范騰陽(yáng),柯 迪,鄒 曲,任培超,肖 雪

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 全科醫(yī)學(xué)科,貴州 遵義 563099)

2018年全球新增癌癥1 810萬(wàn)例,癌癥死亡960萬(wàn)例。肺癌占癌癥總發(fā)病率的11.6%。目前,腎癌的發(fā)病率比肺癌的發(fā)病率低。但腎癌也是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤［1]。嫌色性腎細(xì)胞癌(chromophobe renal cell carcinoma,cRCC)是腎癌的一種。早期嫌色性腎細(xì)胞癌癥患者的治療方法主要是手術(shù)治療,晚期患者的治療主要采用綜合治療的方式。近年來(lái),靶向治療給癌癥患者帶來(lái)了新的希望,能提高癌癥患者的預(yù)后。然而,我們?nèi)孕枰獙ふ倚碌陌悬c(diǎn)盡可能提高癌癥患者的預(yù)后。

m6A調(diào)節(jié)基因在腎癌進(jìn)展中發(fā)揮最重要作用［2-4]。脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)是m6A調(diào)節(jié)基因。FTO在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中上調(diào)。FTO敲除損害了透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移能力。FTO通過(guò)阻止YTHDF2誘導(dǎo)PDK1 mRNA降解,以mA依賴性機(jī)制促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌生長(zhǎng)和遷移［3]。CBL原癌基因樣1(CBLproto-oncogene like 1,CBLL1)又名HAKAI和RNF188,且為m6A調(diào)節(jié)基因［5-6]。研究報(bào)道CBLL1表達(dá)水平增加與非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤大小有關(guān)。CBLL1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變,從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和侵襲。干擾m6A調(diào)節(jié)基因CBLL1表達(dá)可通過(guò)增加粘附蛋白表達(dá)和降低MMP2和MMP9表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞侵襲［7]。與健康人結(jié)腸組織相比,CBLL1在腺瘤和結(jié)腸腺癌中高表達(dá)。CBLL1表達(dá)升高能增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和侵襲,抑制E-鈣粘蛋白表達(dá),促進(jìn)N-鈣粘蛋白表達(dá)［8]。目前,CBLL1在cRCC中的作用尚不清楚。因此,本研究旨在探索CBLL1基因在cRCC進(jìn)展中作用和機(jī)制,為癌癥患者提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 鑒定CBLL1的表達(dá)水平 在癌癥基因圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)官網(wǎng)上下載24例正常組織樣本和65例癌組織樣本。數(shù)據(jù)類型為FPKM數(shù)據(jù)類型。此外,將24例正常組織樣本與65例癌組織樣本進(jìn)行整理和配對(duì)。最后有23對(duì)配對(duì)患者的正常組織和癌組織。隨后通過(guò)差異表達(dá)分析鑒定正常組織和癌組織中CBLL1的表達(dá)水平。

1.2 鑒定CBLL1的診斷價(jià)值 接受者操作特性曲線(receiver operating characteristic,ROC)分析是評(píng)估基因表達(dá)水平在正常組織和癌組織中是否具有診斷價(jià)值的常用方法之一［9]。在本研究中,我們通過(guò)ROC分析正常組織和cRCC組織中CBLL1基因表達(dá)水平是否具有診斷價(jià)值,且以曲線下面積作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。曲線下面積越靠近1表明CBLL1的診斷價(jià)值越高。

1.3CBLL1表達(dá)與cRCC患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CBLL1基因表達(dá)數(shù)據(jù)、預(yù)后和臨床特征數(shù)據(jù)合并后以CBLL1中位數(shù)表達(dá)值分組,探究CBLL1表達(dá)水平與cRCC患者T、N、M分期等資料之間的關(guān)系。此外,利用生存分析鑒定CBLL1表達(dá)水平與cRCC患者總生存時(shí)間、疾病特異性生存時(shí)間和PFI之間的關(guān)系。眾所周知,TNM分期是評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)。因此,我們基于TNM分期和CBLL1表達(dá)水平構(gòu)建了預(yù)后相關(guān)列線圖,且通過(guò)ROC分析和生存分析評(píng)估列線圖的可靠性和臨床價(jià)值。

1.4CBLL1共表達(dá)基因 基因與基因的相關(guān)性越大,表明兩基因之間的關(guān)系越強(qiáng)。在這里,我們通過(guò)Pearson相關(guān)性分析CBLL1強(qiáng)相關(guān)的基因。以P<0.001和相關(guān)性系數(shù)的絕對(duì)值大于0.6為標(biāo)準(zhǔn)定義為CBLL1的共表達(dá)基因。

