高云鵬，方 松，王以慧，譚效磊，馬志遠，溫 亮，劉 莉，孟 霖，寧 揚，徐秀紅*

（1.中國農業(yè)科學院煙草研究所，農業(yè)農村部煙草生物學與加工重點實驗室，青島 266101；2.中國農業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3.山東中煙工業(yè)有限責任公司，濟南 250100；4.山東臨沂煙草有限公司，山東 臨沂 276000；5.山東淄博煙草有限公司，山東 淄博 255000）

雪茄是一種純煙葉卷制而成的特殊的煙草制品，外觀質量是衡量其品質的重要方面，而雪茄煙葉晾制過程中的顏色變化對其外觀質量具有直接影響[1-2]。在晾制過程中，煙葉水分逐漸散失，丙二醛（MDA）含量和多酚氧化酶（PPO）活性受到影響[3]，色素降解與褐色物質沉積，雪茄煙葉外部呈現(xiàn)由綠變黃，再由黃變褐的過程[4]。MDA 是細胞膜脂過氧化的最終產物，高水平MDA 積累體現(xiàn)了細胞中膜脂過氧化程度加劇和活性氧物質增加[5]。膜脂過氧化作用和活性氧累積使細胞內的膜系統(tǒng)遭到破壞，不僅導致葉綠素大量降解[6-7]，引起葉片內部組織色素比例變化，且使多酚類物質得以從液泡中釋放，進一步被氧化[8-9]。PPO 是酶促棕色化反應中重要的介導物，能夠將多酚類物質氧化為醌，醌經過累積聚合成褐色物質[10]。在較高濕度條件下，PPO 活性上調，使得煙葉多酚氧化水平升高[11]。

成熟度是煙葉品質形成的重要因素[12]。不同成熟度煙葉活性氧積累差異較大[13]，MDA 含量不同[14]，因此雪茄煙葉在晾制過程中多酚類物質氧化程度不一，影響雪茄煙葉顏色。顏色變化是晾制進程是否合理的直接反映，是體現(xiàn)雪茄茄衣煙葉外觀質量的一個重要方面。現(xiàn)階段，前人研究大多集中于采收成熟度對晾制后雪茄煙葉品質的影響[15-16]，對不同采收成熟度雪茄煙葉晾制過程中顏色變化的研究較少。本文主要探討采收成熟度對雪茄煙葉晾制過程中顏色指標及相關色素、含水率、MDA、多酚和相關酶活性等的影響，明確其顏色變化規(guī)律，以期為雪茄煙葉成熟采收及晾制顏色的定向調控提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022 年在山東省臨沂市沂水縣進行，供試品種為雪茄煙品種QX103。試驗田土壤有機質14.82 g/kg，速效氮83.82 mg/kg，速效磷28.27 mg/kg，速效鉀120.61 mg/kg，pH 5.8。煙株遮蔭栽培，其他大田管理按當?shù)貎?yōu)質雪茄煙葉生產技術規(guī)程管理措施執(zhí)行。

1.2 試驗設計

在采收期選取大田長勢基本一致的煙株，設M1、M2、M3 三個成熟度，各處理煙葉外觀特征見表1。在中部葉（第11～12 葉位）達到相應成熟標準時進行采收編竿，每個處理標記6 竿，每竿隨機選取3 片煙葉測定SPAD 值。編煙密度為38～40 片/竿，竿距為35 cm。按照當?shù)貎?yōu)質雪茄煙葉生產技術規(guī)程進行晾制。選取代表性煙葉3 片，在晾制的第0（鮮煙葉）、5、10、15、20 天測定水分指標，另選3 片去除主脈后置于液氮中并轉移至–80 ℃冰箱保存，用于生理指標的測定。自晾制第0 天起選3 片葉在測定顏色參數(shù)后使用數(shù)碼相機采集圖像，至第25 天晾制結束。所有指標均進行3 次生物學重復。

