不同來源多肽熱反應風味成分對比分析

胡靖,李凡,熊建,李沛,李庫,覃先武

(酵母功能湖北省重點實驗室,湖北 宜昌 443000)

美拉德反應是高溫下醛類、酮類、還原糖的羰基與氨基酸、肽、蛋白質等含氮化合物的游離氨基之間發(fā)生羰氨反應,并經(jīng)過縮合、聚合反應后形成類黑精的過程[1-2]。在美拉德反應過程中會形成大量的風味物質,因此一些香精的生產(chǎn)過程中會利用美拉德反應的技術生成不同肉類型風味的香精,此類技術生產(chǎn)的香精也稱為熱反應肉味香精。目前作為熱反應肉味香精的主要多肽原料包括各種動植物蛋白酶解液,如Wu等[3]采用風味蛋白酶酶解大豆蛋白獲得大豆肽,然后與核糖、半胱氨酸進行美拉德反應制備肉味香精;Liu等[4]通過酶解雞肉獲得雞肉肽,與木糖進行美拉德反應,制備雞肉味香精;曾曉房等[5]利用酵母抽提物進行熱反應制備牛肉味香精。多肽作為美拉德反應主要的反應原料,其不同游離氨基酸比例、分子量大小、寡肽種類均對熱反應的風味具有較大的影響,因此酶解工藝的不同會導致其在熱反應中出現(xiàn)截然不同的風味。在制備熱反應的肉味香精工藝中,一般都會添加含硫化合物進行反應來增強反應產(chǎn)物的肉香味,主要添加的化合物是半胱氨酸和硫胺素,反應過程中會形成2-甲基-3-巰基呋喃等肉香風味的含硫化合物,但是含硫化合物的閾值較低,含量過高時會明顯出現(xiàn)硫臭風味,最終影響產(chǎn)物的風味[6-8]。

本研究收集不同來源的多肽,包括大豆多肽、玉米多肽、小麥多肽、酵母多肽,使用固定的熱反應模型進行反應,采用HS-SPME-GC-MS技術對熱反應后的風味物質進行檢測,并通過風味分析、聚類分析和主成分分析方法對檢測結果進行分析。探討不同來源的多肽反應后的風味差異、不同熱反應風味的揮發(fā)性化合物組成差異以及風味物質與感官屬性之間的相關性,為熱反應香精的工藝探索及風味化合物形成機制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆多肽1號、玉米多肽1號和小麥多肽1號：購于西安某公司,以下簡稱DD1、YM1、XM1;大豆多肽2號、玉米多肽2號：購于山東某公司,以下簡稱DD2、YM2;基礎型酵母多肽LA00、濃厚味酵母多肽FA31以及小麥多肽2號：安琪酵母股份有限公司,以下簡稱YE1、YE2、XM2。

BSA124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HHM-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州易晨儀器制造有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取吸附頭 美國Supelco公司;7890B-5977B GC-MS 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同多肽總氮和氨基酸態(tài)氮的測定

對收集的大豆多肽1號、玉米多肽1號、小麥多肽1號、大豆多肽2號、玉米多肽2號、基礎型酵母多肽LA00、濃厚味酵母多肽FA31以及小麥多肽2號共8種多肽進行總氮和氨基酸態(tài)氮的檢測,其中檢測方法依據(jù)國標GB/T 23530—2009中總氮和氨基酸態(tài)氮的測定方法進行檢測。

1.2.2 不同多肽分子量分布的測定

利用高效凝膠過濾色譜法測定酵母抽提物的寡肽分子量分布。色譜條件:色譜柱:TSK-gel G2000SWXL (300 mm×7.8 mm,5 μm);流動相:乙腈∶水∶三氟乙酸為50∶50∶0.1;檢測波長:220 nm;流速:1.5 mL/min;檢測時間:50 min;進樣體積:20 μL;柱溫:40 ℃。

1.2.3 不同多肽熱反應實驗

將8種多肽進行熱反應,反應配方:50%的多肽樣品、2%的還原糖(葡萄糖∶木糖為1∶1)、0.5%的半胱氨酸、0.5%的硫胺素;反應條件:溫度100 ℃,時間60 min,pH 6。多肽混合還原糖和含硫氨基酸的模型是很多肉味香精配方配置的基礎模型,因此本實驗使用該模型測試不同多肽參與熱反應所形成的風味。

1.2.4 多肽熱反應后風味感官對比

對不同多肽反應的樣品進行感官分析,邀請專業(yè)的感官小組(10人)根據(jù)表1的評分標準進行評分。

表1 多肽反應后感官評分標準

1.2.5 多肽反應后風味物質的GC-MS檢測

采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)對不同多肽熱反應后樣品的揮發(fā)性風味化合物進行提取和富集。稱取樣品1 g,加入 4 g NaCl、4 mL水。在稱取好的樣品中加入1 μL內標(鄰二氯苯0.1 μL/mL),立即用帶有硅橡膠墊的瓶蓋密封,放入 GC-MS 儀器中,孵化 30 min,萃取 30 min,然后進樣,解吸5 min。GC-MS 參數(shù)見表2。

