武上雯李桓龔曉紅陸超群陳一鳴邢清樺李松偉*

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046；3. 河南省中醫(yī)院，鄭州 450000）

結(jié)締組織疾?。╟onnective tissue disease，CTD）是一類具有異質(zhì)性系統(tǒng)特征和免疫介導(dǎo)的多器官功能障礙疾病。 呼吸系統(tǒng)受累所引起的間質(zhì)性肺疾?。╥nterstitial lung disease，ILD）是CTD 死亡的重要因素［1］， 該病變可出現(xiàn)在皮肌炎／多肌炎（dermatomyositis／polymyositis，DM／PM）、干燥綜合征（sj?gren’s syndrome，SS）、系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis， SSc）、 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ rheumatoid arthritis，RA） 和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE） 等患者中，患病率分別約為40%、40%、30% ～40%、10%和12%［2－3］。 據(jù)報(bào)道，CTD-ILD 的總死亡率高達(dá)31.76%［4－5］，患者生存時(shí)間比無ILD 的患者縮短1.7 倍［6］。

結(jié)締組織相關(guān)肺間質(zhì)病變發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未得到明確闡明，且治療方案單一，仍以激素與免疫抑制劑為主。 動(dòng)物模型作為能夠鑒定潛在治療靶點(diǎn)的工具，可以為研究疾病的病因、病理改變及臨床治療提供重要的線索，構(gòu)建有價(jià)值且經(jīng)濟(jì)可行的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，在醫(yī)學(xué)發(fā)展中占有決定性的地位。 動(dòng)物模型對(duì)于進(jìn)一步研究CTD-ILD 疾病具有重要意義，但目前關(guān)于CTD-ILD 的動(dòng)物模型較為雜亂，建立與臨床實(shí)際相符且穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)前提。 因此本文通過對(duì)國(guó)內(nèi)外常見CTD-ILD動(dòng)物模型特點(diǎn)及評(píng)價(jià)進(jìn)行總結(jié)，以期為構(gòu)建新的動(dòng)物模型及基礎(chǔ)研究提供新思路。

1 RA-ILD 動(dòng)物模型構(gòu)建

1.1 RA-ILD 非基因動(dòng)物模型

1.1.1 弗氏佐劑

弗氏佐劑是在動(dòng)物模型中廣泛用于誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎發(fā)作的常用佐劑，可分為不完全弗氏佐劑（incomplete freund’s adjuvant，IFA）和完全弗氏佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA）。 不完全弗氏佐劑是液體石蠟與羊毛脂混合而成，不完全弗氏佐劑中加滅活卡介苗或死的結(jié)核分枝桿菌，即為完全弗氏佐劑［7］。

單純弗氏佐劑造模較常采用的方法是雄性Wistar 大鼠右后肢注射CFA，注射佐劑后14 d，大鼠開始出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹，于28 d 后結(jié)束［8－10］。 經(jīng)CFA 處理20 d，對(duì)側(cè)關(guān)節(jié)處出現(xiàn)紅斑和足腫脹。 第21 天肺部出現(xiàn)肺泡壁增厚和由淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 第28 天出現(xiàn)肺內(nèi)胸膜增厚和明顯的膠原纖維沉積，血清和肺組織中促炎細(xì)胞因子水平增加。

該動(dòng)物模型的組織病理學(xué)模式與RA-ILD 的臨床特征相似。 在該動(dòng)物模型中，CFA 的作用機(jī)制是通過巨噬細(xì)胞的吞噬和循環(huán)引起關(guān)節(jié)和肺部炎癥，該模型的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、建模時(shí)間短、實(shí)驗(yàn)成本低。 此外，炎癥和纖維化主要分布在胸膜及胸膜下區(qū)，這與臨床RA-ILD 特別是與UIP 相關(guān)的RA 的病理分布相似。 缺點(diǎn)是這種疾病的動(dòng)物模型有一定的自限性。

