欒鵬仟，馮玉曉，盧滇楠，蔣國(guó)強(qiáng)，劉 錚，戈 鈞

(清華大學(xué)化學(xué)工程系工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084)

生物催化劑作為一種綠色天然催化劑，推動(dòng)了化學(xué)工業(yè)可持續(xù)發(fā)展。與傳統(tǒng)的化學(xué)催化相比，生物催化具有反應(yīng)速率快、(立體、化學(xué)、區(qū)域)選擇性高等優(yōu)勢(shì)[1-2]。然而，目前兩個(gè)關(guān)鍵的瓶頸阻礙了酶催化在工業(yè)上的規(guī)模化應(yīng)用：一是天然酶的穩(wěn)定性不足，難以在工業(yè)要求的環(huán)境下長(zhǎng)期維持活性；二是天然酶催化的反應(yīng)類(lèi)型較為受限，許多反應(yīng)難以找到匹配的酶來(lái)進(jìn)行催化[3-5]。

借助納米材料對(duì)酶分子進(jìn)行固定化，能夠改善天然酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，使其滿足工業(yè)應(yīng)用的要求[6-7]。利用催化功能豐富的金屬原子對(duì)天然酶進(jìn)行改造，構(gòu)建酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑，能夠賦予酶新的催化活性，達(dá)到拓展酶催化反應(yīng)類(lèi)型的效果[8-9]。經(jīng)過(guò)十幾年的研究，研究者們根據(jù)不同天然酶的需求，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一系列高活性、高穩(wěn)定性、高重復(fù)使用性的固定化酶方案，建立了酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑的設(shè)計(jì)方法，并構(gòu)建了一系列具有級(jí)聯(lián)催化性能的酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑。

本文重點(diǎn)介紹酶納米凝膠、酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物和酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑方面的研究進(jìn)展，并分析探討該領(lǐng)域在未來(lái)發(fā)展中所面臨的問(wèn)題與挑戰(zhàn)。

1 酶納米凝膠

利用載體固定化天然酶雖然能夠提升其穩(wěn)定性，但同時(shí)也會(huì)妨礙酶構(gòu)象的轉(zhuǎn)變和底物與產(chǎn)物的傳輸，導(dǎo)致酶分子不能展現(xiàn)出應(yīng)有的活性。Yan等[10]對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)進(jìn)行表面丙烯?；x予酶表面更多的乙烯基，獲得酶-高分子配合物；隨后在丙烯酰胺、交聯(lián)劑和引發(fā)劑的作用下，在室溫進(jìn)行納米凝膠的原位水相聚合(圖1(a))，制備的納米凝膠具有很好的可滲透性，且證實(shí)每個(gè)凝膠中只含有一個(gè)酶-高分子絡(luò)合物，封裝率高達(dá)92%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，固定化前后催化劑的Kcat與km基本沒(méi)有發(fā)生變化，巧妙地解決了載體帶來(lái)的傳質(zhì)問(wèn)題。在穩(wěn)定性方面，納米凝膠封裝的單酶具有更好的熱穩(wěn)定性和溶劑耐受性，在60 ℃緩沖溶液中處理90 min或在60 ℃的甲醇溶液中處理10 min，納米凝膠封裝的酶活能維持在80%以上，而天然酶的活性基本已喪失。在此基礎(chǔ)上，Wang等[11]結(jié)合底物印跡技術(shù)，在凝膠中加入底物分子，冷凍干燥后通過(guò)有機(jī)溶劑萃取掉底物分子，成功將印跡結(jié)構(gòu)固定在凝膠層內(nèi)部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用該方法顯著提高了納米凝膠對(duì)底物的親和性，與未印跡的酶分子納米凝膠相比，表觀活性提高了40%。

圖1 酶納米凝膠與酶氧化石墨烯氣凝膠的構(gòu)建與反應(yīng)過(guò)程強(qiáng)化Fig.1 Construction and reaction process enhancement of enzyme nanogel and enzyme graphene oxide aerogel

