李彥湘， 丁德東， 何 靜， 張金花， 趙吉桃， 趙 倩， 候彩霞， 朱 珠

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.隴南市科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所，甘肅 隴南 742500）

0 引言

植物侵染性病害是由細(xì)菌、真菌、線蟲(chóng)、原生動(dòng)物和病毒等多種微生物引起的[1]。其中，植物病原真菌是植物病害的主要致病因子之一，可侵染植物的根、莖、葉、花、果等大部分部位[2]。近年來(lái)，隨著各種作物和經(jīng)濟(jì)林病害的頻繁發(fā)生致使農(nóng)民收益大幅降低，現(xiàn)階段化學(xué)防治是控制該類病害的主要手段，然而，農(nóng)藥的頻繁密集使用，不僅嚴(yán)重影響作物品質(zhì)，甚至對(duì)人類和整個(gè)生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了巨大威脅[3-4]。因此，尋找高效、環(huán)保的綠色新型抗真菌藥劑已成為亟待解決的問(wèn)題之一[5-6]。

木醋液是以木材或木材加工廢棄物、采伐剩余物及森林撫育采伐獲得的枝椏和枝條等炭材在干餾設(shè)備中干餾導(dǎo)出的蒸汽氣體混合物經(jīng)冷凝分離后得到的液體，主要由酸類、酚類、酮類和醇類等組成，由于其組分的多樣性，木醋液具有抑菌抗炎、抗氧化、改善土壤、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和殺蟲(chóng)等功效[7-15]。研究表明，木醋液對(duì)多種病原菌具有抑制作用，并且成本低廉、無(wú)殘留、無(wú)污染，已成為當(dāng)前生物防治的熱點(diǎn)[16]。

目前，有關(guān)木醋液抑菌作用的相關(guān)研究主要集中在細(xì)菌，而對(duì)植物病原真菌的抑菌機(jī)理研究還鮮有報(bào)道[17-18]。本研究通過(guò)木醋液對(duì)7 種供試植物病原真菌的室內(nèi)毒力測(cè)定，篩選敏感菌株，并通過(guò)研究其對(duì)菌體呼吸代謝的影響，揭示其可能的抑菌機(jī)理，為木醋液在植物病害綠色防控中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，對(duì)農(nóng)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試植物病原真菌。木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、楊生盾殼霉（Coniothyrium populicola）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）、三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum） 和鏈格孢菌（Alternaria alternata），由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森保實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)活化后0～4 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）木醋液。桃殼木醋液，購(gòu)自石家莊宏森木炭有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木醋液抑菌活性篩選

采用菌絲生長(zhǎng)速率法，供試植物病原真菌于28 °C培養(yǎng)7 d 后取菌餅，分別接種于1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、10.5、14.5、18.5、22.5、26.5 和30.5 μL/mL的木醋液含藥培養(yǎng)基平板中央，繼續(xù)培養(yǎng)7 d 后，并計(jì)算其抑制率[19]。以添加同體積的無(wú)菌水為對(duì)照，每處理3 次重復(fù)。

1.2.2 木醋液對(duì)供試真菌孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的影響

（1）孢子懸浮液的制備。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上接種黃色鐮刀菌，28 °C 下黑暗培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水沖洗孢子并稀釋，最終制成濃度6×106個(gè)/mL 孢子懸浮液備用。

（2）木醋液對(duì)黃色鐮刀菌的孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的影響[20]。將孢子懸浮液及不同濃度的木醋液按照1∶1 的比例滴置于載玻片上，使木醋液的終濃度為0、1.5、2.5、3.5、4.5 和5.5 μL/mL（黃色鐮刀菌在木醋液濃度為6.5 μL/mL 時(shí)不生長(zhǎng)），混勻后倒置于濾紙保濕的培養(yǎng)皿中，以添加相同體積的無(wú)菌水為對(duì)照，28 °C黑暗培養(yǎng)6 h 后在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度，以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑一半記為萌發(fā)。每處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取5 個(gè)高倍鏡視野（每個(gè)視野下約20 個(gè)孢子）進(jìn)行鏡檢。

1.2.3 木醋液對(duì)供試真菌生物量的影響

將制備好的孢子懸浮液加入PDB 培養(yǎng)基中，經(jīng)28 °C、160 r/min 避光振蕩培養(yǎng)2 d 后，過(guò)濾菌絲并轉(zhuǎn)移至含藥PDB 培養(yǎng)基中（木醋液濃度分別為0、1.5、2.5、3.5、4.5 和5.5 μL/mL），經(jīng)28 °C、160 r/min 避光振蕩培養(yǎng)0、3、6、9、12、24、36 和48 h 后，收集菌絲晾干后稱質(zhì)量，每處理3 次重復(fù)。以無(wú)菌水為對(duì)照。