1.1.2 Ⅱ型膠原

膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎是目前最常用的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型造模方法，抗Ⅱ型膠原抗體與軟骨中Ⅱ型膠原的主要蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥和骨侵蝕［11］。 抗環(huán)瓜氨酸蛋白抗體（ACPAs）是一個(gè)用于早期診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗體，經(jīng)由肽酰精氨酸、亞胺酶等瓜氨酸蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，出現(xiàn)潛在的蛋白決定簇-瓜氨酸簇［12］。 研究發(fā)現(xiàn)ACPAs 與RA-ILD 關(guān)系密切，可在關(guān)節(jié)及肺部產(chǎn)生［13］。

牛Ⅱ型膠原（bovine collagen type Ⅱ，bCⅡ）與雞Ⅱ型膠原（chicken collagen type Ⅱ，cCⅡ）均可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，使用bCⅡ誘導(dǎo)DBA／1 小鼠RAILD 是最常見的造模方法［14－17］。 初次免疫選擇在小鼠尾根部注射CFA 乳化的bCⅡ，第21 天加強(qiáng)注射IFA 乳化bCⅡ增強(qiáng)免疫。 在第7 天，干預(yù)的小鼠bCⅡ開始在胸膜下區(qū)域聚集，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞，伴隨與ACPAs 相關(guān)的抗環(huán)瓜氨酸抗體增加。 第14 天炎癥性關(guān)節(jié)炎開始發(fā)生，表明在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的小鼠中，肺部炎癥先于關(guān)節(jié)炎發(fā)生。 初次免疫后第21 天小鼠肺表面發(fā)現(xiàn)斑塊，細(xì)支氣管和血管邊出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)出現(xiàn)肉芽組織樣結(jié)節(jié)。 第49天小鼠踝關(guān)節(jié)厚度增加，炎癥細(xì)胞呈片狀浸潤(rùn)在肺部胸膜下區(qū)域，ACPAs 和補(bǔ)體C3 也沉積在胸膜下區(qū)。 自此肺部病變表現(xiàn)逐漸減弱，至第182 天，肺部炎癥完全逆轉(zhuǎn)，膠原纖維沉積現(xiàn)象逐漸消失［18］。

雖然目前有關(guān)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)RA-ILD 模型研究不多，但根據(jù)小鼠肺部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)部位、ACPAs和補(bǔ)體表達(dá)增高等現(xiàn)象看，此模型與人類RA-ILD有相似性，該模型的優(yōu)點(diǎn)是可用于RA-ILD 早期發(fā)病機(jī)制的研究。 此外由于炎癥區(qū)域主要分布在胸膜下區(qū)，也可以反映RA-ILD 的炎癥期，這與臨床RA 相關(guān)UIP 的病理分布相似。 然而，肺部炎癥的自限性使其無法呈現(xiàn)進(jìn)展型肺纖維化，使該模型不能表現(xiàn)出RA-ILD 慢性和不可逆進(jìn)展的特征。

1.1.3 博來霉素

博來霉素（bleomycin，BLM）是從輪絲鏈霉中分離，具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，屬于糖肽類抗腫瘤抗生素，BLM 進(jìn)入人體后很快集聚于皮下、肺部、睪丸等處，對(duì)淋巴瘤、鱗狀細(xì)胞癌、肺癌和睪丸癌等具有很好的療效［19］。 該藥物最嚴(yán)重的毒副反應(yīng)可引起肺纖維化，因此在進(jìn)行間質(zhì)性肺疾病基礎(chǔ)研究時(shí)，常采用BLM 誘導(dǎo)的動(dòng)物模型。

雞Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑聯(lián)合博萊霉素是使用BLM 誘導(dǎo)RA-ILD 最常用的造模方法［20－21］。首先將溶于冰醋酸溶液的cCⅡ與CFA 等體積混合，在小鼠尾根部注射混合乳劑，21 d 后避開初次注射部位，再次注射混合乳劑加強(qiáng)免疫。 首次免疫25 d后，將小鼠麻醉分層剝離暴露氣管，將配置好的BLM 溶液緩慢注入，引發(fā)肺纖維化。 第7 天，小鼠肺組織病理可見部分肺間隔增寬，較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；第14 天，肺組織中正常形態(tài)基本消失，肺泡數(shù)量減少，肺間質(zhì)可見大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)明顯膠原沉積；第28 天，由于BLM 的注入，肺組織炎癥呈現(xiàn)進(jìn)行性加重，膠原纖維沉積增加。