與傳統(tǒng)的液相酶催化相比，氣相酶催化具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如反應(yīng)物擴(kuò)散速率快(尤其當(dāng)?shù)孜餅闅怏w時(shí))、無(wú)須添加溶劑、催化劑易于回收和再利用等。但是，無(wú)水的環(huán)境同樣影響著酶分子的活性與穩(wěn)定性，嚴(yán)重限制了氣相酶催化的發(fā)展速度。因此，如何在無(wú)水的環(huán)境下?tīng)I(yíng)造出水相，為酶分子提供濕潤(rùn)的微環(huán)境成為解決問(wèn)題的關(guān)鍵。Xu等[12]借助富含羥基的氧化石墨烯(GO)氣凝膠作為固定化酶載體，通過(guò)提供類(lèi)似水的微環(huán)境，在無(wú)水氣體流動(dòng)過(guò)程中保持酶的活性和穩(wěn)定性：首先將脂肪酶和氧化石墨烯溶液在pH 3.3下混合，搖勻形成脂肪酶氧化石墨烯水凝膠；然后將水凝膠在-40 ℃冷凍干燥50 h，得到脂肪酶氧化石墨烯氣凝膠(圖1(b))；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與凍干的脂肪酶相比，被GO固定的脂肪酶的表觀活性提升5～10倍，并且在酯交換反應(yīng)中的初始酶活能夠維持500 h。同時(shí)，固態(tài)圓二色性測(cè)定證實(shí)了親水、柔性和多孔的載體在高溫下可穩(wěn)定脂肪酶的天然構(gòu)象；分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算結(jié)果和熱重分析表明，脂肪酶活性所必需的水分子可以被氧化石墨烯表面的羥基所取代[13]。

2 酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物

無(wú)機(jī)晶體具備良好的剛性結(jié)構(gòu)，能夠很好地穩(wěn)定酶分子不受外界環(huán)境破壞，是固定化酶載體非常重要的一類(lèi)分支。Ge等[14]基于共沉淀機(jī)制，將含有酶分子的磷酸鹽緩沖溶液與CuSO4溶液混合，利用酶分子的誘導(dǎo)成核作用，成功將酶分子包埋在無(wú)機(jī)晶體中，首次合成出花狀結(jié)構(gòu)的含酶無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制備的漆酶-磷酸銅復(fù)合物活性是游離漆酶的5～7倍，且在水溶液中放置60 d，活性仍能維持在95%以上。該工作得到了研究者們的廣泛關(guān)注，并延伸出一系列基于共沉淀法制備酶-無(wú)機(jī)晶體復(fù)合物的成果[15-21]。如，Li等[22]在制備酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物的過(guò)程中引入高分子聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這能夠進(jìn)一步提升酶分子的穩(wěn)定性與催化活性。在此基礎(chǔ)上，Li等[23]在共沉淀過(guò)程中加入雙酶，通過(guò)反應(yīng)流程控制實(shí)現(xiàn)了雙酶分隔式固定化(葡萄糖脫氫酶分布在酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物的外部，辣根過(guò)氧化物酶分布在酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物的內(nèi)部)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物不僅增強(qiáng)了2種酶分子的穩(wěn)定性，還提升了雙酶級(jí)聯(lián)催化活性。酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物除了能夠提升酶分子的穩(wěn)定性與活性之外，晶體中的金屬離子還能賦予復(fù)合物全新的催化性能。Li等[24]以水膽礬[Cu4(OH)6SO4]作為無(wú)機(jī)組分制備酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合物具有抗菌活性，它的抗菌性能與CuO的效果接近，暴露300 min后僅有約104個(gè)細(xì)胞存活，表現(xiàn)出較為出色的抗菌效果。

金屬-有機(jī)骨架(metal-organic frameworks,MOFs)材料是由金屬離子或團(tuán)簇和有機(jī)配體通過(guò)配位鍵結(jié)合而成的有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化且具有周期性的多孔道復(fù)合結(jié)構(gòu)，因其豐富的孔結(jié)構(gòu)、高比表面積和易功能化修飾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于氣體捕集、多相催化、藥物遞送和酶固定化等領(lǐng)域[25-34]。MOFs材料固定化酶的方法分為3類(lèi)：①酶吸附在預(yù)先合成的MOFs材料孔道中[35-39]；②酶共價(jià)結(jié)合在預(yù)先合成的MOFs材料表面或孔道中[40-41]；③共沉淀原位合成酶-MOFs材料復(fù)合物[42-46]。其中，共沉淀固定化方式無(wú)須預(yù)先合成MOFs材料，簡(jiǎn)化了制備流程。在通常情況下，采取共沉淀方式固定化酶的負(fù)載量要高于其他2種方式，且在使用的過(guò)程中酶分子不易脫落。

