楊婷婷，羅毅皓*，張藝煒，馮聲寶，孫萬成，談婷，李善文，孔令武

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2.青?；ブ煊拥虑囡乒煞萦邢薰荆嗪：| 810500）

青稞是種植在高原缺氧環(huán)境中的一種特色農(nóng)作物，與釀酒常用的高粱相比，青稞的營養(yǎng)成分具有一定優(yōu)越性，含有更豐富的β-葡聚糖、多酚和維生素B

等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。目前有研究發(fā)現(xiàn)青稞總多酚含量可達到414.55 mg/100 g，比燕麥和藜麥中的總多酚含量更高[2]，且不同品種和產(chǎn)地的青稞中總多酚含量存在顯著差異[3]。青稞多酚提取物中主要以結(jié)合酚為主[4]，其次為游離酚。經(jīng)過發(fā)酵處理后的青稞多酚抗氧化能力提高，即在微生物作用下多酚以游離態(tài)溶出，使游離多酚和結(jié)合多酚的含量均顯著增加，且總多酚與抗氧化活性之間存在極強的相關(guān)性，因此總多酚含量增加能提升青稞多酚的抗氧化活性[5]。

青稞酒是以青稞為主要原料，采用“清蒸清燒四次清”的獨特釀造工藝制成的清香型白酒。與傳統(tǒng)高粱酒相比，青稞酒酸和酯的比例較低，微量風(fēng)味成分的含量更豐富，含有18 種對人體健康有益的差異萜烯類物質(zhì)[6]。

青稞酒糟（highland barley fermentation spent，HBFS）是青稞酒釀造后剩余的酒渣，別名酒醅糟和粕，是一種純青稞原糧酒糟[7]。濕青稞酒糟產(chǎn)量大，目前青稞酒的年銷量1.13 萬t[8]，釀造1 t 青稞酒會產(chǎn)生1 t 左右的HBFS。前期研究發(fā)現(xiàn)釀造后的酒糟中含有多酚、維生素、蛋白質(zhì)、γ-氨基丁酸以及β-葡聚糖等物質(zhì)[9]，Gibreel等[10]研究發(fā)現(xiàn)，酒糟中含有豐富的酚類化合物。與傳統(tǒng)高粱酒糟相比，青稞酒糟中單寧含量更低，蛋白質(zhì)和碳水化合物含量更高[11]，同時青稞酒糟pH 值約為3.5，營養(yǎng)豐富的酸性環(huán)境利于微生物生長，導(dǎo)致酒糟腐敗，從而造成環(huán)境污染和資源浪費。因此，以酒糟為原料提取活性成分能有效防止環(huán)境污染，且具有低成本、高效益等優(yōu)點。

目前國內(nèi)外學(xué)者的研究成果表明，HBFS 最主要的利用途徑是制成飼料和肥料[12]，但這種簡單的處理方式會造成資源浪費及產(chǎn)品附加值低。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)微波提取的啤酒麥糟（brewers'spent grain，BSG）的酚類化合物具有良好的抗氧化能力[13]；Landeka Jurˇcevic等[14]研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒糟多酚對抗氧化應(yīng)激有顯著作用。因此，研究青稞酒糟酚類化合物的抗氧化活性，是實現(xiàn)青稞酒糟高值化利用的有效途徑之一。

目前超聲波輔助提取已應(yīng)用于多種植物化合物的提取[15]，通過提高萃取溫度，提高待萃取植物化合物的溶解度，顯著縮短提取時間，但易氧化的酚類化合物長時間暴露于高溫環(huán)境中會加速氧化。因此，獲得最佳的提取溫度、提取時間和料液比對于最大限度地提高工藝得率和目標(biāo)化合物的穩(wěn)定性非常重要。本研究采用超聲波輔助提取青稞酒糟多酚并對其進行體外抗氧化活性研究，以期為后續(xù)開發(fā)新型抗氧化產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青稞酒糟：青?；ブ煊拥虑囡乒煞萦邢薰荆?.1-二苯基-2-苦肼基（1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（≥97.0%）（生化試劑）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；福林酚試劑（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；抗壞血酸（VC）（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）：北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

潮汐研磨機（800A）：東莞市華太電器有限公司：電子分析天平（ESJ110-413）：沈陽龍騰電子有限公司；雙光束紫外可見分光光度計（UV-1780）：島津儀器（蘇州）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）：常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

