史天茜，石永輝，武新穎，張益豪，秦哲，趙春霞，路達(dá)

（河北大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，河北 保定 071002）

傳統(tǒng)硝化反硝化脫氮工藝存在污泥產(chǎn)量高、有機(jī)碳需求量大、二次污染等問(wèn)題。一種極具發(fā)展前景的生物脫氮技術(shù)厭氧氨氧化（Anammox）工藝因具有高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，被越來(lái)越多的污水處理廠引進(jìn)使用[1-3]。由于厭氧氨氧化細(xì)菌（AnAOB）倍增時(shí)間長(zhǎng)（11～20d）[4]、對(duì)環(huán)境因素敏感（金屬[5]、溫度[6]、底物濃度[7]），限制了其在污水處理廠的進(jìn)一步應(yīng)用。

鐵是環(huán)境中常見(jiàn)的金屬元素之一，是大多數(shù)生物生長(zhǎng)必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素[8]。鐵對(duì)AnAOB 的生長(zhǎng)、繁殖尤為重要。AnAOB 中含有大量鐵結(jié)合蛋白（如血紅素c），是其進(jìn)行生理代謝不可缺少的成分，能保證Anammox 過(guò)程的正常進(jìn)行。此外，鐵還能影響胞外聚合物（EPS）分泌，改變AnAOB活性。可見(jiàn)，F(xiàn)e2+會(huì)影響Anammox反應(yīng)器的脫氮性能。Ding 等[9]比較了不同F(xiàn)e2+濃度對(duì)細(xì)菌繁殖的影響，發(fā)現(xiàn)Fe2+為0.12mmol/L 時(shí)對(duì)AnAOB 生長(zhǎng)促進(jìn)效果最好。Mak 等[10]研究了Fe2+對(duì)Anammox 的短期影響，發(fā)現(xiàn)0.08mmol/L Fe2+最有利于AnAOB 活性增強(qiáng)。Zhou等[11]發(fā)現(xiàn)進(jìn)水基質(zhì)濃度不變時(shí)，低濃度Fe2+能夠增強(qiáng)Anammox反應(yīng)器穩(wěn)定性。但這些文章主要研究一定的基質(zhì)濃度下Fe2+對(duì)Anammox系統(tǒng)的影響，少有人探究Fe2+對(duì)反應(yīng)器提高氮負(fù)荷的作用以及Fe2+對(duì)AnAOB的生理影響。

文章主要研究不斷提升氮負(fù)荷時(shí)，不同濃度的Fe2+對(duì)Anammox 膨脹顆粒污泥床（EGSB）反應(yīng)器脫氮性能、細(xì)菌生理變化及表面形態(tài)的影響，尋找Fe2+最適投加量，確定Fe2+與EPS、血紅素c 的關(guān)系，深入了解細(xì)菌的生理變化，這將有助于培養(yǎng)高性能Anammox 污泥，優(yōu)化Anammox 工藝，推進(jìn)實(shí)際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 接種污泥和合成廢水

接種污泥取自實(shí)驗(yàn)室已穩(wěn)定運(yùn)行300d的EGSB反應(yīng)器。接種后每個(gè)反應(yīng)器中初始混合液懸浮固體(MLSS)質(zhì)量濃度為(370±16)mg/L、混合液揮發(fā)性懸浮固體（MLVSS）質(zhì)量濃度為(297±13)mg/L。

每日處理4L 合成廢水，以NH4Cl 和NaNO2充當(dāng)?shù)矗∟H+4-N∶NO-2-N=1∶1.32），添加CaCl20.150g/L、 KH2PO40.010g/L、 MgSO40.300g/L、NaHCO30.050g/L。另外，每升中分別加入1mL微量元素Ⅰ和Ⅱ。微量元素Ⅰ組成：乙二胺四乙酸二鈉（EDTA 2Na）5.00g/L。微量元素Ⅱ組成：ZnSO4·7H2O 0.430g/L， H3BO40.014g/L， CuSO4·5H2O 0.250g/L， CoCl2·6H2O 0.240g/L， MnCl2·4H2O 0.990g/L， NaMoO4·2H2O 0.220g/L， NiCl2·6H2O 0.190g/L，EDTA 2Na 19.100g/L。進(jìn)水中通N2使溶解氧（DO） 濃度控制在0.100mg/L 以下，使用H2SO4或NaOH將進(jìn)水pH調(diào)整為8.00±0.05。水力停留時(shí)間（HRT）為24h。

