血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D、miRNA-34 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系△

張青松，楊迎旭，諶童童

鄭州市中心醫(yī)院甲狀腺外科，鄭州 450000

甲狀腺乳頭狀癌是臨床較為常見的惡性腫瘤，占所有甲狀腺惡性腫瘤的60%～90%，近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。甲狀腺乳頭狀癌好發(fā)于女性，與其他病理類型的甲狀腺癌相比預(yù)后較好，但由于存在明顯的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)越晚，轉(zhuǎn)移數(shù)目就會(huì)越多，若不盡早治療，易加重病情，治療效果并不理想[3]。相關(guān)研究顯示，約50%的甲狀腺乳頭狀癌患者經(jīng)手術(shù)治療后，仍然會(huì)存在明顯的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向，存在一定的二次手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療是改善甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后的關(guān)鍵，但微小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶往往不能進(jìn)行早期治療而延誤最佳的手術(shù)治療時(shí)間。甲狀腺乳頭狀癌患者的預(yù)后與多種因素有關(guān)，目前關(guān)于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D（vascular endothelial growth factor D，VEGFD）、miRNA-34 的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后關(guān)系的研究較少[6-7]?；诖?，本研究探討VEGFD、miRNA-34 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年5 月至2019 年7 月鄭州市中心醫(yī)院收治的甲狀腺乳頭狀癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《甲狀腺微小乳頭狀癌診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016 版）》[8]中甲狀腺乳頭狀癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②無(wú)肝腎功能異常；③未合并其他惡性腫瘤；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并代謝性疾?。虎诤喜⒄J(rèn)知功能障礙或精神疾?。虎廴焉锲诨虿溉槠谂?。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入352 例甲狀腺乳頭狀癌患者，其中男152 例，女200 例；年齡22～63 歲，平均（31.46±4.25）歲；腫瘤最大直徑1～4 cm，平均（2.32±0.23）cm；臨床分期：Ⅰ期85 例，Ⅱ期84 例，Ⅲ期91 例，Ⅳ期92例。選取同期鄭州市中心醫(yī)院收治的349 例甲狀腺結(jié)節(jié)患者，其中男118 例，女231 例；年齡21～61歲，平均（30.87±4.16）歲；結(jié)節(jié)最大直徑1～5 cm，平均（2.41±0.21）cm。甲狀腺乳頭狀癌患者與甲狀腺結(jié)節(jié)患者的性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化法檢測(cè)VEGFD 的表達(dá)情況

取352 例甲狀腺乳頭狀癌患者的甲狀腺乳頭狀癌組織及349 例甲狀腺良性病變患者的正常甲狀腺組織，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為3～4 μm，抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，每次3 min。采用內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑（試劑A）室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS 沖洗3 次，每次3 min。一抗采用羊抗人VEGFD 多克隆抗體，室溫孵育150 min，PBS沖洗3次，每次3 min，加入聚合酶輔助劑（試劑B），室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min。二抗采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白G 多聚合體（試劑C），室溫孵育30 min；新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，在顯微鏡下終止顯色，復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡下觀察。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定[9]：依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分。無(wú)著色計(jì)0 分，淡黃色染色計(jì)1 分，棕黃色染色計(jì)2分，棕褐色染色計(jì)3 分；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例﹤25%計(jì)1 分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例25%～50%計(jì)2 分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例﹥50%計(jì)3 分。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相乘，≤2 分為陰性表達(dá)，﹥2 分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)miRNA-34 的表達(dá)情況

取352 例甲狀腺乳頭狀癌患者的甲狀腺乳頭狀癌組織及349 例甲狀腺良性病變患者的正常甲狀腺組織，提取總RNA，紫外分光光度儀和1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA 為模板，使用PCR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。向得到的反應(yīng)液中添加不含RNA 酶的水補(bǔ)至50 μl，取1 μl 稀釋液進(jìn)行下一步熒光定量RT-PCR：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔，每批樣本設(shè)置1 個(gè)空白對(duì)照。采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-34 的相對(duì)表達(dá)量，以相對(duì)表達(dá)量0.247 為臨界值[10]，將miRNA-34 相對(duì)表達(dá)量﹥0.247 判定為陽(yáng)性，≤0.247 判定為陰性。

1.4 隨訪

采用電話或門診復(fù)查方式對(duì)甲狀腺乳頭狀癌患者進(jìn)行為期3 年的隨訪，隨訪時(shí)間截至2022 年7月。依據(jù)隨訪結(jié)果將甲狀腺乳頭狀癌患者分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組，將復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡判定為預(yù)后不良，其余判定為預(yù)后良好。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后不良的影響因素采用多因素Logistic 回歸分析；以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGFD、miRNA-34 表達(dá)情況的比較