取一定量干酒糟，潮汐研磨機打粉。過80 目篩，備用。

1.2.2 單因素試驗

根據(jù)朱俊玲等[16]的方法稍作修改，得到多酚提取液，于4 ℃冰箱中保存，待測。

固定超聲溫度60 ℃，料液比1 ∶15（g/mL），超聲時間40 min，考察超聲功率（240、320、400、480、560 W）對多酚得率的影響。

固定超聲溫度60 ℃，料液比1 ∶15（g/mL），超聲功率400 W，考察超聲時間（30、35、40、45、50 min）對多酚得率的影響。

固定料液比1 ∶15（g/mL），超聲功率400 W，超聲時間40 min，考察超聲溫度（40、45、50、55、60 ℃）對多酚得率的影響。

固定超聲溫度60 ℃，超聲功率400 W，超聲時間40 min，考察料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]對多酚得率的影響。

1.2.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇超聲溫度、超聲功率、超聲時間和料液比進行四因素四水平的正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化。正交試驗因素與水平如表1所示。

1.2.4 多酚得率測定的計算

參考T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定分光光度法》[17]稍作修改進行檢測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取一定量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水配制成濃度為0、4、8、12、20、30 mg/L 的溶液。取1.0 mL 沒食子酸溶液、2.5 mL 福林酚試劑和2.5 mL 15% Na2CO3溶液加入10 mL 具塞試管中，蒸餾水定容至刻度，振蕩1 min，于40 ℃水浴中反應(yīng)60 min，在750 nm 波長下測定吸光度。

待測液的配制：將1.0 mL 青稞酒糟多酚提取液加入10 mL 容量瓶中，用9 mL 60%乙醇定容至刻度，超聲處理10 min 后，靜置待測。

將1.0 mL 待測液、2.5 mL 福林酚試劑和2.5 mL 15% Na2CO3溶液加入10 mL 具塞試管中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻。40 ℃水浴60 min，靜置冷卻20 min，待測。

多酚含量計算公式如下。

X=c×10×n

式中：X表示提取液中的多酚含量，mg/mL；c表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出的待測液中的多酚含量，mg/mL；10 表示稀釋倍數(shù)；n表示樣品稀釋倍數(shù)。

多酚得率計算公式如下。

式中：A表示多酚得率，mg/g；X表示提取液中多酚的含量，mg/mL；v表示提取液總體積，mL；m表示HBFS的質(zhì)量，g。

1.3 青稞酒糟多酚的體外抗氧化試驗

1.3.1 對DPPH·的清除效果

參考Abeynayake 等[18]的方法稍作修改。向具塞試管內(nèi)加入0.5 mL 樣品液和2 mL 0.04 mg/mL DPPH 溶液（吸光度記為A）i，取無水乙醇代替DPPH 溶液（吸光度記為A）j，取無水乙醇代替其中的樣品溶液（吸光度記為A）0，上述3 種混合液混勻后于室溫下放置30 min，2 000 r/min 離心10 min，取上清液在517 nm 處測定吸光度。VC做陽性對照。DPPH·清除率（Y1，%）計算公式如下。

Y1=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.3.2 對羥基自由基（·OH）的清除效果

參考谷睿等[19]的方法進行檢測。取1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液、1 mL 9 mmol/L 硫酸鐵溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，不同濃度的樣品溶液1 mL 和去離子水（吸光度記為A）x；用去離子水替代其中的過氧化氫溶液（吸光度記為A）y，用過氧化氫代替其中的樣品溶液（吸光度記為A0），搖勻后于37 ℃水浴15 min，在510 nm 處測定吸光度。以VC作為陽性對照?！H 清除率（Y2，%）計算公式如下。

Y2=[1-（Ax-Ay）/A0]×100

1.3.3 對超氧自由基（·O2-）的清除效果

參考Kiss 等[20]的方法稍作修改。4 425 μL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，加入鄰苯三酚溶液75 μL，迅速混合，每30 s 記錄1 次讀數(shù)，30 s 時的吸光度記為A30；300 s時的吸光度記為A300，即ΔA0=A300-A30。

取450 μL 樣品溶液，2 500 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4），再加鄰苯三酚溶液50 μL，迅速混合，每30 s 記錄1 次讀數(shù)，30 s 時的吸光度記為A30；300 s時的吸光度記為A300，即ΔA樣=A300-A30?？瞻讓φ战M以相同體積蒸餾水代替樣品?！2-清除率（Y3，%）計算公式如下。

Y3=（ΔA0-ΔA樣）/ΔA0×100

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用IBM SPSS statistics 24 軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，以P<0.05 表示差異顯著，繪圖選用Origin Pro軟件，所有試驗至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞酒糟多酚的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 青稞酒糟多酚含量的測定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