表1 不同成熟度試驗設計Table 1 Different maturity test design

1.3 測定項目及方法

1.3.1 SPAD 值 使用SPAD-502 葉綠素測定儀沿煙葉一側葉緣分別測定葉尖、葉中、葉基SPAD 值，取3 點平均值為SPAD 值。

1.3.2 含水率 采用烘箱法[17]測定。

1.3.3 MDA 含量 利用MDA 試劑盒（南京博研生物科技有限公司）進行測定。

1.3.4 PPO 活性 利用PPO 酶試劑盒（南京博研生物科技有限公司）進行測定。

1.3.5 多酚類物質 采用YC/T 202—2006[18]的方法測定。

1.3.6 質體色素含量 采用紫外分光光度法[19]測定。

1.3.7 顏色表征 利用專利技術[20]量化判定煙葉綠色面積、黃色面積和褐色面積占比。通過色差計測定L*、a*、b*，計算褐變指數(shù)BI[21]。

1.4 數(shù)據處理

采用Excel 2019 和GraphPad Prism 9.5 進行作圖及數(shù)據統(tǒng)計，利用SPSS 21.0 對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 不同雪茄采收成熟度SPAD 值

如圖1所示，M1、M2和M3處理雪茄煙葉SPAD值平均值分別為41.79、40.69、39.51，且3 個采收成熟度處理的SPAD 值差異顯著（p<0.05）?？梢娧┣褵熑~SPAD 值的變化反映了成熟度的變化，隨SPAD 值下降，成熟度提高。

圖1 不同采收成熟度雪茄煙葉SPAD 值Fig.1 SPAD value of cigar tobacco leaves with different harvest maturity

2.2 不同成熟度葉片晾制過程中的色素降解和顏色變化

2.2.1 色素降解特征 如圖2 所示，各質體色素含量均隨晾制的進行而降低。晾制10 d，M1、M2、M3 處理葉綠素a 含量較晾制開始時分別下降了45.26%、57.52%、66.72%，晾制15 d，分別下降了79.53%、94.68%、95.93%。晾制10 d，M1、M2、M3 處理葉綠素b 含量較晾制開始時分別下降了51.97%、67.74%、84.67%，15 d 時M2、M3 處理分別下降了98.34%、98.78%，而M1 處理葉綠素b含量下降了79.4%。在0～15 d 內，M1 處理葉綠素a、b 下降幅度均小于M2、M3。3 個處理的類胡蘿卜素降解在整個晾制時期相對較緩。

圖2 晾制過程中煙葉色素變化Fig. 2 Changes of pigment in tobacco leaves during air-curing

2.2.2 顏色變化 由圖3可以看出，煙葉綠色面積占比隨晾制時間的延長不斷下降。在0～10 d，M3處理的綠色面積占比下降最快，其次是M2，M1處理下降最慢。煙葉黃色面積占比整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在0～5 d，M3處理黃色面積占比上升最快，M1最慢。在5～10 d，M3處理黃色面積占比開始下降，M2、M3上升，表現(xiàn)為M3>M2>M1。煙葉褐色面積占比隨晾制進程的推進逐漸上升。在0～10 d，M2、M3處理褐色面積占比緩慢上升，較M1快。在10～15 d，M1、M2、M3處理褐色面積占比分別上升了31.67%、41.63%、24.1%，至第15天，3個處理的褐色面積占比分別為33.36%、63.33%、41.90%?？傮w而言，M3處理的變黃速率最快，M1最慢；M2處理的變褐速率最快，M1最慢。

圖3 不同成熟度雪茄煙葉晾制過程顏色變化Fig. 3 Color changes of cigar tobacco leaves with different maturity during air-curing

如表2 所示，不同成熟度處理雪茄煙葉晾制結束時褐變指數(shù)BI值差異顯著。其中，M2 處理BI值最高，為185.2，M3 處理次之，M1 處理最低。晾制后，煙葉顏色由深到淺依次為M2、M3、M1。

