李佳瑞，顧 潔，徐曉宇，聶 堯，徐 巖

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，化學(xué)名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，又名櫟精，槲皮黃素。槲皮素在自然界中主要存在于蔬菜、水果和草藥當(dāng)中，如洋蔥、花椰菜、藍莓、皺葉芥藍和韭菜中含有豐富的槲皮素[1]。槲皮素具有廣泛的藥理作用，包括抗過敏、抗炎、抗癌、抗心血管保護、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血糖、抗高血壓和胃保護等作用[1-3]，是一種藥用價值極高的天然產(chǎn)物。槲皮素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和在自然界中較低的豐富度給槲皮素的合成與提取帶來了阻礙[4]。目前，槲皮素多是從天然植物中提取或從植物中提取蘆丁，進而采用酸水解的方式制備槲皮素[5-7]。傳統(tǒng)方法涉及化學(xué)試劑的使用或需要提供高溫高壓環(huán)境，從而帶來環(huán)境污染及生產(chǎn)安全等問題。生物發(fā)酵法以其條件溫和、對環(huán)境污染小等優(yōu)勢越來越受到重視。李琦玲等[8]采用青霉菌固態(tài)發(fā)酵的方法，以桂被金槐槐米為原料發(fā)酵生產(chǎn)槲皮素，產(chǎn)量達33.67 mg/g。Tartik等[4]對酵母的生物合成途徑進行改造使其生產(chǎn)槲皮素，產(chǎn)量達930 mg/L。

曲克蘆丁是羥乙基蘆丁的混合物，可經(jīng)蘆丁(槲皮素3-O-蕓香糖苷)羥乙基化得到[9]。工業(yè)上生產(chǎn)曲克蘆丁的廢液中仍有較多的羥乙基蘆丁殘留，且該殘留物主要為羥乙基蘆丁混合物，80%以上為三羥乙基蘆丁，同時還含有少量的單羥乙基蘆丁、二羥乙基蘆丁和四羥乙基蘆丁[10]。由于母液中的羥乙基蘆丁不易提取，因此造成生產(chǎn)原料的浪費。從羥乙基蘆丁的結(jié)構(gòu)考慮(圖1)，若能在去除其羥乙基的同時，選用合適的β-糖苷酶去除蕓香糖苷，則能得到高價值的槲皮素，減少資源的浪費。

圖1 本文研究技術(shù)路線Fig.1 The reaction route studied in this work

圖2 蘆丁核磁共振鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of rutin by NMR

將0.5 mmol曲克蘆丁與1.635 g[BMIM]Cl、2 mmol AlCl3在120 ℃及N2保護下進行反應(yīng)，得到蘆丁粗品，再重結(jié)晶提純備用，反應(yīng)收率為89.26%。產(chǎn)物經(jīng)13C NMR、1H NMR鑒定為蘆丁(圖2)：13C NMR (101 MHz,DMSO)δ177.41、164.10、161.26、156.65、156.46、148.45、144.78、133.34、121.63、121.22、116.31、115.27、104.01、101.22、100.80、98.71、93.62、76.48、75.94、74.11、71.88、70.60、70.41、70.04、68.28、67.03和17.77;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ12.51 (s,1H)、10.75 (s,1H)、9.58 (s,1H)、9.09 (s,1H)、7.46 (d,J=7.5 Hz,2H)、6.76 (d,J=8.7 Hz,1H)、6.30 (d,J=2.0 Hz,1H)、6.11 (d,J=2.0 Hz,1H)、5.26 (d,J=7.3 Hz,1H)、5.20 (d,J=3.7 Hz,1H)、5.02 (d,J=3.2 Hz,1H)、4.99 (d,J=5.7 Hz,1H)、4.44 (d,J=4.8 Hz,1H)、4.36～4.19 (m,3H)、3.62 (d,J=10.4 Hz,1H)、3.18 (ddd,J=20.3,10.1,5.1 Hz,7H)、3.03～2.92 (m,2H)、0.91 (d,J=6.1 Hz,3H)。

蘆丁降解酶(rutin-degrading enzymes,RDEs，ATW 21594.1)是一種專一性酶，可在水溶液中將蘆丁降解為槲皮素和蕓香糖。研究表明，苦蕎中含有天然高活性的蘆丁降解酶[11]?？嗍w中的蘆丁被該酶降解為槲皮素，從而表現(xiàn)出苦味。Zhou等[12]的研究表明，蘆丁降解酶在含有水醇(ROH，R=甲基、乙基、丙基、異丙基和芐基)混合的溶液中也可以得到不同的蕓香糖苷衍生物(R-β-蕓香糖苷)。Jia等[13]從苦蕎中獲取RDE基因序列，成功實現(xiàn)在畢赤酵母中的異源表達，同時證明了蘆丁降解酶中催化關(guān)鍵殘基為2個谷氨酸(E171、E182)。

