基于二維柱色譜分離的桂葉油精細(xì)化加工技術(shù)

史清照，張啟東，柴國璧，毛 健，席 輝，崔 凱，申玉軍，宋瑜冰，劉俊輝，馬 戎，張建勛，奚 安，范 武*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2. 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海市長陽路717 號 200082

3. 河北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，石家莊市橋西區(qū)工農(nóng)路360 號 050051

隨著卷煙自主調(diào)香水平的顯著提升，精準(zhǔn)調(diào)香和數(shù)字化產(chǎn)品設(shè)計對煙用天然香料功能的精細(xì)化提出了更高的要求［1-2］。然而，現(xiàn)有的煙用天然香料精細(xì)化加工技術(shù)往往以除雜為目的［3］，獲得的產(chǎn)品功能聚焦程度仍顯不足，如何凸顯煙用香料的風(fēng)格特征，提高天然香料產(chǎn)品的多樣性是煙用天然香料精細(xì)化加工面臨的新挑戰(zhàn)［4］。感官組學(xué)技術(shù)能夠精準(zhǔn)獲取復(fù)雜體系的特色風(fēng)味組群［5-6］，柱色譜分離是感官組學(xué)研究中常用的分離技術(shù)，例如，研究者利用凝膠滲透色譜（Gel permeation chromatography，GPC）獲得了奶酪中呈現(xiàn)苦味、酸味、咸味和鮮味的流份，進(jìn)而通過反相高效液相色譜（Reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）定位了味覺特征進(jìn)一步增強(qiáng)的特色風(fēng)味組群［7］；利用這種凝膠滲透色譜-高效液相色譜（Gel permeation chromatography-High performance liquid chromatography，GPC-HPLC）二維分離技術(shù)，還成功獲得了可可粉澀感、殘留感、苦味和酸味等化學(xué)感覺和味覺特征組群［8］，以及牛肉湯中苦味、鮮味、咸味、甜味、酸味和口干感的味覺特征組群等［9］。煙草行業(yè)研究者也利用該技術(shù)獲取了卷煙煙氣焦甜香、酸香、煙熏香和辛香等香氣特征組群及酸味、甜味和苦味等味覺特征組群［10-12］，以及煙葉提取物甜味、酸味、苦味和辣感等味覺和化學(xué)感覺特征組群［13-14］，有效支撐了復(fù)雜體系感官特征的剖析與多元化特色天然香料產(chǎn)品的開發(fā)［15］。GPC-HPLC 二維柱色譜分離技術(shù)針對復(fù)雜體系特色風(fēng)味組群的分離富集體現(xiàn)出較好的應(yīng)用價值。然而，目前的研究主要集中于組群成分的分析，較少涉及實(shí)用性香料特色風(fēng)味組群的開發(fā)和應(yīng)用，所使用的分離設(shè)備大多為分析型，且兩維分離色譜之間結(jié)構(gòu)差異較小，多為間斷式，無法實(shí)現(xiàn)特色風(fēng)味組群的在線分離及制備，存在分離效率低、時間長等問題［5，16］。針對以上問題，鄭州煙草研究院自主設(shè)計開發(fā)了一套制備級全自動二維柱色譜分離系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了自動進(jìn)樣、二維分離、并行平衡、組分收集和數(shù)據(jù)處理等多個功能的集成，可滿足天然香料特色風(fēng)味組群分離與制備的自動化和連續(xù)化的需求［17-18］。

桂葉油是典型的辛香香料，兼具甜香特征［19-21］，廣泛應(yīng)用于食品、日化和酒等各個行業(yè)［22-23］。本研究中以水蒸氣蒸餾法從肉桂葉中提取得到桂葉油，進(jìn)而利用自主設(shè)計的二維柱色譜分離系統(tǒng)對其進(jìn)行精細(xì)化加工，結(jié)合感官評價定位獲得了風(fēng)格特征突出的桂葉油精加工產(chǎn)品。同時，由于肉桂葉中黃樟素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，其提取物中不可避免地含有一定量的黃樟素［24-25］。黃樟素為2B 類致癌物［26］，因此也研究了二維柱色譜分離對特色風(fēng)味組群中黃樟素的去除能力，旨在為開發(fā)特征突出的多元化桂葉油產(chǎn)品，增強(qiáng)桂葉油在卷煙調(diào)香中的可用性提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

