方宇輝,齊學(xué)禮,張 煜,李 艷,趙明忠,胡 琳,許為鋼

(河南省作物分子育種研究院/河南省小麥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省麥類種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/神農(nóng)種業(yè)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450002)

倒春寒是指每年2月中下旬至4月上中旬降溫幅度高達(dá)6～10 ℃的現(xiàn)象。該階段是小麥拔節(jié)至孕穗的關(guān)鍵時(shí)期,如遭遇倒春寒將會(huì)對(duì)幼穗分化和結(jié)實(shí)產(chǎn)生十分不利的影響,是小麥生產(chǎn)上危害最嚴(yán)重的春季低溫氣象災(zāi)害之一[1]。近年來(lái)黃淮麥區(qū)倒春寒現(xiàn)象頻繁發(fā)生[2],如2013年3月中下旬至4月上旬,黃淮麥區(qū)發(fā)生大范圍的倒春寒天氣,導(dǎo)致河南、安徽、山東等省的小麥減產(chǎn)嚴(yán)重,受災(zāi)面積達(dá)總播種面積的41.8%,對(duì)小麥生產(chǎn)造成極大損失[3]。

倒春寒可使植株產(chǎn)生大量活性氧自由基,導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化[4],最終造成細(xì)胞和組織損傷甚至死亡[5]。在低溫脅迫過(guò)程中,小麥會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)新蛋白質(zhì)的合成[6]、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加[7]以及抗氧化酶活性增強(qiáng)[8]等生理反應(yīng),來(lái)減輕或消除低溫產(chǎn)生的不利影響。分析低溫脅迫下生理指標(biāo)的變化是判斷小麥抗寒性的重要依據(jù)。隸屬函數(shù)法是根據(jù)模糊數(shù)學(xué)原理[9],通過(guò)計(jì)算多項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值,可較為準(zhǔn)確地反映出品種間的抗寒性差異,在小麥[10]、茶樹[11]、甘蔗[12]等植物中均有應(yīng)用。鐘秀麗等[13]研究表明,不同類型小麥品種的抗寒性鑒定,宜在低溫敏感期進(jìn)行。

黃淮麥區(qū)是中國(guó)生態(tài)條件最適宜小麥生長(zhǎng)的地區(qū),以種植半冬半春性小麥為主。不同地理微生態(tài)條件下,同一品種的抗寒性差異較大,在不同地區(qū)缺乏統(tǒng)一的抗寒性鑒定方法。前人研究認(rèn)為,小麥在冬季的抗寒性與品種的冬春性相關(guān),而在春季的抗寒性與品種的發(fā)育進(jìn)程[14]以及體內(nèi)生理指標(biāo)密切相關(guān)[15-16]。本研究以黃淮麥區(qū)11個(gè)代表性小麥品種為材料,分析小麥遭遇倒春寒后,不同幼穗發(fā)育時(shí)期小麥的受凍害情況以及體內(nèi)生理指標(biāo)的變化狀況,在此基礎(chǔ)上形成小麥抗倒春寒綜合評(píng)價(jià)方法,以期為小麥品種抗倒春寒鑒定和品種選育提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用的黃淮麥區(qū)11個(gè)代表性品種及其育成單位如表1所示。材料于2015-2016年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原陽(yáng)試驗(yàn)基地進(jìn)行盆栽種植,盆直徑30 cm,盆高35 cm,每盆裝土15 kg,土壤取自0～30 cm大田耕層,土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分含量為堿解氮78.2 mg·kg-1、速效磷23.8 mg·kg-1、速效鉀115.8 mg·kg-1。于2015年10月15日進(jìn)行播種,每盆點(diǎn)播20穴,三葉期定苗10株,將盆埋于試驗(yàn)田中,盆內(nèi)土壤與盆外大田齊平。常規(guī)栽培管理。

1.2 試驗(yàn)方法

待盆栽小麥麥穗發(fā)育至二棱期(Ⅰ)、小花分化期(Ⅱ)、雌雄蕊分化期(Ⅲ)、藥隔期(Ⅳ)和四分體期(Ⅴ)時(shí),分別將試驗(yàn)材料移至人工氣候室進(jìn)行低溫處理。氣候室溫度設(shè)置為白天0 ℃(8:00-20:00),夜間-3 ℃,溫度變幅為±0.5 ℃,白天采用人工光源補(bǔ)光,光照強(qiáng)度為600 μmol· m-2·s-1。低溫處理6、12和18 h后,取小麥主莖幼穗進(jìn)行凍害級(jí)別調(diào)查及第1片展開葉生理指標(biāo)測(cè)定,以未處理植株的幼穗和葉片為對(duì)照(CK)。低溫處理結(jié)束后,將盆栽小麥埋于田間直至成熟收獲。