1.2 Anammox反應(yīng)器和實(shí)驗(yàn)操作

采用4 個(gè)工作容積為4L 的EGSB 反應(yīng)器（R1、R2、R3、R4），結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成，外部用錫紙包裹避免光照，并配備恒溫水套保持溫度為(35±1)℃，使用蠕動(dòng)泵將反應(yīng)器內(nèi)基質(zhì)混合均勻。

圖1 EGSB反應(yīng)器結(jié)構(gòu)圖

圖4 反應(yīng)器Anammox反應(yīng)化學(xué)計(jì)量比變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)投加FeSO4·7H2O，使R1、R2、R3、R4 反應(yīng)器內(nèi)Fe2+濃度分別為1.00mg/L、5.00mg/L、7.50mg/L、10.00mg/L。逐漸提升氮負(fù)荷，當(dāng)出水NO-2-N 濃度連續(xù)5d 大于50.00mg/L 時(shí)，認(rèn)為反應(yīng)器性能受到嚴(yán)重抑制，停止運(yùn)行。

1.3 常規(guī)分析方法

每日采集水樣進(jìn)行檢測(cè)，其中NH+4-N 采用納氏試劑分光光度法測(cè)定，NO-2-N 使用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，NO-3-N使用酚二磺酸分光光度法，F(xiàn)e2+檢測(cè)采用鄰菲啰啉分光光度法[12]。pH 和DO 使用哈希-HQ40d 型便攜式pH 溶氧儀測(cè)定，MLSS與MLVSS在第36d采用重量法測(cè)定。

1.4 EPS的提取與分析

運(yùn)行的第36d，采集4 個(gè)EGSB 反應(yīng)器充分混合后的污泥，使用熱提取法提取EPS[13]。EPS 含量（mg/g VSS）為多糖（PS）與蛋白質(zhì)（PN）之和。其中PS 采用蒽酮比色法[14]測(cè)量，PN 采用改進(jìn)的Lowry法[15]測(cè)量。

1.5 血紅素c的測(cè)定

收集EGSB 反應(yīng)器在第36d 的混合污泥樣品，采用吡啶分光光度法[16]對(duì)兩個(gè)反應(yīng)器的污泥進(jìn)行血紅素c含量的檢測(cè)。具體步驟為：樣品經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗、超聲和離心后加入連二亞硫酸鈉和鐵氰化鉀，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)得550nm和535nm之間的吸光度差異，計(jì)算出血紅素c濃度（μmol/mg pro）。

1.6 掃描電子顯微鏡（SEM）

反應(yīng)器在第36d的混合污泥樣品用去離子水洗滌3次，離心后去掉上清液，然后用2.50%戊二醛溶液在4℃下固定24h，保證細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生改變。再用無(wú)菌水洗滌3次并離心，之后用梯度乙醇水溶液 （30%、 50%、 70%、 80%、 90%、 100%、100%）對(duì)細(xì)菌進(jìn)行逐級(jí)脫水處理，棄掉上清液。在室溫下自然脫水干燥后， 使用SEM（PHENOMPROX，荷蘭）觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe2+對(duì)反應(yīng)器脫氮性能的影響