表2 GC-MS 參數(shù)

表3 不同多肽熱反應后主要揮發(fā)性風味物質和含量

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理。 采用JMP 10軟件進行主成分分析和聚類分析,其中聚類分析采用Ward法進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同多肽總氮和氨基酸態(tài)氮的對比

不同來源多肽的總氮和氨基酸態(tài)氮的數(shù)據(jù)見圖1,可以發(fā)現(xiàn)西安和山東兩家公司的多肽的總氮含量均為13%以上,說明多肽的含量均在80%以上,是純度較高的多肽產(chǎn)品,此外,這些多肽產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量均很低,基本在1%～2%之間,說明該多肽產(chǎn)品的游離氨基酸含量均較低,可能是產(chǎn)品酶解后進行了透析除鹽的工藝,導致一部分游離氨基酸被去除。對比安琪酵母的小麥多肽,發(fā)現(xiàn)其總氮含量較其他多肽廠家的產(chǎn)品略低,但是游離氨基酸的含量比較高。安琪酵母的YE1與XM2的總氮和氨基酸態(tài)氮含量差別不大,而YE2的總氮和游離氨基酸含量均較YE1和XM2低。

2.2 不同多肽分子量分布對比

不同來源的多肽分子量分布數(shù)據(jù)見圖2,實驗收集的分子量基本小于1 000 Da,同時發(fā)現(xiàn)兩家不同公司的大豆多肽和玉米多肽的分子量分布基本一致,可能使用了類似的蛋白酶和條件進行酶解;XM2和YE1具有較高比例(≤180 Da)的肽,主要為游離氨基酸,此結果與氨基酸態(tài)氮的檢測結果相符合。

圖2 不同多肽分子量分布對比

2.3 多肽熱反應后風味感官對比

對不同多肽熱反應后的風味進行感官評分(見圖3),得分最高的是YE2,其反應的風味具有較好的肉香風味,無其他異味,并且有烤香風味;其次是XM2和YE1,其中XM2同樣具有相似的烤香風味但肉味相比YE2不足,YE1肉味一般,略帶硫味,帶有焦香味;其他植物多肽均出現(xiàn)明顯的硫味和酸味,肉味較不明顯。

圖3 不同多肽熱反應風味感官評分

2.4 多肽反應后GC-MS分析

不同多肽熱反應后的風味物質組成見圖4。

圖4 不同多肽熱反應風味成分分析結果

反應后的風味物質主要由吡嗪類、酸類、醛類、醇類、呋喃類、含硫化合物和其他類組成。從揮發(fā)物含量可以發(fā)現(xiàn)XM2與YE1的含量較高,這與其游離氨基酸含量較多相關,說明游離氨基酸含量越高,其形成的風味越強。吡嗪類化合物主要是游離氨基酸、寡肽與還原糖通過美拉德反應生產(chǎn)的一類具有烤香、土豆香等特征香氣的化合物,對熱反應后樣品的風味具有較大的貢獻[9-10];呋喃類化合物是帶有焦糖和甜味的一類化合物;含硫化合物如2-甲基-3-呋喃硫醇、雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚、噻唑類化合物具有明顯的肉類風味,主要是含硫氨基酸如半胱氨酸、硫胺素通過熱反應產(chǎn)生,一般含硫化合物的閾值較低,當含量較高時會出現(xiàn)明顯的硫磺臭味,影響反應樣品的整體風味[11-12]。多肽反應后的樣品,由于不同風味物質含量不同,導致最終的風味呈現(xiàn)明顯的差異,YE2含有較高的吡嗪含量、相對較低的含硫化合物含量和極低的酸類含量,因此其風味較好,有較好的烤香風味;YE1與XM2的吡嗪含量中等,酸類和含硫化合物含量較高,因此具有一定的肉香風味,但是略有硫味;其他植物多肽的吡嗪含量較低,酸類和含硫化合物含量較高,因此導致風味較差,呈現(xiàn)酸味和硫味。因此可以發(fā)現(xiàn)吡嗪類化合物能夠掩蓋含硫化合物和酸類的異味,并且提供豐富的烤香、可可、咖啡等風味。

2.5 多肽熱反應后風味物質聚類分析

對不同多肽熱反應后的風味物質進行聚類分析,其聚類分析的結果見圖5。

圖5 多肽熱反應后風味物質Ward法聚類分析

從分析結果中可以發(fā)現(xiàn),8種多肽反應后的風味可以分為兩大類,其中山東和西安兩家公司的多肽類反應風味,DD1、DD2、YM1、YM2和XM1為一類,YE1、YE2以及XM2為一類。進一步分類可以看到多肽類的產(chǎn)品反應風味分為3種,分別是大豆多肽類、玉米多肽類和小麥多肽類;而YE1、YE2以及XM2分為兩類,YE1自成一類,YE2與XM2為一類。

2.6 多肽熱反應后風味物質主成分分析

采用主成分分析方法對多肽熱反應后揮發(fā)性風味物質的成分進行分析,從而反應出不同多肽熱反應后揮發(fā)性風味組成差異。經(jīng)主成分分析得到的特征值和特征向量見表4,可以得到前4個主成分(特征值>1)的累計貢獻率達到82%,能夠較好地反映樣品的整體信息。