1.2.1 幼穗凍害級(jí)別調(diào)查

經(jīng)低溫處理后的小麥品種,選取低溫處理后長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的植株,每個(gè)品種取3株,用解剖針將小麥主莖和分蘗幼穗剝開后,依據(jù)崔金梅等[17]和劉平湘等[18]的方法在Olympus體視顯微鏡下觀察小麥幼穗發(fā)育進(jìn)程,并記錄幼穗在二棱期(Ⅰ)、小花分化期(Ⅱ)、雌雄蕊分化期(Ⅲ)、藥隔期(Ⅳ)和四分體期(Ⅴ)時(shí)的受凍害等級(jí)。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[19]測(cè)定可溶性蛋白含量;采用蒽酮比色法[19]測(cè)定可溶性糖含量;采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[19]測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用過(guò)氧化氫法[20]測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性;采用硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)法[20]測(cè)定丙二醛(MDA)含量。于小麥成熟后,統(tǒng)計(jì)有效穗數(shù)、穗粒數(shù),測(cè)定單株產(chǎn)量和千粒重。

1.3 抗倒春寒性狀評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.1 性狀相對(duì)值

用公式(1)[10]計(jì)算性狀相對(duì)值Xj,作為評(píng)價(jià)材料抗寒性的指標(biāo)。

相對(duì)值(Xj) = (低溫處理下某一指標(biāo)測(cè)定值/對(duì)照測(cè)定值) ×100%

(1)

1.3.2 隸屬函數(shù)值

參考模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法,用公式(2)和(3)計(jì)算各供試材料相對(duì)性狀的隸屬函數(shù)值[21]。

u(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)(與抗寒性呈正相關(guān)的指標(biāo))

(2)

u(Xij)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)(與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo))

(3)

式中,u(Xij)為i樣品j性狀的隸屬函數(shù)值,Xij為i樣品j性狀的相對(duì)值,Xmax和Xmin分別為該指標(biāo)的最大相對(duì)值和最小相對(duì)值。

1.3.3 綜合評(píng)價(jià)值

用公式(4)[22]計(jì)算供試小麥材料的春季抗寒性綜合評(píng)價(jià)值(Di)。

Di=∑u(Xij)/n

(4)

式中,Di為i材料的平均隸屬函數(shù)值,n為測(cè)定指標(biāo)數(shù),Di值越大,表明抗寒性越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖,用DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品種的抗倒春寒鑒定結(jié)果

2.1.1 幼穗不同發(fā)育時(shí)期低溫處理下小麥品種的受凍害情況

從表2可以看出,在二棱期、小花分化期、雌雄蕊分化期、藥隔期和四分體期,11個(gè)代表性小麥品種隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),幼穗凍害等級(jí)均逐步提高。在藥隔期達(dá)到最高,隨后在四分體期有所降低,說(shuō)明藥隔期是小麥對(duì)低溫脅迫最敏感的時(shí)期。

表2 幼穗不同發(fā)育時(shí)期低溫處理下小麥的凍害級(jí)別Table 2 Cold damage level of young ear under different development stages of low temperature treatments

低溫處理后周麥18、周麥22、山東20和淮麥33的幼穗凍害等級(jí)較高,而矮抗58、石麥19、良星99和鄭麥7698的幼穗凍害等級(jí)則相對(duì)較低。周麥18和矮抗58在幼穗藥隔期經(jīng)過(guò)低溫處理12 h和18 h后的小穗表型見圖1,其中周麥18在低溫處理18 h后均呈現(xiàn)組織失水和組織粘連的現(xiàn)象。

A和C:周麥18和矮抗58經(jīng)低溫處理12 h后的小穗表型;B和D:周麥18和矮抗58經(jīng)低溫處理18 h后的小穗表型。白色箭頭指示組織失水,紅色箭頭指示組織粘連。A and C: Spike phenotypes of Zhoumai 18 and Aikang 58 at 12 h after cold treatment; B and D: Spike phenotypes of Zhoumai 18 and Aikang 58 at 18 h after cold treatment. White arrow indicates tissue water loss, and red arrow indicates tissue adhesion.圖1 藥隔期小麥品種幼穗在不同低溫時(shí)間的表型Fig.1 Phenotype of young spike of wheat variety after different low temperature duration at anther connective stage