甲狀腺乳頭狀癌組織中VEGFD、miRNA-34 陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于正常甲狀腺組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織中VEGFD、miRNA-34 表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同預(yù)后情況甲狀腺乳頭狀癌患者臨床特征的比較

隨訪3 年，352 例甲狀腺乳頭狀癌患者中預(yù)后良好319 例，預(yù)后不良33 例，分別作為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組。預(yù)后良好組和預(yù)后不良組甲狀腺乳頭狀癌患者年齡、腫瘤最大直徑、性別、分化程度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；預(yù)后良好組和預(yù)后不良組甲狀腺乳頭狀癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、VEGFD 表達(dá)情況、miRNA-34 表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表2）

2.3 甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后影響因素的多因素分析

將2.2 中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、VEGFD 表達(dá)情況、miRNA-34 表達(dá)情況作為自變量，甲狀腺乳頭狀癌患者的預(yù)后作為因變量，納入多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VEGFD 陽(yáng)性表達(dá)、miRNA-34 陽(yáng)性表達(dá)均是甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P﹤0.05）。（表3）

表3 甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

甲狀腺癌是頭頸部較為常見的內(nèi)分泌腫瘤，約10%的甲狀腺結(jié)節(jié)會(huì)惡化進(jìn)展為甲狀腺癌，其中甲狀腺乳頭狀癌占所有甲狀腺惡性腫瘤的80%以上，與其他惡性腫瘤相比，甲狀腺乳頭狀癌生長(zhǎng)速度較慢，預(yù)后較好，且好發(fā)于女性[11]。但由于15%左右的甲狀腺乳頭狀癌存在不同程度的惡性行為，可出現(xiàn)局部浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)及放療效果并不理想。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多基因及多階段相互作用的結(jié)果[12-13]?；诖耍柽M(jìn)一步探討VEGFD、miRNA-34在甲狀腺乳頭狀癌中的作用。

目前臨床越來(lái)越重視miRNA 與甲狀腺相關(guān)聯(lián)的研究，探討miRNA 異常表達(dá)與甲狀腺癌的關(guān)系有重要意義，其中miRNA 突變、缺失及表達(dá)異常均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程，有助于疾病的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估[14]。miRNA-34 編碼基因位于基因脆性位點(diǎn)區(qū)域，當(dāng)腫瘤基因的染色體出現(xiàn)異常，會(huì)導(dǎo)致miRNA-34 表達(dá)水平的改變。阮圣輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34 與細(xì)胞的放射敏感性有關(guān)，放射敏感性高的細(xì)胞經(jīng)照射后，miRNA-34呈高表達(dá)，甲狀腺是放療敏感器官，放射線是目前唯一確定的甲狀腺癌危險(xiǎn)因素，說(shuō)明甲狀腺接受放射線照射會(huì)導(dǎo)致miRNA-34 表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，這可能是因?yàn)閙iRNA-34 可通過(guò)靶向不同目的信使RNA，調(diào)控宿主蛋白的表達(dá)水平，導(dǎo)致細(xì)胞功能失常，從而導(dǎo)致組織病變甚至腫瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與正常甲狀腺組織比較，甲狀腺乳頭狀癌組織中miRNA-34 的表達(dá)明顯上調(diào)，提示miRNA-34 在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞分化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)結(jié)果有關(guān)。

亓軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，VEGFD 與受體結(jié)合后可激活受體酪氨酸激酶信號(hào)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤淋巴管生成和擴(kuò)張，增加入侵細(xì)胞與淋巴管的接觸，從而促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中VEGFD 的表達(dá)明顯上調(diào)，其高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移可明顯影響患者的預(yù)后，研究認(rèn)為，甲狀腺乳頭狀癌患者的預(yù)后可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后不良的甲狀腺乳頭狀癌患者VEGFD、miRNA-34 陽(yáng)性表達(dá)率較高，且多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VEGFD 陽(yáng)性表達(dá)、miRNA-34 陽(yáng)性表達(dá)均是甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P﹤0.05）。表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、VEGFD 表達(dá)情況、miRNA-34 表達(dá)情況對(duì)甲狀腺乳頭狀癌患者的預(yù)后均有重要的參考價(jià)值，臨床需加強(qiáng)對(duì)上述3 個(gè)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)，以改善患者的預(yù)后。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌組織中VEGFD、miRNA-34 均呈高表達(dá)，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VEGFD 陽(yáng)性表達(dá)、miRNA-34 陽(yáng)性表達(dá)均是甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。