1.5CBLL1相關(guān)功能和信號(hào)機(jī)制 GO和KEGG通路分析常用于探究單基因或多基因涉及的功能和信號(hào)機(jī)制［10]。我們通過(guò)GO和KEGG通路分析探究CBLL1共表達(dá)基因涉及的生物學(xué)過(guò)程、分子組成、細(xì)胞功能和信號(hào)機(jī)制,且以P<0.05為有差異的標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 免疫相關(guān)性分析 通過(guò)ssGSEA分析技術(shù)65例cRCC患者癌組織中的24種免疫細(xì)胞的表達(dá)水平。隨后將免疫細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)和CBLL1表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并,且通過(guò)Pearson相關(guān)性分析探究CBLL1表達(dá)與cRCC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平之間的相關(guān)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)分析正常組織和癌組織中CBLL1表達(dá)水平是否具有差異?？ǚ綑z驗(yàn)CBLL1表達(dá)水平與癌癥患者臨床特征之間關(guān)系。ROC分析和生存分析探究CBLL1的診斷和預(yù)后價(jià)值。利用Pearson相關(guān)性分析鑒定CBLL1共表達(dá)基因及CBLL1與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。P<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1CBLL1過(guò)表達(dá)與cRCC患者診斷有關(guān) 與正常組織相比,CBLL1在非配對(duì)患者癌組織中過(guò)表達(dá)(圖1A)。此外,CBLL1在配對(duì)患者癌組織中過(guò)表達(dá)(圖1B)。表1 顯示CBLL1表達(dá)水平與cRCC患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系。ROC分析顯示CBLL1的曲線下面積為0.756,表明CBLL1在正常組織和癌組織中具有診斷價(jià)值(圖1C)。

表1 CBLL1表達(dá)與癌癥患者臨床特征的關(guān)系(n,%)

A:CBLL1在非配對(duì)cRCC組織中的表達(dá)水平;B:CBLL1在配對(duì)cRCC組織中的表達(dá)水平;C:ROC分析CBLL1在正常組織和cRCC組織中的診斷價(jià)值;D～F:生存分析顯示CBLL1過(guò)表達(dá)與cRCC患者不良的生存時(shí)間和疾病特異性生存期有關(guān)。圖1 CBLL1表達(dá)水平升高與cRCC診斷和患者預(yù)后不良顯著相關(guān)

2.2CBLL1過(guò)表達(dá)與cRCC患者預(yù)后不良顯著相關(guān) 生存分析顯示CBLL1過(guò)表達(dá)與cRCC患者短的OS和DSS顯著有關(guān),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1D～F)。目前,TNM分期是評(píng)估癌癥患者預(yù)后的重要指標(biāo)。因此,我們通過(guò)列線圖顯示CBLL1過(guò)表達(dá)和TNM分期與cRCC患者的OS、DSS和PFI關(guān)系。列線圖顯示了CBLL1過(guò)表達(dá)的cRCC患者1、3、5年的OS、DSS和PFI顯著比CBLL1低表達(dá)患者更糟糕(圖2A～C)。ROC分析顯示3年和5年OS、DSS和PFI的曲線下面積均大于0.75(圖3A～C)。此外,通過(guò)生存分析發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與cRCC患者預(yù)后不良相關(guān)(圖3D～F)。初步表明我們構(gòu)建的列線圖能夠較好的預(yù)測(cè)cRCC患者預(yù)后。

2.3CBLL1共表達(dá)基因CBLL1共表達(dá)基因有609個(gè),且全部為正相關(guān)基因。圖4顯示了相關(guān)系數(shù)前60位共表達(dá)基因分別為TYW1、RSBN1L、ZNF800、NEMF、KRIT1、GTF2I、SCAF11、MPP5、RINT1、C12orf29、METTL14、TRAPPC11、LARP4、RXYLT1、G2E3、VPS50、USO1、TWISTNB、UHRF1BP1L、NUP205、TOGARAM1、PEX1、ZNF490、ANKRD17、SEC24B、KRR1、CDK13、EIF4E、MON2、ZNF92、POLR2B、CNOT4、SDAD1、FAM3C2、YLPM1、UBE3A、CRYBG3、REST、FAM122B、TCAF1P1、ZNF107、ZNF81、GTPBP10、CYP51A1、ZNF721、ALG10、BOD1L1、CCNT1、MIS18BP1、PPP1CC、CCNK、KIAA1109、COG5、PPP2R3C、SMARCAD1、FAM3C、RBM41、TRRAP、CCDC126和ARHGAP5與CBLL1的關(guān)系。

2.4CBLL1共表達(dá)基因涉及的功能和機(jī)制 GO注釋顯示CBLL1共表達(dá)基因涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)重塑、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)、泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)泛素化、染色質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合、RNA結(jié)合、DNA結(jié)合、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、組蛋白結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔因子、染色質(zhì)DNA結(jié)合等(圖5A～C)。KEGG通路分析顯示CBLL1共表達(dá)基因涉及泛素介導(dǎo)的蛋白水解、mRNA監(jiān)測(cè)途徑和核質(zhì)運(yùn)輸(圖5D)。

2.5CBLL1表達(dá)水平與cRCC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān) Pearson相關(guān)性分析顯示CBLL1表達(dá)水平與cRCC免疫浸潤(rùn)Th1細(xì)胞(r=-0.250)、pDC(r=-0.256)、NK細(xì)胞(r=-0.259)、TReg(r=-0.281)、輔助T細(xì)胞(r=0.332)、NK CD56 bright細(xì)胞(r=-0.351)和Tcm(r=0.386)水平顯著相關(guān),且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。CBLL1表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)志物IRF5(r=-0.331)、CCL2(r=-0.268)、PTGS2(r=0.265)、STAT1(r=0.401)、STAT6(r=0.373)、CCR8(r=0.355)、GZMB(r=-0.317)、ITGAX(r=-0.251)和HLA-DQB1(r=-0.248)水平相關(guān),且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