表4 主成分的特征值和貢獻率

風味物質主成分分析載荷圖見圖6。

圖6 多肽熱反應后風味物質主成分分析載荷圖

由圖6可知,基本所有的吡嗪類化合物均在PC1的正坐標處,說明吡嗪類化合物對PC1具有正相關;同樣大部分的呋喃化合物和含硫化合物也處于PC1的正坐標處,因此PC1也與呋喃化合物和含硫化合物呈正相關;而酸類、醛類、醇類化合物處于PC1的負坐標處,說明其與PC1呈負相關。同理,對PC2進行分析發(fā)現(xiàn),吡嗪類化合物同樣處于PC2的正坐標處,而呋喃化合物和含硫化合物處于PC2的負坐標處,因此PC2與吡嗪類化合物呈正相關,與呋喃類化合物和含硫化合物呈負相關;大部分酸類、醛類、醇類化合物處于PC2坐標±0.5之間,說明對PC2的影響較小。此外,PC3分析顯示化合物在PC3坐標上分布較雜亂,且PC3的貢獻率相對PC1和PC2較小,因此其與多肽熱反應后風味化合物的類別無明顯的規(guī)律。

根據(jù)風味物原始數(shù)據(jù)的標準化矩陣、前兩個主成分的特征值和因子載荷矩陣,計算得到多肽熱反應樣品第一、第二主成分得分,以第一主成分為橫坐標、第二主成分為縱坐標,將樣本投影到該坐標系上,作出主成分二維得分,見圖7。

圖7 多肽熱反應后風味物質主成分散點圖

由圖7可知,DD1、DD2、YM1、YM2和XM1分布接近,處于PC1負坐標和PC2中軸處,說明其主要貢獻的風味物質成分類似,因此風味也較接近;YE2和XM2同處于第一象限,說明風味類似;而YE1獨處于第四象限,因此風味與其他多肽有一定的差距。此方法分析的結論與聚類分析的分類結果基本一致。結合圖6進行分析,DD1、DD2、YM1、YM2和XM1在散點圖中的分布匹配風味物質載荷圖,可以發(fā)現(xiàn)其主要的特征風味化合物為酸類、醛類和醇類化合物;YE2和XM2同處于第一象限,說明其特征風味物質主要為吡嗪類化合物,且YE2比XM2更遠離軸心位置,說明其吡嗪類化合物對YE2的風味貢獻比XM2更大;YE1自成一類,在第四象限,主要對應的大部分為呋喃化合物和含硫化合物,還包括少量酸類化合物乙酸等。

3 結論

本研究采用HS-SPME結合GC-MS對不同多肽熱反應后形成的風味物質進行定量測定,并通過風味成分分析、聚類分析和主成分分析對測定結果進一步分析。不同的多肽熱反應后風味差距較大,其中植物多肽大豆多肽1號、2號,玉米多肽1號、2號以及小麥多肽1號熱反應后主要風味物質以含硫化合物和酸類較多,因此為硫味和酸味,肉味較弱;濃厚味酵母抽提物和小麥多肽2號吡嗪類化合物較多,因此呈現(xiàn)烤香味,但是濃厚味酵母抽提物吡嗪含量更多,因此整體風味更好;基礎型酵母抽提物反應后各風味物質較均衡,含硫和酸味化合物也較多,因此風味也呈現(xiàn)肉風味,但是略帶硫味。聚類分析和主成分分析顯示植物多肽大豆多肽1號、2號,玉米多肽1號、2號以及小麥多肽1號為一類,特征化合物為酸類、醛類和醇類化合物;濃厚味酵母抽提物和小麥多肽2號為一類,特征化合物為吡嗪類化合物;基礎型酵母抽提物自成一類,特征化合物大部分為呋喃化合物和含硫化合物,還包括少量酸類化合物乙酸等。

對比總氮和氨基酸態(tài)氮的檢測數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)其熱反應的風味與總氮含量的高低并無明顯關系,與氨基酸態(tài)氮有一定的關聯(lián),即與游離氨基酸含量相關,這是因為不同氨基酸發(fā)生美拉德反應形成多種吡嗪類化合物。其中濃厚味酵母抽提物游離氨基酸含量并不如基礎型酵母抽提物,但是其吡嗪類化合物的種類和含量明顯高于基礎型,可能與濃厚型酵母抽提物含有豐富的濃厚味寡肽有關。結合整體的風味來看,熱反應中較高的含硫化合物和酸類含量不利于良好風味的形成,而吡嗪類化合物能夠掩蓋含硫化合物和酸類的異味,并且提供豐富的烤香、可可、咖啡等風味,合適的吡嗪類化合物和含硫化合物比例可以搭配出較好的烤肉風味。

綜上所述,不同來源的多肽使用相同模型熱反應出的風味有較大差異,通過聚類分析和主成分分析可以有效地進行分類和區(qū)別,鑒別其對風味影響的關鍵化合物類別,初步探討熱反應烤肉風味形成規(guī)律,為之后多肽應用于熱反應風味的研究提供理論依據(jù)。