Lyu等[47]將高分子修飾的細(xì)胞色素c與合成MOFs材料的有機(jī)配體預(yù)先混合，隨后添加到含有金屬離子的甲醇溶液中，通過(guò)共沉淀法實(shí)現(xiàn)酶分子在MOFs材料自組裝過(guò)程中的原位包埋(圖2(a))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與游離的細(xì)胞色素C相比，制得的酶-MOFs材料復(fù)合物的活性提升了10倍，并且可方便、快速且高靈敏度地檢測(cè)溶液中痕量爆炸性有機(jī)過(guò)氧化物。Wu等[48]為了進(jìn)一步提升酶-MOFs材料復(fù)合物的穩(wěn)定性與重復(fù)使用性，利用聚多巴胺對(duì)酶-MOFs材料復(fù)合物進(jìn)行包裹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚多巴胺包裹的酶-MOFs材料復(fù)合物具備超高的重復(fù)使用性能，重復(fù)使用10次后，酶活無(wú)明顯降低的趨勢(shì)。Wu等[49]通過(guò)在共沉淀過(guò)程中添加雙酶，開(kāi)發(fā)了在25 ℃水溶液中一步合成多酶-MOFs材料復(fù)合物的策略，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MOFs材料支架的剛性結(jié)構(gòu)極大地提高了雙酶的熱穩(wěn)定性，同時(shí)屏蔽了蛋白酶的水解作用；激光共聚焦顯微鏡結(jié)果證實(shí)，葡萄糖氧化酶(GOx)傾向于分布在顆粒外部，而HRP則分布在顆粒內(nèi)部，這種分區(qū)包埋帶來(lái)的雙酶鄰近和區(qū)域化效應(yīng)提高了雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中間產(chǎn)物的局部濃度和利用效率，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖的快速、高靈敏檢測(cè)。

圖2 一步共沉淀酶-MOFs材料復(fù)合物與酶-無(wú)定形MOFs材料復(fù)合物的構(gòu)建與反應(yīng)過(guò)程強(qiáng)化Fig.2 Construction and reaction process enhancement of enzyme-MOFs complexe and enzyme-amorphous MOFs complexes with one step co-precipitation

Feng等[35]制備了一系列不同尺寸的有機(jī)配體，利用Zr與有機(jī)配體結(jié)合，成功制備了具有不同孔徑的MOFs材料，將其中的PCN-333固定多種蛋白后發(fā)現(xiàn)、表觀米氏常數(shù)降低，表明對(duì)底物親和性增強(qiáng)；同時(shí)，在經(jīng)有機(jī)溶劑處理后和多次使用后，固定化酶的活性均明顯優(yōu)于游離酶。在此基礎(chǔ)上，Lian等[38]結(jié)合有機(jī)配體設(shè)計(jì)方案開(kāi)發(fā)了新的MOFs材料，使MOFs材料上同時(shí)具備3種不同尺寸的孔徑(其中大孔能容納1個(gè)GOx；中孔僅能容納1個(gè)HRP，無(wú)法容納GOx；小孔無(wú)法容納蛋白)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，尺寸較小的辣根過(guò)氧化物酶可以進(jìn)入2種尺寸的孔徑，而尺寸較大的GOx只能進(jìn)入大孔徑的孔道。Lian等[51]利用MOFs材料將酶遞送進(jìn)胞內(nèi)，構(gòu)建胞內(nèi)酶催化體系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。Shieh等[46]和Liao等[52]在水相和常溫的條件下，通過(guò)一鍋法將過(guò)氧化氫酶共沉淀負(fù)載于ZIF-90中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)尿素處理后，固定化酶仍保留很高的酶活，這是因?yàn)橹频玫墓潭ɑ改軌蛴行?duì)抗酶變性劑對(duì)蛋白質(zhì)的去折疊作用，對(duì)內(nèi)部的酶分子具有明顯的保護(hù)作用。Yang等[53]嘗試?yán)靡诲伔ㄗ越M裝將Cas9 RNP負(fù)載于ZIF-90中，成功實(shí)現(xiàn)了HeLa細(xì)胞中的基因編輯。Liang等[54]發(fā)現(xiàn)，在使用不同親疏水性的MOFs材料對(duì)酶進(jìn)行固定時(shí)，對(duì)固定化酶的活性和穩(wěn)定性有顯著的差異性：當(dāng)使用親水性MAF-7時(shí)，其包埋酶的活性與游離酶的活性接近；親水性的MAF-7或ZIF-90包裹的酶即使暴露在高溫、變性劑、蛋白水解劑以及有機(jī)溶劑中也能保持活性，而疏水性的ZIF-8對(duì)脲酶的保護(hù)作用甚微。