此外，4 個(gè)反應(yīng)器的MLSS 變化見(jiàn)圖5。R0 為接種污泥的MLSS，運(yùn)行36d 后R1 中MLSS 出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，降低到284mg/L，反應(yīng)器內(nèi)污泥上浮嚴(yán)重。這說(shuō)明逐漸提高進(jìn)水氮負(fù)荷時(shí)，1.00mg/L 的Fe2+不利于AnAOB 生存和繁殖。而R2、R3、R4 反應(yīng)器MLSS均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，其增長(zhǎng)量R3（367mg/L）＞R2（192mg/L）＞R4（175mg/L）?？梢?jiàn)反應(yīng)器內(nèi)投加7.50mg/L 的Fe2+最有利于AnAOB 適應(yīng)基質(zhì)變化，細(xì)菌增殖最快，有助于抵抗高氮負(fù)荷沖擊。

圖5 反應(yīng)器MLSS變化

如圖6，在進(jìn)水NH+4-N、NO-2-N 濃度分別為130mg/L 和172mg/L 時(shí)，對(duì)比不同F(xiàn)e2+濃度對(duì)反應(yīng)器脫氮性能的影響，檢測(cè)4 個(gè)反應(yīng)器在24h 內(nèi)NH+4-N、NO-2-N濃度變化情況。由于初期反應(yīng)器內(nèi)TN 濃度較高，細(xì)菌易獲得基質(zhì)，因此4 個(gè)反應(yīng)器前4h NH+4-N 和NO-2-N 的降解速度接近。隨著反應(yīng)器內(nèi)TN濃度逐漸降低，5h后降解速度出現(xiàn)明顯差別。R2、R3、R4 的NH+4-N 降解速度均大于R1。NO-2-N 降解速度由快到慢為R3＞R2＞R4＞R1。隨著Fe2+濃度從1.00mg/L 增加到7.50mg/L，反應(yīng)器內(nèi)基質(zhì)降解速度逐漸增加，脫氮能力提高；當(dāng)Fe2+濃度進(jìn)一步提高到10.00mg/L，基質(zhì)降解速度減慢，反應(yīng)器性能降低。

圖6 4個(gè)反應(yīng)器NH4+-N和NO2--N濃度隨時(shí)間變化的分布

2.2 Fe2+對(duì)EPS的影響

EPS是細(xì)菌分泌的一種黏性物質(zhì)[18]，是AnAOB的重要組成部分，在促進(jìn)顆粒形成、抵抗外界環(huán)境變化、提高污泥沉降性能、維持系統(tǒng)穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用[19]。同時(shí)，EPS 中的羥基、羧基等陰離子官能團(tuán)吸附環(huán)境中的Fe2+[11]，有利于細(xì)菌利用Fe2+，加快細(xì)菌生理活動(dòng)，產(chǎn)生更多含鐵蛋白質(zhì)，提升對(duì)基質(zhì)代謝和不利環(huán)境的抵抗能力。并且EPS 吸附的Fe2+還能發(fā)揮壓縮雙電層作用，從而降低細(xì)菌間的靜電斥力[8]，促進(jìn)造粒。

不同F(xiàn)e2+濃度下EPS 的變化情況如圖7 所示，當(dāng)Fe2+濃度為1.00mg/L 時(shí)，系統(tǒng)內(nèi)Fe2+濃度無(wú)法滿足AnAOB 實(shí)際需求量，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足使代謝作用受到影響，細(xì)菌活性較低，減少了EPS分泌，導(dǎo)致R1 的EPS 含量最低，為179mg/g VSS。此時(shí)R1 對(duì)基質(zhì)的代謝能力最差。Fe2+濃度為5.00mg/L 時(shí)，AnAOB從外部環(huán)境中獲得了較多的Fe2+參與生理活動(dòng)，EPS 含量明顯增加到240mg/g VSS，細(xì)菌活性增強(qiáng)，相較于R1，R2 脫氮性能明顯提高。當(dāng)Fe2+含量增加到7.50mg/L，EPS 到最高值242mg/g VSS。Gao 等[20]也發(fā)現(xiàn)Fe2+能促進(jìn)EPS 生成并提高脫氮性能。此外，F(xiàn)e2+屬于還原性物質(zhì)，有利于維持反應(yīng)器中厭氧環(huán)境[21]。因此，F(xiàn)e2+濃度最佳時(shí)，營(yíng)造了最適宜的生存環(huán)境，促進(jìn)Anammox 過(guò)程和細(xì)胞代謝，加快生物量增長(zhǎng)，刺激EPS大量分泌，為微生物提供更多的胞外養(yǎng)分和酶[22]，增強(qiáng)細(xì)胞活性[20,23]，提高系統(tǒng)穩(wěn)定性，使得R3 脫氮性能高于其他反應(yīng)器。Fe2+濃度增加到10.0mg/L 時(shí)，EPS 降低到202mg/g VSS。由于Fe2+具有不可降解特性[11]，鐵的過(guò)量積累抑制了AnAOB 活性，減少了EPS 合成，降低了R4反應(yīng)器性能。