1.2.4 木醋液對(duì)菌絲體長(zhǎng)時(shí)間的呼吸抑制作用

用4 層紗布將PDB 培養(yǎng)48 h 的黃色鐮刀菌菌絲過(guò)濾后用無(wú)菌水沖洗3～4 次后，將適量菌絲體轉(zhuǎn)入新的含藥PDB 培養(yǎng)基（木醋液的濃度為0 和4.98 μL/mL）中，置于28 °C、160 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)。在0、3、6、9、12、24、36 和48 h 時(shí)分別吸取2 mL 菌液于氧電極中測(cè)定其呼吸耗氧速率，測(cè)定前于菌液中打入氧氣至含氧量穩(wěn)定[20]。每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2.5 木醋液對(duì)菌絲體短時(shí)間持續(xù)性影響

菌 絲 處 理同1.2.4。分 別 于0、30、60、90 和120 min 時(shí)吸取2 mL 菌液于氧電極中測(cè)定其呼吸耗氧速率，測(cè)定前于菌液中打入氧氣至含氧量穩(wěn)定[20]。每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2.6 木醋液對(duì)菌體三羧酸循環(huán)的影響

以菌體蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）和琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的變化情況來(lái)表示木醋液對(duì)菌體三羧酸循環(huán)的影響[21]。采用試劑盒法（上海優(yōu)選生物科技有限公司）分別測(cè)定0、3、6、9、12、24、36 和48 h 下菌絲中SDH 和MDH 活性。以每毫克組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）定義為一個(gè)SDH 活力單位。以每毫克組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 的2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)MDH 活性單位來(lái)定義。每個(gè)處理3 次重復(fù)，以同體積的無(wú)菌水為對(duì)照。

1.2.7 木醋液對(duì)菌體細(xì)胞內(nèi)能量代謝的影響

參考楊書(shū)珍[22]的方法，準(zhǔn)確稱取菌絲體0.6 g，加入到3%的高氯酸溶液中，充分冰浴研磨后于4 °C 下9 000 r/min 離心10 min。取上清液1 mL，加20%的氫氧化鉀溶液80 μL，4 °C 下反應(yīng)30 min 后于10 000 r/min離心5 min，取上清液置于4 °C 條件下保存待測(cè)。

三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和磷酸腺苷（AMP）含量的測(cè)定采用高效液相色譜法。高效液相色譜儀為Waters 2 695，檢測(cè)器為Waters 2 998 PDA 檢測(cè)器。液相色譜條件：色譜柱為Hypersil ODS（200 mm×4.6 mm，25 μm），RPC 18 柱，流動(dòng)相A 為200 mM pH 值6.5 的KH2PO4-K2HPO4緩 沖 液，流動(dòng)相B 為3%甲醇，等度洗脫，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016、Origin 2018 軟件完成，試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及方差顯著性分析利用SPSS 22.0 軟件，采用單因素方差分析和Duncan's 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 木醋液對(duì)7 種病原真菌的抑菌活性

由表1 可知，木醋液對(duì)黃色鐮刀菌、三線鐮刀菌、楊生盾殼霉、鏈格孢菌、木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌均有一定的抑制效果（P＜0.05），EC50值分 別 為 4.98 、 5.10、 5.33、 9.69、 10.80、 26.50 和22.04 μL/mL。其中，木醋液對(duì)黃色鐮刀菌的抑制效果最好。因此，以黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）為供試敏感菌株，進(jìn)行木醋液抑菌機(jī)理的相關(guān)研究。

表1 木醋液對(duì)7 種植物病原真菌的抑制作用Tab.1 Inhibitory effects of wood vinegar on 7 plant pathogenic fungi

2.2 木醋液對(duì)黃色鐮刀菌孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的影響

由表2 可知，木醋液顯著抑制了黃色鐮刀菌孢子的萌發(fā)和芽管的伸長(zhǎng)（P＜0.05）。經(jīng)28 °C 培養(yǎng) 6 h 后，對(duì)照的黃色鐮刀菌的孢子萌發(fā)了90%以上，而終濃度為5.5 μL/mL 的木醋液處理下的黃色鐮刀菌孢子萌發(fā)率僅為8.99%。在低濃度（1.5、2.5 μL/mL）處理下黃色鐮刀菌的芽管長(zhǎng)度分別較對(duì)照降低了21.93%和19.54%，當(dāng)木醋液處理濃度≥3.5 μL/mL 時(shí)，芽管長(zhǎng)度較對(duì)照均降低了55%以上。

表2 木醋液對(duì)黃色鐮刀菌孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)和生物量的影響Tab.2 Effects of wood vinegar on spore germination，germ tube elongation and biomass of Fusarium culmorum

2.3 木醋液對(duì)黃色鐮刀菌生物量的影響

由表2 可知，隨木醋液處理濃度的升高，黃色鐮刀菌的菌絲生物量逐漸降低，并且呈劑量依賴性（P＜0.05）。供試濃度下，木醋液對(duì)黃色鐮刀菌的菌絲生物量抑制率分別為17.94%、31.90%、48.75%、75.75%和95.22%。