參比卷煙樣品由上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司參考YC/T 497—2014［27］所用“煙用香料參比卷煙”方法制作；桂葉為斯里蘭卡肉桂葉［優(yōu)斯進(jìn)出口精油（江門）有限公司］。

黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（8 000 μg/mL，北京百靈威科技有限公司）；丙酸蘇合香酯（98%，美國Acros 公司）；無水乙醇（AR，德國Merck公司）；蒸餾水（電導(dǎo)率0.1 μS/cm，廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；無水硫酸鈉（99%，北京伊諾凱科技有限公司）；食品級乙醇（95%，新鄉(xiāng)市先豐醫(yī)藥新材料有限公司）；去離子水（電導(dǎo)率≤4.3 μS/cm，美國Sigma-Aldrich 公司）；高純氮?dú)猓?9%，河南源正特種氣體有限公司）；葡聚糖凝膠（HT-SD01）、反向硅膠（HT-120-30-ODS-B）（蘇州匯通色譜分離純化有限公司）。

CIJECTOR型自動注射加香儀（德國Burghart公司）；7895A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；CP224S 型分析天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）；HY-5型振蕩器（金壇中大儀器廠）；超濾膜（孔徑0.22 μm，天津津騰公司）；一次性使用無菌注射器（1 mL，河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)股份有限公司）；ZNCL-GS130×70 集熱式磁力攪拌器（河南百澤儀器有限公司）；制備級全自動二維柱色譜分離平臺（鄭州煙草研究院）；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Büchi 公司）；LC-DCY-12SF 水浴氮吹儀［邦西儀器科技（上海）有限公司］。

1.2 方法

1.2.1 桂葉油的提取

將肉桂葉在40 ℃下烘干，粉碎至粒徑0.85 mm（20目）以下，加入5倍質(zhì)量的去離子水，常溫浸泡2 h，攪拌狀態(tài)下進(jìn)行水蒸氣蒸餾（浴溫100 ℃，2.5 h）。取出冷凝液，利用分液漏斗進(jìn)行油水分離，獲得桂葉油粗提物。向桂葉油粗提物中加入10%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）粗提物的無水硫酸鈉，室溫下攪拌干燥4 h，過濾得到桂葉油。

1.2.2 桂葉油的二維柱色譜分離

將35 mL 10%桂葉油的乙醇溶液使用制備級全自動二維色譜分離平臺進(jìn)行柱色譜分離。一維柱色譜尺寸為50 mm×400 mm，填料為葡聚糖凝膠，洗脫劑為水，流速為8 mL/min，洗脫時間為200 min，紫外檢測波長分別為230、280 nm。一維柱色譜分離的0～66 min、66～75 min、75～100 min、100～200 min 時間段的流出液分別進(jìn)入4 根捕集柱，捕集柱尺寸為26 mm×200 mm，填料為反向硅膠。捕集過程中收集捕集柱流出液，完成捕集后，使用乙醇洗脫捕集柱，洗脫液分別進(jìn)入第二維柱色譜分離；第二維色譜柱尺寸為20 mm×460 mm，填料為反向硅膠，二維分離時間為100 min，采用試管收集分離流份，每根試管收集15 mL，紫外檢測波長分別為230、280 nm。

依據(jù)第二維柱色譜紫外吸收信號將隸屬于同一紫外吸收峰下的流份合并為一組，將無紫外吸收的連續(xù)流份合并為另一組。將合并后的各桂葉油二維分離組群在40 ℃下進(jìn)行減壓蒸餾至20 mL 以下，加入0.5～1.0 g 無水硫酸鈉，室溫干燥4 h，室溫下氮吹除去剩余溶液中的乙醇，獲得組群的質(zhì)量與桂葉油的上樣質(zhì)量之比，計算各組群二維柱色譜分離的得率。

1.2.3 桂葉油分離組群的感官評價

將分離組群用乙醇溶解成0.2%的溶液并編號，用自動加香注射儀將各組群溶液以2 μg/g的用量加入?yún)⒈染頍?，在溫度?2±1）℃、相對濕度60%±2%的環(huán)境條件下密封保存48 h。