因?yàn)榫B(tài)MOFs材料內(nèi)部孔道較小，所以底物分子在酶催化過(guò)程中存在傳質(zhì)阻力，難以實(shí)現(xiàn)與晶體中的酶分子高效接觸，從而降低了酶催化劑的表觀活性。對(duì)MOFs材料進(jìn)行改性，構(gòu)建一定程度的缺陷能夠達(dá)到豐富MOFs材料孔道結(jié)構(gòu)的效果。合成后預(yù)處理法和從頭合成法是2種構(gòu)建MOFs材料缺陷的有效策略。合成后處理法是指使用改性配體、蝕刻劑或其他苛刻的活化程序(如熱活化、等離子體活化等)對(duì)預(yù)先合成的MOFs材料進(jìn)行處理，從而實(shí)現(xiàn)缺陷MOFs材料的合成[55-59]。從頭合成法是指設(shè)計(jì)及優(yōu)化MOFs材料的合成條件在合成的過(guò)程中引入缺陷結(jié)構(gòu)。溶劑的種類(lèi)、調(diào)節(jié)劑的類(lèi)型、調(diào)節(jié)劑的加入量和晶體的生長(zhǎng)速率等參數(shù)都會(huì)直接影響MOFs材料的改性和缺陷的產(chǎn)生。

目前，最常用的方法是在有機(jī)配體中添加調(diào)節(jié)劑[60-64]。Liu等[64]利用鋯基金屬有機(jī)骨架材料HP-PCN-224(Fe)來(lái)構(gòu)建一個(gè)模擬多酶系統(tǒng)，通過(guò)引入十二烷酸作為調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)缺陷形成得到HP-PCN-224(Fe)的多級(jí)孔結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：十二烷酸的加入量對(duì)于介孔的形成和MOFs材料的形貌影響很大，當(dāng)十二烷酸與ZrCl4的摩爾比值為125時(shí)，HP-PCN-224(Fe)的酶負(fù)載量可達(dá)到192.6 mg/g；HP-PCN-224(Fe)中的金屬卟啉結(jié)構(gòu)使其具備本征過(guò)氧化物酶活性，可以與GOx級(jí)聯(lián)用于葡萄糖檢測(cè)，當(dāng)葡萄糖濃度為5～300 μmol/L時(shí)，生物傳感器具有良好的線性響應(yīng)，檢測(cè)限為0.87 μmol/L；將尿酸酶固定在HP-PCN-224(Fe)上，檢測(cè)限可達(dá)1.8 μmol/L。

Wu等[50]通過(guò)調(diào)控MOFs材料在水相中生長(zhǎng)的溶液條件，制備酶-無(wú)定形MOFs材料復(fù)合物(圖2(b))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：無(wú)定形MOFs材料不但保留了晶態(tài)MOFs材料基本的結(jié)構(gòu)單元和特性，而且其配位存在缺陷，具備大量的介孔，有助于提高傳質(zhì)效率；酶-無(wú)定形MOFs材料復(fù)合物除了具有與游離酶相當(dāng)?shù)谋碛^活性之外，其良好的分散性與胞吞性能，在胞內(nèi)葡萄糖檢測(cè)中展現(xiàn)出了比天然葡萄糖氧化酶更優(yōu)越的靈敏性。Zhang等[65]在共沉淀合成無(wú)定形MOFs材料的過(guò)程中添加雙酶，建立雙酶-無(wú)定形MOFs材料復(fù)合物用于胞內(nèi)乳酸檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以雙酶-無(wú)定形MOFs材料復(fù)合物作為人工構(gòu)建的細(xì)胞器，能夠?qū)㈦p酶遞送到細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的乳酸表現(xiàn)出較高的催化活性和選擇性，信噪比(S/N)提升了650倍。