2.1.2 幼穗不同發(fā)育時(shí)期低溫處理下小麥葉片生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

從表3可以看出,與對(duì)照處理(低溫處理0 h)相比,二棱期低溫處理后小麥葉片的可溶性蛋白和可溶性糖含量、SOD和CAT活性在不同處理時(shí)間均有所增加(除低溫處理18 h的可溶性蛋白含量有所降低外),且均在處理12 h后達(dá)到峰值;而MDA含量均有所下降,在處理12 h后最低。說(shuō)明小麥在二棱期積累了大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),使細(xì)胞滲透勢(shì)增強(qiáng),同時(shí)有更強(qiáng)的抗氧化能力去清除低溫脅迫時(shí)積累的活性氧自由基,維持細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性和完整性,也說(shuō)明二棱期不屬于低溫敏感期。進(jìn)一步對(duì)小花分化期、雌雄蕊分化期、藥隔期和四分體期低溫處理后小麥葉片的生理指標(biāo)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照處理相比,小花分化期低溫處理6 h后小麥葉片的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、CAT活性和SOD活性的平均增幅明顯高于其他三個(gè)時(shí)期,分別為46.80%、54.05%、35.07%和52.73%,MDA含量的平均降幅也明顯低于其他三個(gè)時(shí)期,為34.75%。而在藥隔期低溫處理18 h后,小麥葉片的可溶性糖含量、CAT活性、SOD活性的平均降幅明顯高于其他三個(gè)時(shí)期,分別為32.33%、38.22%和45.20%;可溶性蛋白含量的平均降幅為24.32%,與雌雄蕊分化期的平均降幅(降幅最大,為25.68%)較為接近;而MDA含量的平均增幅明顯高于其他三個(gè)時(shí)期,為84.73%。說(shuō)明在藥隔期低溫處理后,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和保護(hù)酶活性降低,MDA大量積累,導(dǎo)致小麥植株抗寒能力減弱,也說(shuō)明藥隔期對(duì)倒春寒更為敏感。

表3 不同時(shí)期低溫處理下小麥品種的生理指標(biāo)平均值Table 3 Average values of physiological indices of wheat varieties with low temperature treatments at different stages

在藥隔期低溫處理6 h和12 h后,小麥葉片的可溶性糖含量平均增幅均明顯大于可溶性蛋白含量的平均增幅,低溫處理18 h后,小麥葉片的可溶性糖含量平均降幅也明顯大于可溶性蛋白含量的平均降幅;抗氧化酶類SOD和CAT的活性在低溫處理6 h后均呈上升趨勢(shì),且SOD活性平均增幅明顯大于CAT活性的平均增幅,而在低溫處理12 h和18 h后,SOD活性的平均降幅明顯大于CAT活性的平均降幅;MDA含量的變化與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性的變化成反比,且隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),其含量也在不斷增加。綜上,可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量可作為小麥春季抗寒性鑒定的生理指標(biāo)。

2.1.3 藥隔期低溫處理后幼穗凍害等級(jí)和葉片生理指標(biāo)的相關(guān)性

對(duì)藥隔期低溫處理不同時(shí)間后的小麥幼穗凍害等級(jí)和葉片生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)幼穗凍害等級(jí)和低溫處理12 h后的可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量之間相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平,相關(guān)系數(shù)分別為-0.824、0.822和-0.847。因此,低溫處理12 h后葉片中可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量可用于評(píng)價(jià)小麥的抗寒性。

2.2 藥隔期抗倒春寒性狀生理指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)藥隔期低溫處理12 h后測(cè)得的可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量的生理指標(biāo),計(jì)算其隸屬函數(shù)值,將各處理水平下的隸屬函數(shù)值平均后得到綜合評(píng)價(jià)值(D值)。從表4可以看出,11個(gè)代表性小麥品種的生理指標(biāo)隸屬值在同一低溫條件下差異較大,低溫脅迫后供試品種的D值在0.10～0.92之間,其中矮抗58最高,周麥18最低。根據(jù)D值,可將供試品種分為三類,第一類為抗寒性強(qiáng)的品種(0.65