圖7 4個(gè)反應(yīng)器中EPS含量變化情況

PN/PS是反映污泥沉降性能的重要指標(biāo)，比值越高污泥沉降性能越差[24]、強(qiáng)度越低，污泥越容易流失，導(dǎo)致反應(yīng)器性能不穩(wěn)定。圖7 中隨著Fe2+濃度從1.00mg/L 增加到7.50mg/L，PN/PS 值呈下降趨勢(shì)，從最大值2.88降低到最小值1.10。且7.50mg/L時(shí)PS含量最高，而PS對(duì)污泥的聚集作用及沉降性能等方面的影響比PN 更大[25-26]。因此Fe2+濃度為7.50mg/L時(shí)，能夠改變EPS的組成，使得污泥沉降性能最好、強(qiáng)度最高，有助于保留生物量，反應(yīng)器脫氮性能得到提升。當(dāng)Fe2+濃度增加到10.00mg/L后，過(guò)量的Fe2+使PN/PS 的比值明顯上升到2.59，污泥沉降性能及聚集能力降低，影響AnAOB 對(duì)基質(zhì)的去除能力。

2.3 Fe2+對(duì)血紅素c的影響

血紅素c 能夠通過(guò)Anammox 合成，是AnAOB進(jìn)行代謝作用必須的一種物質(zhì)，有助于AnAOB 維持正常形態(tài)。此外，細(xì)胞內(nèi)供能、調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)等活動(dòng)都離不開(kāi)蛋白質(zhì)，而與血紅素c相關(guān)的蛋白質(zhì)占AnAOB 總蛋白量的38%[27]，因此血紅素c 對(duì)維持AnAOB活性具有重要作用。

各反應(yīng)器中血紅素c 濃度變化情況如圖8 所示。在1.00～7.50mg/L 范圍內(nèi)隨著Fe2+濃度增加血紅素c 含量逐漸提高，從1.18μmol/mg pro 達(dá)到3.76μmol/mg pro。AnAOB 的代謝依賴于聯(lián)氨合成酶（HZS）、聯(lián)氨脫氫酶（HDH）等酶，這些酶的形成與血紅素c 密切相關(guān)，而血紅素c 的合成需要嵌入Fe2+，從而形成活性區(qū)[28]，提高AnAOB 活性。此外，血紅素c通過(guò)與蛋白質(zhì)主鏈共價(jià)結(jié)合，在電子轉(zhuǎn)移和催化中發(fā)揮著非常重要的作用[29]，能促進(jìn)Anammox反應(yīng)進(jìn)行?？梢?jiàn)，適宜的Fe2+（7.50mg/L）能促進(jìn)血紅素c形成，增強(qiáng)細(xì)胞活性，提升AnAOB對(duì)環(huán)境中Fe2+的利用效率[30]，加快Anammox 過(guò)程，增強(qiáng)基質(zhì)代謝能力。但Fe2+濃度增加到10.00mg/L后，過(guò)量的Fe2+在反應(yīng)器中積累，產(chǎn)生毒性作用減弱了AnAOB進(jìn)行代謝等生理活動(dòng)，減少了細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，使AnAOB對(duì)抑制因子（如NO-2-N）更加敏感[21]，降低對(duì)高氮負(fù)荷的抵抗能力。因此，血紅素c含量下降到1.42μmol/mg pro，反應(yīng)器性能隨之降低。Zhang 等[31]和Ma 等[29]的研究也證明了血紅素c 與反應(yīng)器脫氮性能有關(guān)，血紅素c 含量越高脫氮性能越強(qiáng)。

