡率(%):

總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率

(2)

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 MCTF對腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

用倒置顯微鏡觀察各實驗組細(xì)胞,與空白對照組相比,MCTF給藥組細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生改變,觀察到細(xì)胞密度顯著降低,且隨著MCTF濃度的增加,細(xì)胞逐漸變亮、變圓;在300 μg·mL-1、450 μg·mL-1、600 μg·mL-1濃度下,大部分腫瘤細(xì)胞均無法維持完整的細(xì)胞形態(tài)。

2.2 MCTF對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度MCTF分別作用24 h、48 h時對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率如表1所示,對腫瘤細(xì)胞的IC50值如表2所示。

表1 MCTF對不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of different tumor cells by MCTF

表2 MCTF對不同腫瘤細(xì)胞的IC50值Tab.2 IC50 values of MCTF to different tumor

從表1、表2可以看出,MCTF對7種腫瘤細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用,其中對SiHa細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),作用24 h、48 h 時,IC50值分別為(130.23±2.98) μg·mL-1、(97.74±4.02) μg·mL-1,當(dāng)MCTF濃度為200 μg·mL-1時,對SiHa細(xì)胞的抑制率高達(dá)97%以上。表明,MCTF在一定濃度范圍內(nèi)對不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用存在差異,MCTF抗腫瘤作用具有一定的選擇性和敏感性。

2.3 MCTF對SiHa細(xì)胞形態(tài)的影響

用倒置顯微鏡觀察各實驗組細(xì)胞形態(tài), 結(jié)果如圖 1 所示。

從圖1可以看出,與正常對照組比較,不同濃度的MCTF給藥組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,低劑量組(25 μg·mL-1)細(xì)胞形態(tài)接近正常對照組,但細(xì)胞密度低于正常對照組,且隨著MCTF濃度的增加,細(xì)胞密度顯著降低,細(xì)胞逐漸變亮、變圓,并出現(xiàn)破裂、空泡、聚團(tuán)、碎片等現(xiàn)象。

圖1 MCTF對SiHa細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of MCTF on morphology of SiHa cells

2.4 MCTF對SiHa細(xì)胞周期分布的影響

利用低、中劑量(25 μg·mL-1、50 μg·mL-1,下同)的MCTF干預(yù) SiHa細(xì)胞 24 h 后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,結(jié)果如圖2和表3所示。

a.正常對照組 b.25 μg·mL-1MCTF c.50 μg·mL-1MCTF

表3 MCTF對SiHa細(xì)胞周期分布的影響Tab.3 Effect of MCTF on cycle distribution of SiHa cells

從圖2、表3可以看出,相較于正常對照組,低、中劑量組細(xì)胞G0/G1期分布比例下降,S期、G2/M期分布比例上升,且具有極顯著性差異(P<0.01),說明MCTF使SiHa細(xì)胞阻滯在G0/G1期,阻斷細(xì)胞的DNA合成,停止細(xì)胞分裂,抑制細(xì)胞增殖。

2.5 MCTF對SiHa細(xì)胞凋亡率的影響

利用低、中劑量的MCTF干預(yù)SiHa細(xì)胞24 h后,考察MCTF 對SiHa細(xì)胞凋亡率的影響,結(jié)果如圖3和表4所示。

a.正常對照組 b.25 μg·mL-1MCTF c.50 μg·mL-1MCTF

表4 MCTF對SiHa細(xì)胞凋亡率的影響Tab.4 Effect of MCTF on apoptosis rate of SiHa cells

從表4可以看出,與正常對照組比較,低、中劑量的MCTF干預(yù)SiHa細(xì)胞 24 h,對細(xì)胞晚期(Q2)影響極顯著,且總凋亡率由5.88%±0.29%分別升至11.57%±0.27%、18.08%±1.63%。表明,低劑量MCTF即可誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡。

2.6 討論

洋甘菊提取物中總黃酮含量高達(dá) 6%,主要包括柚皮苷元(黃烷酮)、蘆丁(黃酮醇)、木犀草素和木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷(占總黃酮的17%)[11]。Shebbo等[12]研究發(fā)現(xiàn),洋甘菊提取物對二甲肼(DMH)誘導(dǎo)的中期階段結(jié)直腸癌小鼠肝臟有保護(hù)作用,通過降低AST和ALT水平,調(diào)節(jié)Wnt信號通路,抑制肝細(xì)胞增殖,進(jìn)而減輕肝損傷。El Joumaa等[13]研究發(fā)現(xiàn),洋甘菊提取物可有效降低DMH誘導(dǎo)的小鼠大腸癌發(fā)病率,通過調(diào)節(jié)Wnt途徑,下調(diào)Wnt5-α、β-catenin、T細(xì)胞因子(Tcf4)、Cyclin D1水平,降低COX-2 和iNOS活性來抑制腫瘤細(xì)胞增殖,而COX-2和iNOS在炎癥實驗?zāi)Ｐ秃湍[瘤生長中起著關(guān)鍵作用。聯(lián)合使用洋甘菊和納米銀(AgNPs)是治療肺癌的一種有效策略,洋甘菊水提物合成的AgNPs對A549細(xì)胞具有劑量和時間依賴性的細(xì)胞毒作用[14]。研究顯示,洋甘菊提取物對乳腺癌細(xì)胞[15](T-47D、MCF-7、MDA-MB-468)、前列腺癌細(xì)胞(LNCaP、PC-3、DU145)、結(jié)腸癌細(xì)胞(RKO)和纖維肉瘤細(xì)胞(HT1080)均有不同程度的抑制和促凋亡作用[16]。

本研究以MCTF為藥物基礎(chǔ),選取7種腫瘤細(xì)胞A549、AGS、HeLa、SiHa、Eca-109、TE-1及HepG2,探討MCTF的體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明,MCTF對7種腫瘤細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用,其中對SiHa細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。MCTF 干預(yù)SiHa細(xì)胞后,細(xì)胞形態(tài)改變,并使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,抑制細(xì)胞生長,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但本研究對MCTF抑制SiHa細(xì)胞是初步研究,后期需進(jìn)一步通過細(xì)胞相關(guān)表征(遷移、侵襲)及相關(guān)的蛋白實驗數(shù)據(jù)來支撐;關(guān)于MCTF抑制SiHa細(xì)胞的具體機(jī)制,可以基于蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、生物信息技術(shù)尋找相關(guān)的靶蛋白及對應(yīng)的通路進(jìn)行深入分析。

3 結(jié)論

采用CCK-8法研究了MCTF對人肺癌細(xì)胞A549、人胃癌細(xì)胞AGS、人宮頸癌細(xì)胞HeLa及SiHa、人食管癌細(xì)胞Eca-109及TE-1、人肝癌細(xì)胞HepG2體外增殖的抑制作用,并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了MCTF對SiHa細(xì)胞周期分布及凋亡率的影響。結(jié)果表明,與空白對照組比較,MCTF對7種腫瘤細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用,其中對SiHa細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),作用48 h的IC50值為(97.74±4.02) μg·mL-1;低、中劑量組(25 μg·mL-1、50 μg·mL-1)干預(yù)SiHa細(xì)胞24 h后,細(xì)胞阻滯在G0/G1期,總凋亡率由5.88%±0.29%分別升至11.57%±0.27%、18.08%±1.63%,說明低劑量洋甘菊總黃酮可抑制SiHa細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡。為后期MCTF抑制SiHa細(xì)胞的作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。