表4 藥隔期低溫處理12 h后不同小麥品種生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和綜合評(píng)價(jià)值Table 4 Subordinative function values of different indexes and comprehensive evaluation values of different wheat varieties after low temperature treatment for 12 h at anther connective stage

2.3 藥隔期低溫處理后抗倒春寒小麥品種的產(chǎn)量及其構(gòu)成驗(yàn)證

從表5可以看出,藥隔期經(jīng)過(guò)低溫處理不同時(shí)間后,11個(gè)小麥品種的產(chǎn)量及其三要素均有所降低。在低溫處理6、12和18 h后,產(chǎn)量降幅最大的品種分別是周麥18、周麥22和淮麥33,分別為28.67%、48.89%和62.95%,與CK間均達(dá)顯著水平;降幅最小的品種分別是良星99、鄭麥7698和矮抗58,分別為7.22%、21.53%和26.01%,其中低溫處理6 h后良星99的產(chǎn)量與CK間差異不顯著。

表5 藥隔期低溫處理后不同小麥品種的產(chǎn)量及其構(gòu)成要素Table 5 Yield and its components of different wheat varieties after low temperature treatment at anther connective stage

單株穗數(shù)在低溫處理6 h后,降幅最大的品種為石麥22,降幅為17.24%;在低溫處理12和18 h后,降幅最大的品種均為周麥18,降幅分別為29.62%和40.74%。穗粒數(shù)在低溫處理6、12和18 h后,降幅最大的品種分別是山農(nóng)20、安農(nóng)0711和山農(nóng)20,降幅分別為16.53%、21.49%和32.08%。千粒重在低溫處理6 h和12 h后,降幅最大的品種均為周麥22,降幅為17.93%和29.40%;在低溫處理18 h后,降幅最大的品種為淮麥33,降幅為40.28%。

低溫處理6、12和18 h后,所有供試小麥品種單株穗數(shù)的平均降幅分別為6.51%、12.90%和18.78%;穗粒數(shù)的平均降幅分別為6.11%、11.15%和15.99%;千粒重的平均降幅分別為7.65%、16.11%和21.85%;產(chǎn)量的平均降幅分別為18.74%、35.06%和46.81%。由此可見,隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),所有小麥品種的產(chǎn)量及其構(gòu)成要素均逐步降低,而且低溫對(duì)千粒重的影響更大。

3 討論

倒春寒是春季低溫回暖后的突然降溫[23],常發(fā)生在小麥拔節(jié)期,該時(shí)期是小麥生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期[17],對(duì)溫度變化十分敏感[24-25]。鐘秀麗等[13]和吳青霞等[26]利用人工氣候室研究發(fā)現(xiàn),藥隔期可作為小麥春季抗寒性鑒定的敏感時(shí)期。本研究也發(fā)現(xiàn),藥隔期低溫處理后小麥幼穗受損程度最高,各項(xiàng)生理指標(biāo)大幅下降,也說(shuō)明藥隔期可作為春季抗寒性鑒定的生育期指標(biāo)。

植物在冷脅迫下可積累可溶性糖、可溶性蛋白等大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),增加細(xì)胞液濃度以防止原生質(zhì)體因結(jié)冰造成的傷害,從而保證細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性,在小麥抗寒過(guò)程中起重要作用[5,27-28]。本研究在人工氣候室對(duì)黃淮麥區(qū)11個(gè)代表性品種進(jìn)行春季抗寒性鑒定,結(jié)果表明,藥隔期小麥葉片中可溶性糖和可溶性蛋白含量的變幅均明顯高于其他幼穗發(fā)育時(shí)期;并通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),藥隔期低溫處理后可溶性糖含量的變幅大于可溶性蛋白含量,說(shuō)明可溶性糖含量受低溫影響更大,因此可溶性糖含量可作為抗寒性鑒定的生理指標(biāo)之一。

在低溫脅迫下,SOD、CAT等抗氧化酶能夠清除植物體內(nèi)多余的活性氧自由基或超氧陰離子,防止膜系統(tǒng)受損,保證植物體的正常生長(zhǎng)發(fā)育[8, 29]。本研究發(fā)現(xiàn),藥隔期低溫處理18 h后,小麥葉片CAT和SOD活性的平均降幅最大,分別為38.22%和45.20%,由于保護(hù)酶的大幅下降導(dǎo)致小麥抗寒能力減弱,小麥幼穗受損程度也最大;進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),藥隔期低溫處理后,SOD活性的平均變幅明顯高于CAT活性,說(shuō)明SOD活性在抗寒機(jī)制中發(fā)揮的作用更積極,因此SOD活性也可作為小麥抗寒性鑒定的生理指標(biāo)之一。