依據(jù)YC/T 497—2014［27］中的方法對桂葉油分離組群加香注射后的參比卷煙進(jìn)行感官評價，每0.5分為一個計分單位。感官評價團(tuán)隊由具有省級及省級以上卷煙評委資質(zhì)的評價人員組成，最終感官評價結(jié)果為評價人員對加香卷煙打分的算數(shù)平均值。

1.2.4 揮發(fā)性成分的定量分析

使用含0.5 μg/mL 丙酸蘇合香酯的乙醇溶液將待測樣品溶解為10 mg/mL 的溶液進(jìn)行GC-MS 分析。分析條件：

色譜柱：DB-WAXetr 毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：He；柱流量：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：50 ℃（0 min）3 ℃/min 250 ℃（0 min）；進(jìn)樣模式：直接進(jìn)樣，不分流模式；GC-MS傳輸線溫度：250 ℃，電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離能量：70 eV；掃描模式：全掃描。依據(jù)目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的出峰面積之比計算目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5 黃樟素的定量分析

用乙醇分別將黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測樣品稀釋為0.08 和2.00 mg/mL 的溶液進(jìn)行GC-MS 分析，條件同1.2.4 節(jié)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品中黃樟素的峰面積計算待測樣品中黃樟素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 桂葉油特色風(fēng)味組群的分離與感官評價

水蒸氣蒸餾獲得的桂葉油呈淺黃色透明油狀，得率為0.9%。使用自主設(shè)計研發(fā)的制備級全自動二維柱色譜分離系統(tǒng)（圖1）對桂葉油進(jìn)行精加工，桂葉油經(jīng)第一維柱色譜分離獲得的流份依據(jù)其紫外吸收情況（圖2a）共劃分為4 段，分別進(jìn)入第二維色譜柱。從第二維分離后流份的紫外吸收情況（圖2b～2e）看，桂葉油的二維分離度明顯高于一維。依據(jù)紫外吸收情況將第二維柱色譜分離流份劃分為8個組群，連同捕集柱的流出液（E1～E4）共獲得12 個組群。值得說明的是，圖2b、圖2c 中的紫外吸收峰出現(xiàn)了分離，但因該部分流份的整體得率相對較低，因而將不同吸收峰下的流份歸屬于同一組群（A1、B1）。二維分離后獲得的各組群得率見表1，12個組群的總得率為62.2%，不同組群間得率差異明顯，C1組群的得率最高（41.2%）。此外，由表1 可見，部分流份雖無紫外吸收，但仍有一定的得率，具有收集意義，比如C2 組群的得率為9.3%，約占總得率的15%。

表1 桂葉油二維柱色譜分離組群得率Tab.1 Yields for the groups of Cinnamon leaf essential oil separated by two-dimensional column chromatography

圖1 制備級全自動二維柱色譜分離系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of an automated preparative two-dimensional column chromatography system

圖2 桂葉油二維柱色譜分離流份的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of the fractions of Cinnamon leaf essential oil separated by two-dimensional column chromatography

從生產(chǎn)成本考慮，本研究中僅對得率大于1.0%的組群進(jìn)行感官評價。為了更加直觀地展示評價結(jié)果，加香卷煙與空白卷煙感官評價指標(biāo)打分一致的結(jié)果不再展示。桂葉油及組群C1、C2、D2和E3相對于空白卷煙各指標(biāo)得分的變化值見圖3。組群C1維持了分離前桂葉油較為顯著的辛香特征，同時甜香、甜味有所提升，參比卷煙的豐富性、細(xì)膩柔和及圓潤度明顯提升，喉部刺激與喉部干燥感顯著降低。組群C2 與C1 的感官特征差異顯著，與分離前桂葉油相比，組群C2 的辛香特征雖有所降低，但其甜香特征提升明顯，且提升效果優(yōu)于組群C1，同時組群C2降低了參比卷煙的收斂感。組群D2 明顯降低了參比卷煙的舒適感特征，收斂感和鼻腔刺激明顯升高，喉部刺激和喉部干燥感有所增加。組群E3 使參比卷煙的煙氣特征及舒適感特征均有明顯下降，參比卷煙的香氣顯著降低、雜氣明顯提升，鼻腔刺激顯著增加，豐富性有所降低，口腔刺激及殘留感等略有升高。從以上4個組群的感官評價結(jié)果可知，桂葉油經(jīng)二維柱色譜分離獲得的組群感官特征各異，該技術(shù)有效分離了感官表現(xiàn)不良的組群（D2、E3），獲得的組群C1 和C2 在參比卷煙上的作用各具特點(diǎn)，整體感官作用效果較好。桂葉油經(jīng)二維柱色譜精加工后獲得的產(chǎn)品風(fēng)格特征及產(chǎn)品多樣性均得以提升。