配體混合法是另一種構(gòu)建缺陷MOFs材料的有效策略[66-67]。在從頭合成的過(guò)程中，用基團(tuán)不同的配體部分來(lái)替代原骨架結(jié)構(gòu)中的有機(jī)配體，利用混合具有目標(biāo)功能的配體達(dá)到增加MOFs材料活性位點(diǎn)或缺陷數(shù)量的目的。Feng等[68]基于缺陷工程方法，在合成ZIF-8的過(guò)程中添加另一種有機(jī)配體1-甲基咪唑，使得原本ZIF-8的完美晶體結(jié)構(gòu)被打亂，從而導(dǎo)致金屬有機(jī)骨架進(jìn)行重排，并產(chǎn)生了介孔結(jié)構(gòu)，并將葡萄糖氧化酶和胰島素共同封裝在缺陷MOFs材料中，構(gòu)建一種藥物輸送系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：缺陷的MOFs材料不僅可以使胰島素藥物在高濃度葡萄糖溶液(12 mmol/L)中迅速釋放，還可以減緩其在低濃度葡萄糖溶液(5 mmol/L)中的釋放速率，從而有望構(gòu)建出針對(duì)高血糖和正常血糖做出不同響應(yīng)的胰島素給藥體系，為糖尿病自主治療提供新的給藥思路。Hu等[69]借助微流體通道內(nèi)層流梯度混合產(chǎn)生的晶體缺陷效應(yīng)來(lái)，制備酶-無(wú)定形MOFs材料復(fù)合物，因?yàn)樵谖⑼ǖ乐?，層流狀態(tài)下反應(yīng)物分子自由擴(kuò)散形成的濃度梯度使得每個(gè)酶-MOFs材料復(fù)合物顆粒在形成過(guò)程中經(jīng)歷了顯著的濃度擾動(dòng)，導(dǎo)致出現(xiàn)大量的配位缺陷，進(jìn)而形成介孔結(jié)構(gòu)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論計(jì)算發(fā)現(xiàn)，在微流控層流合成的酶-無(wú)定形MOFs材料復(fù)合物中存在大量孔徑為3～6 nm的介孔，這些介孔在后續(xù)的酶促反應(yīng)中有利于底物分子的傳質(zhì)；此外，在催化活性方面，微流控層流合成的酶-無(wú)定形MOFs材料復(fù)合物的表觀活性比溶液法合成的晶態(tài)MOFs材料的提高了5～20倍，展現(xiàn)出了較高的酶催化能力。

盡管研究者們針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景和不同酶開(kāi)發(fā)了性能各異的酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物用于強(qiáng)化不同酶催化反應(yīng)過(guò)程，但是仍然缺乏普適性的方法以滿足大部分酶的需求。因此，開(kāi)發(fā)通用性更強(qiáng)的平臺(tái)技術(shù)是未來(lái)研究的目標(biāo)。

3 酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑

酶催化反應(yīng)類(lèi)型受限是天然酶在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中的另一大挑戰(zhàn)。利用酶-金屬?gòu)?fù)合催化可開(kāi)發(fā)出現(xiàn)有酶催化或金屬催化無(wú)法實(shí)現(xiàn)的新型級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是拓展催化反應(yīng)類(lèi)型的有效策略之一。然而，當(dāng)酶催化與金屬催化以分步方式進(jìn)行時(shí)，在每步反應(yīng)之間往往需要對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行分離提純的操作，該過(guò)程通常會(huì)造成產(chǎn)物的損耗，同時(shí)還需要投入大量的成本。因此，將酶催化與化學(xué)催化相融合，構(gòu)建一鍋酶-金屬級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，不僅能夠提升原子經(jīng)濟(jì)性、節(jié)省時(shí)間與降低中間產(chǎn)物的分離成本，還能推動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)向產(chǎn)物的方向進(jìn)行。然而，酶催化與金屬催化的最適反應(yīng)條件相差較大，為了避免酶催化劑在惡劣環(huán)境中喪失活性與選擇性，在溫和條件下使酶催化劑與化學(xué)催化劑發(fā)揮各自較高的催化性能是解決問(wèn)題的關(guān)鍵所在[70-71]。