2.4 木醋液對(duì)菌絲體長(zhǎng)時(shí)間的呼吸抑制作用

由圖1 可知，木醋液處理黃色鐮刀菌后，菌體呼吸速率隨處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并且對(duì)照組始終高于處理組。24 h 時(shí)，菌體呼吸速率達(dá)到峰值，對(duì)照組是處理組的1.13 倍；36～48 h 時(shí)，對(duì)照組和處理組均呈降低趨勢(shì)，并且處理組顯著低于對(duì)照組（P＜0.5）。表明木醋液能明顯抑制菌體細(xì)胞呼吸。

圖1 木醋液對(duì)黃色鐮刀菌呼吸速率的影響Fig.1 Effects of wood vinegar on respiration rate of Fusarium culmorum

2.5 木醋液對(duì)菌絲體短時(shí)間的持續(xù)性影響

由圖2 可知，木醋液處理黃色鐮刀菌后，菌體呼吸速率隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，對(duì)照組呼吸速率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。0～60 min 時(shí)，對(duì)照組和處理組無(wú)顯著差異；60～120 min 時(shí)，對(duì)照組顯著高于處理組（P＜0.05），表明木醋液在處理黃色鐮刀菌60 min 后發(fā)揮作用。

圖2 木醋液對(duì)黃色鐮刀菌呼吸短時(shí)效應(yīng)的影響Fig.2 Effects of wood vinegar on short-term respiration of Fusarium culmorum

2.6 木醋液對(duì)菌絲體三羧酸循環(huán)的影響

SDH 和MDH 是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定2 種酶的活性探究木醋液對(duì)黃色鐮刀菌三羧酸循環(huán)的影響。

由圖3a 可知，木醋液處理下，黃色鐮刀菌SDH 活性總體呈現(xiàn)降低的變化趨勢(shì)，并且對(duì)照組始終大于處理組。0～9 h 時(shí)，對(duì)照組與處理組無(wú)顯著差異；12～48 h 時(shí)，對(duì)照組顯著高于處理組（P＜0.05）；48 h 時(shí)，對(duì)照組 SDH 活性（2.00）是處理組（0.78）的2.66 倍。表明木醋液抑制了黃色鐮刀菌SDH 活性。

圖3 木醋液對(duì)黃色鐮刀菌SDH 和MDH 活性的影響Fig.3 Effects of wood vinegar on SDH and MDH activities of Fusarium culmorum

由圖3b 可知，木醋液處理下，黃色鐮刀菌MDH活性整體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，并且對(duì)照組始終大于處理組。9 h 時(shí)，木醋液處理后，菌體MDH 活性為14.96，對(duì)照組為9.23，是處理組的1.62 倍。表明木醋液降低了三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，抑制菌體細(xì)胞產(chǎn)能。

2.7 木醋液對(duì)菌體細(xì)胞內(nèi)能量變化的影響

為探究木醋液對(duì)黃色鐮刀菌能量代謝的影響，試驗(yàn)對(duì)菌體內(nèi)ATP、ADP、AMP 含量進(jìn)行了測(cè)定。由圖4a 可知，木醋液處理下黃色鐮刀菌ATP 含量呈下降的變化趨勢(shì)。0～12 h 時(shí)，菌體ATP 含量對(duì)照組大于處理組；24 h 時(shí)，處理組ATP 含量略有上升，高于對(duì)照組。

圖4 木醋液對(duì)黃色鐮刀菌能量代謝的影響Fig.4 Effects of wood vinegar on energy metabolism of Fusarium culmorum

由圖4b 和圖4c 可知，木醋液處理下黃色鐮刀菌ADP 含量和AMP 含量呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢(shì)，在9 h 時(shí)達(dá)到最大，菌體AMP 含量對(duì)照組是處理組的1.41 倍，ADP 含量對(duì)照組是處理組的6.61 倍。AMP 含量在 0～9 h 間對(duì)照組顯著高于處理組（P＜0.5），在12～48 h 間處理組顯著高于對(duì)照組（P＜0.5）。ADP 含量在0～24 h 間處理組顯著高于對(duì)照組（P＜0.5），在其他時(shí)間無(wú)顯著性差異（P＞0.5）。

由圖4 d 可知，木醋液對(duì)黃色鐮刀菌能荷總體呈降低的變化趨勢(shì)。在0～3 h 和36～48 h 時(shí)，菌體能荷處理組高于對(duì)照組，在6～24 h 時(shí)，對(duì)照組顯著高于處理組（P＜0.5），表明木醋液處理?xiàng)l件下的黃色鐮刀菌能荷代謝紊亂。

3 結(jié)束語(yǔ)

木醋液對(duì)7 種供試病原真菌均具一定抑菌活性，并且抑菌作用隨時(shí)間的增加而增強(qiáng)。其中，對(duì)黃色鐮刀菌抑菌效果最強(qiáng)，其EC50值為4.98 μL/mL，并且對(duì)其孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)及生物量均有抑制效果。木醋液可通過(guò)對(duì)菌體細(xì)胞呼吸、三羧酸循環(huán)和能量合成的阻礙，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的抑菌作用。