圖3 桂葉油及其二維柱色譜分離組群的感官評價結(jié)果Fig.3 Sensory evaluation results of the groups of Cinnamon leaf essential oil separated by two-dimensional column chromatography

2.2 桂葉油特色風(fēng)味組群揮發(fā)性成分分析

特色風(fēng)味組群C1和C2的揮發(fā)性成分分析結(jié)果及各成分的香氣特征見表2［20］。組群C1 中共檢出31 種揮發(fā)性成分，其中，具有典型辛香特征的丁香酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)720.92 μg/g，組群C1 中4-甲基-3-戊烯-2-酮、1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯、茴香腦、甲基丁香酚、桂醛、二氫丁香酚和異丁香酚等7 種成分也兼具辛香特征；共計16 種成分具有甜香特征，如萜品油烯、2-乙基己醇、β-石竹烯、α-亞乙基苯乙醛、乙酸桂酯等，這些成分可能是組群C1 呈現(xiàn)顯著辛香和甜香的內(nèi)在原因。組群C2 中共檢測出14 種揮發(fā)性成分，7 種成分具有甜香特征，此外，還包含少量木香成分（如莰烯、β-蒎烯）及果香成分（如檸檬烯）等。組群C2 中檢出成分個數(shù)及質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯低于組群C1，由C2 的感官評價結(jié)果可知，其辛香特征及豐富性均弱于組群C1，與感官評價結(jié)果吻合。感官評價結(jié)果顯示組群C2 呈現(xiàn)明顯的甜香特征；然而與組群C1相比，組群C2中甜香成分相對較少且質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，卷煙煙氣的風(fēng)味表現(xiàn)源于多種成分及成分間的直接或間接作用，考慮到煙氣的復(fù)雜性，組群C2感官特征的物質(zhì)基礎(chǔ)仍需要進(jìn)一步研究。

表2 桂葉油特色風(fēng)味組群揮發(fā)性成分的香氣特征及質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.2 Aroma characteristics and mass fractions of volatile components in characteristic aroma groups of Cinnamon leaf essential oil

2.3 桂葉油特色風(fēng)味組群黃樟素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

黃樟素是存在于諸多香料中的一種天然成分，肉桂葉中黃樟素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高［25］，由肉桂葉提取獲得的天然桂葉油中不可避免地含有一定比例的黃樟素，極大地限制了桂葉油在卷煙產(chǎn)品上的應(yīng)用。本研究中對經(jīng)二維柱色譜分離后的桂葉油特色風(fēng)味組群中黃樟素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析結(jié)果見圖4，可見，與分離前的桂葉油相比，組群C1、C2 中黃樟素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低了99.7%、98.7%，說明二維柱色譜分離技術(shù)能夠在顯著提升桂葉油感官特色的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)大幅度降低黃樟素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的目的，顯著增強(qiáng)了桂葉油精細(xì)化加工產(chǎn)品在卷煙上的可用性。

圖4 桂葉油特色風(fēng)味組群中黃樟素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.4 Mass fractions of safrole in the characteristic aroma groups of Cinnamon leaf essential oil

3 結(jié)論

①以桂葉油為研究對象，二維柱色譜分離技術(shù)能夠獲得感官特征差異顯著的風(fēng)味組群，其中部分組群能夠明顯提升參比卷煙的感官品質(zhì)；②利用GC-MS分析桂葉油特色風(fēng)味組群的揮發(fā)性成分，一定程度上能夠?yàn)榻忉尳M群的感官特征提供參考；③二維柱色譜分離技術(shù)能夠在提升桂葉油感官特征的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)大幅度降低黃樟素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的目的。