表2 不同采收成熟度雪茄煙葉晾制結束顏色表征描述統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of color characterization of cigar tobacco leaves with different harvest maturity after air-curing

2.3 不同成熟度葉片晾制過程中的理化指標變化

2.3.1 葉片水分含量 如表3 所示，在整個晾制過程中，各成熟度處理雪茄煙葉的含水量呈“慢-快-慢”下降趨勢。各成熟度處理煙葉含水率在0～5 d緩慢下降，在5～10 d 大幅度下降，其中M2 處理水分下降最快，減少了37.85 個百分點，其次是M3，M1 水分下降最慢。在10～15 d，M1 處理水分下降了40.01 個百分點，下降幅度高于M2、M3。

表3 不同成熟度雪茄煙葉晾制過程中含水率變化Table 3 Changes of moisture content in cigar leaves with different maturity during air-curing %

2.3.2 丙二醛含量 如圖4 所示，雪茄煙葉在整個晾制過程，其MDA 含量呈現(xiàn)先上升后下降的單峰趨勢。各處理雪茄煙葉MDA 含量在采后0～5 d 內緩慢上升。在5～10 d，M2 處理的MDA 含量大幅度上升，達到61.05 nmol/g，增加146.54%，高于M1 和M3。在10～15 d，M1 處理的MDA 含量快速上升，M3 處理上升變緩，M2 處理則呈下降趨勢。在15～20 d，各成熟度處理的MDA 含量均呈下降趨勢。

圖4 不同成熟度雪茄煙葉晾制過程中MDA 含量變化Fig. 4 Changes of MDA content in cigar leaves with different maturity during air-curing

2.3.3 多酚氧化酶活性 由圖5 可知，不同處理煙葉PPO 活性在晾制過程中均呈先升高后降低的變化趨勢。在0～10 d，各處理的PPO 活性均逐漸上升，并在第10 天達到峰值，表現(xiàn)為M2>M3>M1，各處理之間差異顯著。在第15 天，各處理PPO 活性下降，活性高低表現(xiàn)為M1>M3>M2，較第10 天分別下降了15.88%、57.93%、31.18%，各處理之間差異顯著。在第20 天時，各處理之間PPO 活性無顯著性差異。

圖5 不同成熟度雪茄煙葉晾制過程中PPO 活性變化Fig. 5 Changes of PPO activity in cigar leaves with different maturity during air-curing

2.3.4 多酚含量 由圖6 可以看出，在整個晾制期間各處理綠原酸含量呈由快到慢的下降趨勢，0～10 d各處理雪茄煙葉綠原酸含量降幅分別為50.16%、90.81%、75.88%，M2 處理綠原酸含量下降最快，其次是M3，M1 處理綠原酸含量下降最慢。在10～15 d，M1 處理綠原酸含量下降最快，M3 下降趨緩，M2 下降最慢。在第20 天，各處理綠原酸含量表現(xiàn)為M1>M3>M2，差異顯著。與綠原酸變化規(guī)律不同，M1 處理蕓香苷含量在0～5 d 上升后快速下降，M2、M3 處理蕓香苷含量則隨晾制的進行不斷下降，在第20 天蕓香苷含量表現(xiàn)為M1 顯著高于M2、M3。各處理的莨菪亭含量變化與蕓香苷含量變化規(guī)律類似，在第20 天各處理莨菪亭含量無顯著差異。

圖6 雪茄煙葉晾制過程中多酚含量變化Fig. 6 Changes of polyphenol content in cigar leaves during air-curing