采用不同濃度沒食子酸制作標(biāo)曲，得到線性方程y=0.010 33x+0.008 4，R2=0.998 1，線性關(guān)系良好。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算待測液中青稞酒糟的多酚含量。

2.1.2 單因素試驗

2.1.2.1 超聲功率對多酚得率的影響

超聲功率對多酚得率的影響見圖2。

由圖2 可知，超聲功率在240～400 W 時，青稞酒糟多酚得率隨著超聲功率增加而增加，超聲功率在400～560 W 時，青稞酒糟多酚得率隨著超聲功率增加而減少，在400 W 時達到最大值。隨著超聲功率的增加，超聲波的空化效應(yīng)使青稞酒糟中植物細胞壁被大量破壞，加速多酚進入提取溶劑中，但當(dāng)超聲功率過高時，較高的超聲功率產(chǎn)生熱效應(yīng)使提取溶劑中部分多酚溶解，導(dǎo)致多酚得率降低。因此選擇320、400、480、560 W 進行正交試驗。

2.1.2.2 超聲時間對多酚得率的影響

超聲時間對多酚得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對多酚得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on yield of polyphenols

由圖3 可知，隨著提取時間延長，青稞酒糟的多酚得率先增大后減小，在超聲40 min 時達到峰值。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是超聲時間越長越利于多酚溶出，但多酚長時間處于高溫環(huán)境和超聲環(huán)境中，超聲波的熱效應(yīng)對青稞酒糟多酚的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響，溶液中部分多酚類物質(zhì)降解，導(dǎo)致多酚得率降低。因此選擇35、40、45、50 min 進行正交試驗。

2.1.2.3 超聲溫度對多酚得率的影響

超聲溫度對多酚得率的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對多酚得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound temperature on yield of polyphenols

由圖4 可知，超聲溫度低于55 ℃時，多酚得率隨著溫度升高而增加，可能是因為溫度升高，分子熱運動加快，加快多酚浸出的速度。多酚得率在55 ℃時達到最大值，當(dāng)超聲溫度從55 ℃升高到60 ℃時，多酚得率隨溫度升高而減小。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因為植物多酚對高溫環(huán)境比較敏感，60 ℃的超聲溫度過高，高溫環(huán)境破壞部分青稞酒糟多酚的結(jié)構(gòu)，同時高溫環(huán)境會加速提取溶劑揮發(fā)，影響提取的料液比，從而導(dǎo)致青稞酒糟多酚得率降低。因此選擇40、45、50、55 ℃進行正交試驗。

2.1.2.4 料液比對多酚得率的影響

多酚類物質(zhì)為多羥基化合物，這類物質(zhì)能溶于水，易溶于乙醇，但由于水中存在部分溶解氧，容易導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的氧化，影響多酚的抗氧化能力，因此選擇乙醇作為提取溶劑。料液比對多酚得率的影響見圖5。

圖5 料液比對多酚得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on yield of polyphenols

由圖5 可知，當(dāng)溶劑添加量逐漸增加，多酚得率逐漸增大，但料液比1 ∶25（g/mL）時的多酚得率較1 ∶20（g/mL）增幅較小，提取時使用的溶劑量過多，提取液中會溶解更多雜質(zhì)，為避免溶劑浪費，提高提取液中多酚類物質(zhì)的純度，所以選擇1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20（g/mL）進行正交試驗。

2.1.3 正交試驗結(jié)果與分析正交試驗結(jié)果和差異性分析見表2 和表3。

表2 正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

續(xù)表2 正交試驗結(jié)果與分析Continue table 2 Orthogonal test results and analysis

表3 差異性分析Table 3 Difference analysis

由表2 可知，不同提取因素對青稞酒糟多酚得率影響程度不同，在4 種因素中料液比對多酚得率的影響最大。由表3 可知，超聲功率的P值小于顯著水平，說明不同超聲功率在青稞酒糟多酚得率上存在顯著差異，料液比的P值小于極顯著水平（0.01），說明不同料液比提取的青稞酒糟多酚得率差異極顯著。

在最優(yōu)提取工藝A2B2C4D4下，即超聲功率400 W、超聲溫度45℃、超聲時間50 min、料液比1 ∶20（g/mL），多酚的得率為（3.337 1±0.149 8）mg/g，與朱俊玲等[16]相比多酚的提取率提高了1.8 倍左右，與夏陳等[21]的研究結(jié)果相比提高了2 倍。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是不同品種的青稞以及青稞栽種環(huán)境影響了青稞中的多酚含量，同時有研究發(fā)現(xiàn)青稞經(jīng)過發(fā)酵處理后，在微生物的代謝產(chǎn)物作用下，游離酚和結(jié)合酚的含量均增加[22]。還有研究表明，不同的釀酒工藝也會影響青稞酒糟中多酚的含量，導(dǎo)致多酚得率的改變[12]。