A～C:ROC分析檢驗(yàn)CBLL1相關(guān)列線圖的可靠性;D～F:生存分析高低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與cRCC患者總生存期、疾病特異性生存期和疾病進(jìn)展期之間的關(guān)系。圖3 ROC和生存分析評(píng)估CBLL1相關(guān)列線圖在cRCC中的作用價(jià)值

A:生物學(xué)過(guò)程;B:細(xì)胞組分;C:分子功能;D:信號(hào)機(jī)制。圖5 CBLL1共表達(dá)基因涉及的功能和機(jī)制

表2 CBLL1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)細(xì)胞標(biāo)志物水平有關(guān)

3 討論

在癌癥的發(fā)展過(guò)程中發(fā)生了多種分子的異常表達(dá)［11-13]。例如,METTL14在乳腺癌組織中較正常表達(dá)明顯上調(diào)。METTL14過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力［11]。WTAP在胃癌組織中高表達(dá)。WTAP表達(dá)增高的胃癌患者預(yù)后較差。WTAP過(guò)表達(dá)是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［12]。m6A甲基化調(diào)節(jié)基因CBLL1過(guò)表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良,且促進(jìn)了癌細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變、增殖和侵襲［7]。抑制長(zhǎng)鏈非編碼RNAXIST表達(dá)延緩了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,而miR-212-3p抑制則能逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。CBLL1過(guò)表達(dá)可消除miR-212-3p過(guò)表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化影響［14]。非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中circ_0072083的表達(dá)水平顯著升高。沉默circ_0072083表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞集落形成、細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。circ_0072083可通過(guò)體內(nèi)和體外抑制miR-545-3p表達(dá),并增強(qiáng)CBLL1表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展［15]。目前,CBLL1在cRCC中的作用和價(jià)值未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)CBLL1在cRCC組織中過(guò)表達(dá),且具有診斷cRCC的價(jià)值。CBLL1過(guò)表達(dá)與cRCC患者短的OS和DSS顯著有關(guān)。這表明CBLL1可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展,有望成為cRCC患者治療的靶分子。

研究已報(bào)道基于患者預(yù)后因素構(gòu)建的列線圖可預(yù)測(cè)癌癥患者的預(yù)后［16-18]。例如,Du等［16]報(bào)道,7個(gè)自噬相關(guān)lncRNA與腎細(xì)胞癌患者OS相關(guān)。自噬相關(guān)lncRNA預(yù)后特征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是腎細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。風(fēng)險(xiǎn)模型相關(guān)列線圖可預(yù)測(cè)腎細(xì)胞癌患者3年和5年的生存時(shí)間?；贑BLL1表達(dá)數(shù)據(jù)和TNM分期構(gòu)建的列線圖可顯示癌癥患者1、3、5年的生存時(shí)間、DSS和PFI。CBLL1表達(dá)水平升高的患者預(yù)后不良。ROC和生存分析結(jié)果表明CBLL1相關(guān)列線圖具有重要的臨床價(jià)值。然而,CBLL1相關(guān)列線圖的作用需要進(jìn)一步在臨床中驗(yàn)證。

癌癥被認(rèn)為是一種與腫瘤微環(huán)境紊亂相關(guān)的疾?。?9]。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的細(xì)胞群,由腫瘤上皮細(xì)胞、腫瘤免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫抑制細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等組成。腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的相互作用是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、生理耐受和局部、全身侵襲的關(guān)鍵因素［20]。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CBLL1表達(dá)水平與免疫浸潤(rùn)Th1細(xì)胞、pDC、NK細(xì)胞、TReg、輔助T細(xì)胞、NK CD56 bright細(xì)胞和Tcm水平顯著相關(guān),且與免疫細(xì)胞標(biāo)志物IRF5、CCL2、PTGS2、STAT1、STAT6、CCR8、GZMB、ITGAX和HLA-DQB1水平相關(guān)。這些結(jié)果初步表明CBLL1表達(dá)與癌癥免疫浸潤(rùn)相關(guān)。

本研究利用了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)樣本探索了CBLL1基因在cRCC中的作用。然而,這項(xiàng)研究也有一定的局限性。CBLL1在cRCC中的表達(dá)和預(yù)后價(jià)值,以及CBLL1表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系是基于生物信息學(xué)分析,這需要我們未來(lái)從我院收集組織樣本進(jìn)行驗(yàn)證。此外,我們還需要通過(guò)細(xì)胞功能研究進(jìn)一步探討CBLL1參與cRCC發(fā)生發(fā)展的作用和機(jī)制。總的來(lái)說(shuō),結(jié)果顯示CBLL1在cRCC中過(guò)表達(dá)。CBLL1表達(dá)增加與預(yù)后不良和免疫浸潤(rùn)有關(guān)。這提示CBLL1可能成為cRCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。