酶-金屬級(jí)聯(lián)催化的一個(gè)典型例子為動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分(dynamic kinetic resolution,DKR)反應(yīng)。在DKR中，酶選擇性催化?；磻?yīng)，金屬催化外消旋反應(yīng)，將剩余的某一構(gòu)型的底物再變?yōu)橥庀旌衔?。Engstr?m等[72]將Pd納米顆粒與酶共固定至硅基中孔泡沫材料的空腔中得到了酶-金屬的復(fù)合催化劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以甲氧基乙酸乙酯為?；w，在1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(atm)的H2和70 ℃條件下，在16 h內(nèi)催化得到(R)-1-苯乙胺的?；a(chǎn)物，收率99%，對(duì)映體過(guò)量值(e.e.值)為99%；在金屬催化的酮還原酶輔因子再生級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，Rh催化劑以甲酸鹽作為底物催化NAD+轉(zhuǎn)化為NADH，馬肝醇脫氫酶催化酮還原為(S)-型手性醇。該體系存在的問(wèn)題為酶與金屬配合物不相容，它們之間的非特異性相互作用會(huì)導(dǎo)致酶和金屬活性均降低或失去活性。Himiyama等[73]將Rh催化劑固定化在介孔SiO2中，實(shí)現(xiàn)了酶與金屬催化劑的空間分隔，由于孔徑大小的限制，酶分子與Rh催化劑在溶液中無(wú)法接觸，因此避免了二者的失活，實(shí)現(xiàn)手性醇的高效合成。Wang等[74]通過(guò)原位合成法將NiPd中空納米顆粒和GOx共固定在ZIF-8上，合成的GOx@ZIF-8(NiPd)酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑具有納米花狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有葡萄糖氧化酶和類(lèi)過(guò)氧化物酶活性，以此構(gòu)建葡萄糖電化學(xué)傳感器或葡萄糖比色傳感器，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在505 nm處的吸光度值與葡萄糖濃度呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限可達(dá)9.2 μmol/L；電化學(xué)檢測(cè)中，當(dāng)檢測(cè)濃度為0.1～1.7 mmol/L時(shí)，電流強(qiáng)度與葡萄糖濃度呈良好的線性相關(guān)性，且連續(xù)使用16次后，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)僅為0.8%，表明該生物傳感器具有良好的操作穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

由于反應(yīng)分子在2種催化劑之間經(jīng)歷多次吸附脫附過(guò)程，所以存在耦合催化反應(yīng)效率降低的問(wèn)題，因此，構(gòu)建酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑能夠盡可能縮短酶活性位點(diǎn)與金屬活性位點(diǎn)之間的距離，減少反應(yīng)分子在2種活性位點(diǎn)之間的脫附—擴(kuò)散—再吸附過(guò)程，從而提升整體級(jí)聯(lián)催化效率[75]。Li等[76]以核殼結(jié)構(gòu)酶-高分子絡(luò)合物為模板，以原位還原法將金屬亞納米團(tuán)簇固定在酶-高分子配合物內(nèi)部，制備酶-金屬亞納米團(tuán)簇復(fù)合催化劑(圖3(a))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)Pd顆粒大小從納米尺寸逐漸下降至亞納米尺寸時(shí)，Pd亞納米團(tuán)簇在酶促反應(yīng)最適溫度條件下的催化活性得到了顯著提升，為商業(yè)催化劑Pd/C的52倍；密度泛函理論(DFT)計(jì)算結(jié)果顯示，當(dāng)Pd顆粒尺寸從2.5 nm減小至0.8 nm時(shí)，表面Pd原子的Pd—O成鍵數(shù)從1.7提高到2.5，可見(jiàn)通過(guò)降低底物吸附能，可提高亞納米團(tuán)簇的催化活性。這些結(jié)果證實(shí)，金屬亞納米團(tuán)簇的活性位點(diǎn)暴露與酶分子表面氨基酸殘基的氧原子相互作用是增強(qiáng)Pd催化劑尺寸效應(yīng)的主要原因。此外，在各種手性胺中間體的動(dòng)力學(xué)拆分反應(yīng)中，酶-金屬亞納米團(tuán)簇復(fù)合催化劑具有比Novozym 435與Pd/C商業(yè)催化劑更高的級(jí)聯(lián)催化效率。

圖3 酶-金屬亞納米團(tuán)簇復(fù)合催化劑與酶-金屬單原子復(fù)合催化劑的構(gòu)建與過(guò)程強(qiáng)化Fig.3 Construction and reaction process enhancement of enzyme-metal subnanocluster hybrid catalyst and enzyme-metal monoatomic hybrid catalyst