2.2 青稞酒糟多酚的體外抗氧化試驗

2.2.1 對DPPH·的清除效果

不同濃度青稞酒糟多酚對DPPH·的清除效果見圖6。

圖6 不同濃度青稞酒糟多酚對DPPH·的清除效果Fig.6 DPPH·scavenging effects of polyphenols at different concentrations

由圖6 可知，當(dāng)青稞酒糟濃度為21 μg/mL 時，對DPPH·的清除率最高，為（83.76±1.35）%，表明青稞酒糟多酚對DPPH·有良好的清除效果。與黃酒糟[23]和其他白酒酒糟[24]相比，青稞酒糟多酚對DPPH·的清除效果更好，但茶酒糟多酚對DPPH·的清除效果優(yōu)于青稞酒糟多酚[25]?？赡苁且驗槎喾宇愇镔|(zhì)的來源不同，導(dǎo)致提取液中酚類物質(zhì)種類及含量不同，影響對DPPH·的清除效果。即所使用的谷物類型可能對酚類成分和抗氧化特性產(chǎn)生至關(guān)重要的影響[26]。

2.2.2 對·OH 的清除效果

不同濃度青稞酒糟多酚對·OH 的清除效果見圖7。

圖7 不同濃度青稞酒糟多酚對·OH 的清除效果Fig.7 ·OH scavenging effects of polyphenols at different concentrations

由圖7 可知，青稞酒糟多酚表現(xiàn)出較強的抗氧化性，經(jīng)計算得出青稞酒糟多酚對·OH 的IC50為14.79 μg/mL，在相同質(zhì)量濃度下，青稞酒糟多酚對·OH 的清除率高于青稞多酚[27]，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因為發(fā)酵青稞比未發(fā)酵青稞的·OH 的清除效果更好，發(fā)酵過程中受微生物種類的影響，多酚化合物的種類和含量出現(xiàn)了明顯變化，導(dǎo)致抗氧化能力改變。同時已有試驗證明，經(jīng)過微波處理的BSG 會產(chǎn)生具有高抗氧化活性的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，即羥基肉桂酸的衍生物，對·OH 的清除具有積極效果[28]。

2.2.3 對·O2-的清除效果

多酚類化合物中對·O2-起主要清除作用的是A環(huán)和B 環(huán)上的羥基，其中鄰位羥基具有更好的清除能力[29]。不同濃度青稞酒糟多酚對·O2-的清除效果見圖8。

圖8 不同濃度青稞酒糟多酚對·O2-的清除效果Fig.8 ·O2-scavenging effects of polyphenols at different concentrations

由圖8 可知，多酚提取物的抗氧化能力與提取物中的總酚含量呈正相關(guān)。當(dāng)青稞酒糟多酚濃度為21 μg/mL 時，·O2-清除率為（76.88±1.47）%。對·O2-的清除效果優(yōu)于甘蔗葉多酚[30]，原因可能是不同結(jié)構(gòu)的多酚化合物對·O2-的清除能力不同，通過不同方法提取的多酚對·O2-的清除效果也存在差異。

3 結(jié)論

本試驗以青稞酒糟為原料，通過單因素試驗結(jié)合正交試驗優(yōu)化青稞酒糟多酚超聲波輔助提取工藝，最優(yōu)提取工藝為超聲功率400 W、超聲溫度45 ℃、超聲時間50 min 和料液比1 ∶20（g/mL），在該條件下青稞酒糟多酚的得率為（3.337 1±0.149 8）mg/g。進一步檢測不同濃度青稞酒糟多酚對DPPH·、·OH 和·O2-的清除效果，清除效果隨濃度增大而提高，當(dāng)青稞酒糟多酚濃度為21 μg/mL 時，對DPPH·的清除率為（83.76±1.35）%，對·OH 的清除率為（52.05±2.09）%，對·O2-的清除率為（76.88±1.47）%。

綜上所述，本試驗初步探索了青稞酒糟多酚的提取方法及其工藝優(yōu)化，但青稞酒糟多酚的作用機理和功效仍需進一步研究與探索，對其應(yīng)用潛力進行充分地挖掘，將為青稞酒糟多酚應(yīng)用提供新方向，對新產(chǎn)品的研發(fā)產(chǎn)生深遠影響，推動實現(xiàn)青稞酒糟的高值化利用。