圖8 4個(gè)反應(yīng)器中血紅素c濃度變化

2.4 Fe2+對(duì)AnAOB形態(tài)的影響

為了探究不同F(xiàn)e2+濃度對(duì)污泥表面形態(tài)的影響，各反應(yīng)器的SEM圖見(jiàn)圖9。SEM圖像能明顯觀察到顆粒表面的狀態(tài)，4個(gè)反應(yīng)器中顆粒表面都存在絲狀細(xì)菌與球菌。絲狀細(xì)菌具有支撐顆粒骨架的作用，可為微生物聚集構(gòu)建框架[32]。如圖9(a)和圖9(d)微生物表面空洞較多，部分細(xì)胞間有較大間隙，顆粒松散，不利于細(xì)菌沉降和聚集，阻礙Anammox 過(guò)程[28]，圖9(a)中此現(xiàn)象更為明顯。這一現(xiàn)象與Fe2+濃度為1.00mg/L和10.00mg/L時(shí)PN/PS值較高一致，說(shuō)明了Fe2+濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)對(duì)污泥結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，不利于反應(yīng)器在高氮負(fù)荷下運(yùn)行。Fe2+濃度為5.00mg/L 和7.50mg/L 時(shí)，PN/PS 值降低，有利于污泥沉降和聚集。圖9(b)和圖9(c)證實(shí)了這一點(diǎn)，圖中顆粒表面存在緊實(shí)和致密的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，顆粒緊湊，這有利于擴(kuò)大與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，使更多的物質(zhì)被細(xì)菌吸收，加快基質(zhì)的去除速度。結(jié)合4個(gè)反應(yīng)器的脫氮性能，可見(jiàn)菌體表面結(jié)構(gòu)越致密，顆粒穩(wěn)定性越強(qiáng)，有助于污泥團(tuán)聚和沉降，增強(qiáng)對(duì)基質(zhì)的去除能力。

圖9 污泥SEM圖

3 結(jié)論

（1）Fe2+濃度為7.50mg/L 時(shí)，EGSB 反應(yīng)器脫氮性能最強(qiáng)；進(jìn)水TN 為302mg/L 時(shí)，TN 去除率達(dá)到84.2%。

（2）AnAOB的EPS組成和血紅素c變化趨勢(shì)與反應(yīng)器脫氮性能一致。Fe2+濃度在7.50mg/L 時(shí)，EPS 與血紅素c 達(dá)到最大值242mg/g VSS 和3.76μmol/mg pro，PN/PS 達(dá)到最小值1.10，且顆粒表面更加密實(shí)，結(jié)構(gòu)更加牢固，同時(shí)MLSS也達(dá)到最大值（737mg/L）。因此7.50mg/L 的Fe2+能增強(qiáng)細(xì)菌活性，促進(jìn)基質(zhì)代謝，有助于抵抗高氮沖擊，反應(yīng)器性能達(dá)到最高。

（3）適宜的Fe2+進(jìn)入Anammox體與細(xì)胞內(nèi)特定結(jié)構(gòu)結(jié)合，促進(jìn)形成血紅素c并參與細(xì)菌代謝，保證生理活動(dòng)正常進(jìn)行，提高細(xì)菌活性，分泌大量EPS，吸收更多胞外養(yǎng)分，使顆粒變得更加致密，結(jié)構(gòu)更加牢固。有助于污泥團(tuán)聚和沉降，保留生物量，應(yīng)對(duì)高氮負(fù)荷沖擊，最終增強(qiáng)反應(yīng)器脫氮能力。然而，由于Fe2+對(duì)微生物具有雙面作用，其促進(jìn)/抑制Anammox 過(guò)程更加深入的作用機(jī)理仍有待研究和完善。