將金屬催化劑的尺寸控制在單原子級(jí)別，有望進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)酶催化與金屬單原子催化在溫和條件下的協(xié)同效應(yīng)。然而，酶分子表面氨基酸殘基往往難以穩(wěn)定地結(jié)合金屬單原子。為了解決這一問(wèn)題，Li等[77]以酶-高分子配合物為模板，借助光化學(xué)法在高分子鏈上產(chǎn)生碳自由基，然后利用碳自由基分別和酶分子上的氨基酸殘基與金屬原子共同作用，成功制備了穩(wěn)定結(jié)合的酶-金屬單原子復(fù)合催化劑(圖3(b))，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論計(jì)算證實(shí)了酶活性口袋與反應(yīng)物的烷基鏈結(jié)合，可穩(wěn)定Pd單原子催化烷基-烷基交叉偶聯(lián)反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)，從而降低反應(yīng)活化能，實(shí)現(xiàn)了烷基-烷基偶聯(lián)反應(yīng)在溫和條件下的高效協(xié)同催化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在催化碳碳偶聯(lián)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化頻率(TOF)方面，制備的酶-Pd單原子復(fù)合催化劑分別是均相催化劑Pd(PPh3)4和商業(yè)化多相催化劑Pd/C的1.6和2.3倍。此外，該研究還利用酶活性口袋對(duì)烷基鏈的選擇性，開(kāi)發(fā)了基于酶-Pd單原子復(fù)合催化劑的生物-化學(xué)一鍋級(jí)聯(lián)反應(yīng)合成聯(lián)苯類(lèi)手性醇的新路線。

為了進(jìn)一步發(fā)掘更有潛力的酶-金屬級(jí)聯(lián)/協(xié)同催化反應(yīng)，需要對(duì)酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑進(jìn)行理性設(shè)計(jì)；同時(shí)，針對(duì)不同的金屬和酶，需要開(kāi)發(fā)通用的復(fù)合催化劑設(shè)計(jì)平臺(tái)。

4 結(jié)論與展望

工業(yè)酶穩(wěn)定性差和催化反應(yīng)類(lèi)型的局限一直是困擾酶催化進(jìn)一步工業(yè)應(yīng)用的瓶頸。開(kāi)發(fā)高穩(wěn)定性、高活性和高傳質(zhì)效率的固定化酶和構(gòu)建具有拓展酶催化反應(yīng)類(lèi)型的酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑為解決天然酶的不足提供了新的策略。

本文綜述了近年來(lái)在開(kāi)發(fā)新型固定化酶與酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑方面的研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了酶納米凝膠、酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物、酶-有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化復(fù)合物，酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑領(lǐng)域的研究成果?；诠渤恋矸?gòu)建的酶納米凝膠、酶-無(wú)機(jī)納米晶體復(fù)合物、酶-有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化復(fù)合物能夠在保留表觀活性的同時(shí)，增強(qiáng)酶分子的穩(wěn)定性與重復(fù)使用性；開(kāi)發(fā)酶-無(wú)定形MOFs能夠進(jìn)一步降低傳質(zhì)阻力，增強(qiáng)酶分子的表觀活性；構(gòu)建酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑不僅能夠催化新的反應(yīng)，還能縮短酶活性位點(diǎn)與金屬活性位點(diǎn)之間的距離，使得中間產(chǎn)物的脫附-擴(kuò)散-再吸附過(guò)程顯著減少，在2種活性位點(diǎn)間形成類(lèi)似的“底物通道”，可實(shí)現(xiàn)兩步催化反應(yīng)的耦合，提高催化反應(yīng)效率。

未來(lái)，在面向?qū)嶋H應(yīng)用的場(chǎng)景，需要開(kāi)發(fā)兼具穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性的固定化酶技術(shù)與載體材料，并應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中。在酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑方面，需要將更多不同種類(lèi)的金屬(Ru、Rh、Co和Ni等)和酶(漆酶、醇脫氫酶、胺脫氫酶和烯醇還原酶等)進(jìn)行耦合，開(kāi)發(fā)新型酶-金屬級(jí)聯(lián)/協(xié)同催化反應(yīng)和穩(wěn)定高效的酶-金屬?gòu)?fù)合催化劑。