3 討 論

晾制過程中不同成熟度雪茄煙葉內部化學成分變化存在差異，導致煙葉外部變黃、變褐速度和程度不同，并進一步影響煙葉外觀質量[22]。本研究中，在晾制前期煙葉綠色面積占比減小幅度、黃色面積占比增加幅度均表現(xiàn)為M3>M2>M1，表明隨著采收成熟度的提高，煙葉變黃速度逐漸變快，這與武圣江等[23]研究結果一致。晾制0～10 d，各處理葉綠素a、b 降解幅度較大，類胡蘿卜素降解幅度較小，使得煙葉顏色由綠色轉為黃色，這與譚永浩等[24]研究結果相似。隨晾制的進行，發(fā)現(xiàn)煙葉褐色面積占比上升幅度表現(xiàn)為M2>M3>M1，且在晾制結束時，其褐變指數(shù)表現(xiàn)為M2>M3>M1，這與前人研究不一致[21,25]，原因有待進一步研究。

水分是細胞內多種酶及物質反應的物質基礎，直接影響雪茄晾制過程中煙葉的抗氧化能力和酶促棕色化反應，在晾制過程中與雪茄煙葉顏色的變化關系密切[26]。本研究中，各成熟度雪茄煙葉大量失水集中在5～15 d，這與劉博遠等[27]研究結果相似。中間成熟度M2 處理在5～10 d 水分下降幅度最高，結合膜脂過氧化作用后的產物MDA 含量變化趨勢，發(fā)現(xiàn)此時間段M2 處理雪茄煙葉的MDA 含量快速上升，大量積累，遠高于M1、M3，說明此時間段煙葉細胞膜脂過氧化作用劇烈，導致細胞膜系統(tǒng)的損傷和破壞，細胞裂解并大量失水。PPO 作為雪茄煙葉酶促棕色化反應的重要參與者，主要貯存在葉綠體中[28]，在煙葉水分逐漸散失、膜脂過氧化劇烈的條件下得以從葉綠體中釋放，活性隨著水分散失先上升后下降。M2 處理的PPO 活性在5～10 d 的上升速率和10～15 d 的下降速率均快于M1、M3。

多酚是一類獨特的化學物質，其含量直接影響晾制后雪茄煙葉的品質[29]。煙葉中主要的多酚類物質是綠原酸、蕓香苷、莨菪亭，共占煙葉中多酚類物質的90%左右。在煙葉失水過程中，由于膜通透性增大，PPO 氧化多酚，使煙葉褐色物質累積。本研究發(fā)現(xiàn)在晾制過程中M2、M3 處理的綠原酸、莨菪亭、蕓香苷含量呈下降趨勢，M1 處理的莨菪亭、蕓香苷含量在晾制前期稍有上升，與劉慧等[30]研究結果相似，可能是煙葉內木質素等物質分解轉化導致[31]。3 種多酚類物質從晾制5 d 后大幅度下降，以含量最高的綠原酸降解幅度最大，蕓香苷、莨菪亭的降解量較小。M2 處理晾制前期綠原酸含量下降快于M1、M3，這可能是M2 變褐快于M1、M3的原因；后期因為水分散失過快，酶活性迅速降低且底物變少，下降緩于M1、M3。

本研究還發(fā)現(xiàn)，M2 處理雪茄煙葉由于失水快，多酚類物質氧化也快，晾出的雪茄煙葉顏色較深。M1 處理雪茄煙葉部分出現(xiàn)青斑，顏色不均勻，一方面是葉綠素分解不完全，另一方面可能是綠原酸沒有被完全氧化[32]。

4 結 論

本研究表明，在一定范圍內提高雪茄煙葉采收成熟度會使晾制過程中的質體色素降解和失水變快，膜脂過氧化作用劇烈，促進酶促褐變，進一步加快雪茄煙葉的變色進程及加深晾制后顏色。以采收煙葉葉色為主要成熟度判斷指標，綠色煙葉晾制期間變黃、變褐均慢，晾制后顏色較淺；綠黃煙葉晾制期間變黃速度適中、變褐較快，晾制后顏色較深；黃綠煙葉晾制期間變黃、變褐均較快，晾制后顏色深淺居中。本研究為調整采收時的煙葉成熟度，調控晾制過程中的顏色和理化性狀變化從而進一步提高雪茄煙葉質量提供了理論依據和技術支撐。