本文擬通過將蘆丁降解酶在畢赤酵母中異源表達，實現(xiàn)蘆丁到槲皮素的高效轉(zhuǎn)化，以實現(xiàn)羥乙基蘆丁的回收利用。

目前還沒有工業(yè)生產(chǎn)的曲克蘆丁母液回收利用并轉(zhuǎn)化為槲皮素的報道。本研究將以羥乙基蘆丁為底物，通過化學(xué)法去除羥乙基得到蘆丁，同時結(jié)合酶法將其轉(zhuǎn)化為槲皮素(圖1)，以利于生產(chǎn)曲克蘆丁母液的資源回收利用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌Top 10，江蘇賽索飛生物科技有限公司；感受態(tài)細胞SMD1168H畢赤酵母(Pichia pastoris)，上海瑞楚生物科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；DNA純化試劑盒，康為世紀生物科技有限公司；酵母提取物、蛋白胨，Oxiod公司；限制性內(nèi)切酶、DNA分子量標準、蛋白分子量標準，TaKaRa公司；無氨基酵母氮源(YNB)，北京索萊寶科技有限公司；[BMIM]Cl(1-丁基-3-甲基-咪唑氯鹽)，上海麥克林生化科技股份有限公司；博來霉素(Zecion)，賽默飛世爾科技公司；NaCl、葡萄糖和乙酸鈉等，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 化學(xué)法制備蘆丁

在50 mL Schlenk管中加入0.5 mmol 羥乙基蘆丁、1.635 g[BMIM]Cl(1-丁基-3-甲基-咪唑氯鹽)和2 mmol AlCl3，N2保護下，120 ℃攪拌反應(yīng)22 h，油浴120 ℃，反應(yīng)22 h。反應(yīng)完成后加入水，冷卻過夜，減壓抽濾并用去離子水沖洗濾餅2～3次，干燥后即得蘆丁粗品。取少量粗品于圓底燒瓶中，加熱至110 ℃回流，同時不斷加入乙醇至溶液澄清透明。室溫下靜置一夜，抽濾并自然晾干后即可得到精制的產(chǎn)物。

1.2.2 蘆丁與槲皮素的定量分析方法

配制不同濃度的蘆丁和槲皮素標品溶液，通過高效液相色譜(HPLC)方法檢測。色譜柱為Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm,3.5 μm)；流動相為甲醇與水(體積比50∶50)；流速為1 mL/min；采用Waters 2998光電二極管陣列(PDA)檢測器檢測，檢測波長為370 nm；進樣量20 μL；柱溫維持在35 ℃。

1.2.3 密碼子的優(yōu)化與質(zhì)粒的構(gòu)建

密碼子優(yōu)化是基因工程中根據(jù)生物的密碼子偏好改變同義密碼子以提高基因表達的一種方法。對蘆丁降解酶基因以Pichia pastoris為宿主進行了密碼子優(yōu)化，并選擇穿梭質(zhì)粒pPICZαA用于畢赤酵母分泌表達外源蛋白。

密碼子優(yōu)化后的RDE基因委托江蘇賽索飛生物科技有限公司合成。以畢赤酵母SMD1168H為表達宿主，參照文獻[14]方法完成載體的構(gòu)建。構(gòu)建的質(zhì)粒參照SMD1168H Chemically Competent Cell(上海瑞楚生物科技有限公司)標準操作步驟，化學(xué)轉(zhuǎn)化至畢赤酵母SMD1168H中。

1.2.4 陽性菌株的鑒定

在平板上挑取單菌落分別加入裝有20 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR的200 μL離心管，于80 ℃金屬浴保溫15 min。所得產(chǎn)物通過PCR得到大量目的片段。上游引物AOX - F：GAATTCATGGCCACTACCAAGTCCAGCTTCATCPCR；下游引物AOX - R：GTCGACGTTAGCCAGGAAGTTCTTGTACCAGTAG。產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠鑒定是否含有目標條帶。

1.2.5 畢赤酵母中RDE的誘導(dǎo)表達

選擇瓊脂糖檢測結(jié)果中含有目標條帶的菌落，挑菌至25 mL BMGY 培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)16～18 h。培養(yǎng)完成后轉(zhuǎn)接至100 mL BMMY培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每24 h加入1%純甲醇誘導(dǎo)一次，共誘導(dǎo)4次，同時進行取樣，通過SDS-PAGE檢測蛋白的表達。培養(yǎng)96 h后于4 ℃下離心，11 000 r/min離心10 min，收集上清液作為酶液冷藏備用。