植物體內(nèi)的MDA含量可反映細(xì)胞膜在逆境脅迫下的破壞程度,且抗寒性強(qiáng)的品種MDA含量低于抗寒性弱的品種[30]。本研究發(fā)現(xiàn),與幼穗其他發(fā)育時(shí)期相比,藥隔期低溫處理18 h后小麥葉片的MDA含量平均增幅最大,為84.73%,推測(cè)原因是,低溫處理后隨著抗氧化酶的積累,小麥抗氧化能力有所增強(qiáng),但隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),活性氧的積累與清除的平衡被打破,引發(fā)脂膜過(guò)氧化產(chǎn)生MDA,表明MDA可作為小麥抗寒性鑒定的生理指標(biāo)之一。

Ji等[31]研究發(fā)現(xiàn),低溫處理下小麥單株產(chǎn)量的降低主要是由于每份材料的穗粒數(shù)減少。高 艷等[32]研究發(fā)現(xiàn),孕穗期倒春寒造成的減產(chǎn)主要是因?yàn)樗肓?shù)的降低。陳貴菊等[33]在藥隔期對(duì)不同品種進(jìn)行低溫處理,發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),品種結(jié)實(shí)率顯著下降,造成生育期推遲并縮短灌漿時(shí)間,最終導(dǎo)致千粒重下降。本研究在藥隔期經(jīng)過(guò)低溫處理后,所有小麥品種的產(chǎn)量及其三要素均有所降低,而且低溫對(duì)千粒重的影響更大。這與陳貴菊等[33]的研究結(jié)果相一致。

前人研究表明,低溫處理下小麥品種的可溶性糖、可溶性蛋白和MDA含量以及SOD和CAT活性等生理指標(biāo)存在較大差異,主要與品種自身生理特性、發(fā)育時(shí)期和處理時(shí)間有關(guān)[10, 26,31]。本研究表明,二棱期低溫處理18 h后小麥葉片的可溶性糖含量降低,其余不同處理時(shí)間的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD活性和CAT活性均有不同程度的增加;MDA含量在低溫處理12 h后,降幅最大。在小花分化期、雌雄蕊分化期、藥隔期和四分體時(shí)期低溫處理后,小麥葉片的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD活性和CAT活性隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢(shì),MDA含量則與之相反。不同品種的生理指標(biāo)值變化范圍較大,計(jì)算各指標(biāo)的相對(duì)性狀值,則可消除品種自身遺傳特性和品種對(duì)照值差異的影響[10-12]。

隸屬函數(shù)法是基于指標(biāo)相對(duì)性狀值,在測(cè)定多項(xiàng)指標(biāo)的基礎(chǔ)上來(lái)綜合評(píng)價(jià)植物的抗逆性[21-22],為小麥抗寒性的綜合評(píng)價(jià)提供了一種有效方法。本研究采用該方法對(duì)不同小麥品種進(jìn)行抗倒春寒生理指標(biāo)綜合評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)11個(gè)代表性品種在低溫處理后產(chǎn)量的降幅與品種抗寒綜合評(píng)價(jià)值基本符合,即抗寒綜合評(píng)價(jià)值高的品種在低溫處理后產(chǎn)量降幅較低,具有更高的抗寒性。為驗(yàn)證盆栽試驗(yàn)可靠性,本課題組于2015-2016年度同時(shí)在河南、河北、山東和安徽四個(gè)地區(qū),進(jìn)行自然條件下11個(gè)品種的田間抗倒春寒鑒定試驗(yàn),在2月15日和3月10日兩次溫度驟降8～10 ℃后,調(diào)查葉片凍害等級(jí)并測(cè)定所有品種的生理指標(biāo),利用隸屬函數(shù)法對(duì)品種抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),其評(píng)價(jià)值與葉片凍害等級(jí)基本吻合。本研究結(jié)果表明,通過(guò)隸屬函數(shù)法綜合值去衡量小麥品種的抗寒性是可靠的,在實(shí)際抗寒育種工作中可采用此方法進(jìn)行小麥品種的抗寒性鑒定或評(píng)價(jià)。