1.2.6 RDE活性鑒定

以化學(xué)法重結(jié)晶后所得蘆丁作為底物，鑒定RDE的活性。在1.5 mL 離心管中加入60 μL 甲醇溶解的蘆丁溶液(1 mg/mL)，45 μL上清液，195 μL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=4)，混勻后在50 ℃溫育10 min。一個單位的酶活定義為在上述標準條件下催化形成 0.1 nmol 槲皮素所需的酶量。反應(yīng)完成后加入800 μL甲醇停止反應(yīng)。反應(yīng)液通過HPLC檢測有無槲皮素生成。

1.2.7 RDE反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.2.7.1 底物濃度與酶添加量的優(yōu)化

取60 μL不同濃度的蘆丁溶液(反應(yīng)體系終濃度為1、2、3、4、5和6 mmol/L)，同時改變反應(yīng)體系中酶的添加量(5%、10%、15%和20%)，加50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=4)補足體積至300 μL，反應(yīng)10 min后加入800 μL甲醇終止反應(yīng)，通過HPLC測定槲皮素的產(chǎn)率。

1.2.7.2 pH對RDE催化活性的影響

選擇不同pH的緩沖液(pH 3.0～8.0),配制反應(yīng)體系，反應(yīng)10 min后加入800 μL甲醇終止反應(yīng)。通過HPLC測定槲皮素的產(chǎn)率。

1.2.7.3 溫度對RDE催化活性的影響

按照RDE活性鑒定的方法配制反應(yīng)體系，置于25、30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃環(huán)境下進行反應(yīng)，反應(yīng)10 min后加入800 μL甲醇終止反應(yīng)。通過HPLC測定槲皮素的產(chǎn)率。

1.2.8 化學(xué)酶法轉(zhuǎn)化羥乙基蘆丁合成槲皮素

按照體系優(yōu)化的反應(yīng)條件，以化學(xué)法合成的蘆丁為底物，通過RDE合成槲皮素。產(chǎn)物通過HPLC和核磁共振(NMR)來鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁的制備與鑒定

2.2 重組大腸桿菌E.coli Top 10、pPICZαA-RDE的構(gòu)建

2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

質(zhì)粒pPICZαA含有畢赤酵母表達系統(tǒng)中常用的強啟動子AOX，可通過甲醇誘導(dǎo)來實現(xiàn)嚴格的調(diào)控。同時該質(zhì)粒還含有博來霉素抗性基因(BleoR)，可用于轉(zhuǎn)化子的篩選。重組后的質(zhì)粒pPICZαA-RDE圖譜如圖3所示。

圖3 pPICZαA-RDE質(zhì)粒圖譜Fig.3 Plasmid map of pPICZαA-RDE

2.2.2 重組大腸桿菌的構(gòu)建與驗證

將上述構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPICZαA-RDE 轉(zhuǎn)化入E.coliTop 10得到含有目的基因的重組菌株。利用上下游引物分別對空質(zhì)粒pPICZαA、重組質(zhì)粒pPICZαA-RDE與單菌落E.coliTop 10/pPICZαA-RDE進行PCR，并對擴增后的特異性產(chǎn)物進行核酸膠電泳驗證，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，重組菌中存在與目的基因片段大小一致的基因。

1—空質(zhì)粒pPICZαA;2—pPICZαA-RDE;3—轉(zhuǎn)入pPICZαA-RDE的E.coli Top 10圖4 核酸凝膠電泳Fig.4 Nucleic acid gel electrophoresis

2.2.3 重組菌株P(guān).pastorisSMD1168H/pPICZαA-RDE的構(gòu)建與鑒定

培養(yǎng)重組大腸桿菌后提取質(zhì)粒，并對其線性化、純化和濃縮，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入P.pastorisSMD1168H，于Zeocin抗性的YPD固體平板上培養(yǎng)。再挑取轉(zhuǎn)化得到的陽性轉(zhuǎn)化子進行PCR擴增，然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目標質(zhì)粒pPICZαA-RDE是否成功轉(zhuǎn)入P.pastorisSMD1168H中，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在挑取的菌落中檢測到1 500 bp的目標條帶(條帶2)，說明重組菌株構(gòu)建成功。

1—DL2000 DNA Marker；2—PCR產(chǎn)物圖5 PCR擴增產(chǎn)物檢測Fig.5 Detection of PCR amplification product

2.3 畢赤酵母中RDE的表達

選取通過瓊脂糖凝膠鑒定為陽性的菌株，在BMGY和BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h，每24 h用1%純甲醇誘導(dǎo)，在48、72和96 h時分別取樣，樣品離心后通過SDS-PAGE分析上清液中是否含有目標蛋白，結(jié)果見圖6。由圖6可知，6.6×104附近有清晰的目標條帶，表明RDE成功表達。

1—Premixed Protein Marker (Low)；2～4—分別為48、72和96 h取樣的結(jié)果圖6 SDS-PAGE分析鑒定RDE表達Fig.6 RDE expression by SDS-PAGE analysis

圖7 槲皮素核磁共振鑒定結(jié)果Fig.7 Identification of quercetin by NMR

2.4 RDE活性驗證

由蘆丁、乙酸-乙酸鈉緩沖液和發(fā)酵上清液構(gòu)成的300 μL反應(yīng)體系，在50 ℃溫育3 min，反應(yīng)結(jié)束后加入800 μL甲醇終止反應(yīng)，利用半制備HPLC在370 nm檢測波長下檢測并收集反應(yīng)液。產(chǎn)物通過13C NMR、1H NMR鑒定為槲皮素(圖7)：13C NMR (101 MHz,DMSO)δ176.30、164.34、161.18、156.60、148.16、147.26、145.51、136.19、122.42、120.44、116.07、115.53、103.48、98.64和93.81;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.39 (s,1H)、10.67 (s,1H)、9.48 (s,1H)、9.22 (d,J=18.6 Hz,2H)、7.58 (d,J=2.2 Hz,1H),7.44 (dd,J=8.5,2.2 Hz,1H),6.79 (d,J=8.5 Hz,1H)、6.31 (d,J=2.0 Hz,1H)、6.09 (d,J=2.0 Hz,1H)。這表明重組菌株P(guān).pastorisSMD1168H能夠?qū)崿F(xiàn)胞外表達RDE，轉(zhuǎn)化蘆丁生成槲皮素，轉(zhuǎn)化率為32.63%。在該條件下，酶活為522.08 U/mL。

2.5 RDE 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 底物濃度與酶添加量的優(yōu)化

改變反應(yīng)體系的底物濃度與酶添加比例，通過HPLC測定槲皮素產(chǎn)率，比較不同底物濃度與酶添加比例對槲皮素產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：隨著底物濃度的增加，槲皮素產(chǎn)率呈下降趨勢；酶的添加比例為15%(體積分數(shù))時整體產(chǎn)率相對較高。綜合考慮兩因素對產(chǎn)率的影響，采用2 mmol/L底物濃度與15%酶添加比例進行后續(xù)實驗。

圖8 不同底物濃度與酶比例對槲皮素產(chǎn)率的影響Fig.8 Effects of different substrate concentrations and enzyme ratios on quercetin yield

2.5.2 不同pH對產(chǎn)率的影響

考察不同pH下RDE催化蘆丁反應(yīng)的產(chǎn)率，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知：當(dāng)反應(yīng)的pH為4.0～6.0時，RDE呈現(xiàn)較好的催化活性，但當(dāng)pH超過6.0時，產(chǎn)物產(chǎn)率快速下降?？梢?，在pH為5.0時，RDE反應(yīng)產(chǎn)率最高，達49.15%。

圖9 pH對RDE催化蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素反應(yīng)體系的影響Fig.9 Effect of pH on RDE catalyzed conversion of rutin to quercetin

2.5.3 不同溫度對產(chǎn)率的影響

考察不同溫度下RDE催化蘆丁反應(yīng)的產(chǎn)率，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知：在25～55 ℃條件下，RDE都呈現(xiàn)催化活性，但當(dāng)溫度超過55 ℃時，產(chǎn)物產(chǎn)率快速下降，而且當(dāng)溫度達70 ℃時RDE產(chǎn)量極低。可見，當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃時，RDE的反應(yīng)產(chǎn)率最高，達到53.96%。

圖10 溫度對RDE催化蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素反應(yīng)體系的影響Fig.10 Effect of temperature on the reaction system of rutin to Quercetin catalyzed by RDE

2.6 化學(xué)酶法轉(zhuǎn)化羥乙基蘆丁合成槲皮素

以化學(xué)法得到的蘆丁作為酶反應(yīng)的底物，在優(yōu)化后的條件下(溫度為55 ℃、pH=5.0)進行脫糖苷的反應(yīng)，產(chǎn)物通過HPLC檢測，結(jié)果如圖11所示。由圖11數(shù)據(jù)測算，化學(xué)-酶法總轉(zhuǎn)化率為47.17%。

圖11 HPLC檢測RDE催化蘆丁結(jié)果Fig.11 Results of RDE catalyzed rutin by HPLC

3 結(jié)論

以羥乙基蘆丁為原料，利用化學(xué)法合成了槲皮素，收率為89.26%。以質(zhì)粒pPICZαA為載體，實現(xiàn)了蘆丁降解酶在畢赤酵母SMD1168H中的異源表達。通過對底物濃度、酶添加量、反應(yīng)pH與溫度的優(yōu)化，蘆丁降解酶轉(zhuǎn)化蘆丁合成槲皮素的產(chǎn)率為53.96%。最終實現(xiàn)了化學(xué)-酶法轉(zhuǎn)化羥乙基蘆丁合成槲皮素，總轉(zhuǎn)化率為47.17%。