在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用BLM 誘導(dǎo)間質(zhì)性肺病屬于聯(lián)合動(dòng)物模型。 該模型呈現(xiàn)進(jìn)行性加重的全身慢性炎癥反應(yīng)發(fā)病過程，能夠較好地模擬慢性進(jìn)行性肺纖維化進(jìn)程中微環(huán)境損傷修復(fù)的過程，且形成的間質(zhì)性肺疾病相對(duì)穩(wěn)定，具有通用性和可重復(fù)性。 但由于自身聯(lián)合模型的特點(diǎn)，并不能完全符合臨床RA-ILD 疾病過程，在還原疾病病理變化上仍有所不足。

1.1.4 有機(jī)粉塵

有機(jī)粉塵（organic dust，OD）是指有機(jī)物質(zhì)為主的粉塵，主要來自動(dòng)植物的微小型顆粒或人工合成的有機(jī)材料產(chǎn)生的粉塵等。 煙霧或氣溶膠存在于空氣中的顆粒，易沉積于下呼吸道，可引起巨噬細(xì)胞功能障礙，氣道和肺實(shí)質(zhì)產(chǎn)生炎癥，這是長(zhǎng)期處于職業(yè)暴露的人群易患ILD 的原因［22－23］，因此環(huán)境因素在RA-ILD 的發(fā)展中起著重要作用。

雞Ⅱ膠原和弗氏佐劑聯(lián)合有機(jī)粉塵提取物也可建立RA-ILD 模型［24］。 DBA／1 小鼠皮下注射由CFA 乳化的cCⅡ，3 周后加強(qiáng)免疫注射IFA 乳化的cCⅡ，連續(xù)接受12.5%有機(jī)粉塵提取物鼻內(nèi)吸入誘導(dǎo)氣道炎癥。 首次免疫后第3 周，小鼠開始出現(xiàn)炎癥性關(guān)節(jié)炎，相較于單純膠原誘導(dǎo)模型，加用OD 后小鼠脛骨近端和跟骨的骨密度下降，小鼠的骨體積、骨小梁厚度減少，第5 周出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀惡化。5 周后小鼠肺組織細(xì)支氣管及肺泡周圍出現(xiàn)淋巴樣聚集物增加，膠原纖維沉積和透明質(zhì)酸也增加。 值得注意的是，此種造模方式的雌性小鼠可能表現(xiàn)出炎癥細(xì)胞和關(guān)節(jié)炎的抑制現(xiàn)象。

此造模方式的優(yōu)點(diǎn)是生動(dòng)地模擬了環(huán)境因素對(duì)RA-ILD 的影響，以及關(guān)節(jié)炎和肺部炎癥疾病之間的相互作用，重復(fù)吸入有機(jī)粉塵提取物會(huì)加重關(guān)節(jié)炎癥、骨破壞和軟骨侵蝕。 該模型可以模擬人類在生存環(huán)境中出現(xiàn)RA-ILD 的病理過程，并提示可通過呼吸保護(hù)和環(huán)境改善來治療疾病。 且因該模型雌性小鼠的疾病狀態(tài)似乎不穩(wěn)定，因此可用于研究RA-ILD 發(fā)病和死亡的生物學(xué)性別差異。 但是此模型的建立操作較為復(fù)雜，需要每天通過特定的吸入方式進(jìn)行有機(jī)粉塵提取物的干預(yù)，以便更好的模擬人類的發(fā)病環(huán)境，可重復(fù)性不強(qiáng)。

1.2 RA-ILD 基因動(dòng)物模型

1.2.1 SKG 基因小鼠模型

Sakaguchi 等［25］發(fā)現(xiàn)在ZAP-70 基因位點(diǎn)發(fā)生突變的BALB／c 小鼠可培育出SKG 基因小鼠。 由于異形ZAP-70 等位基因的第二個(gè)SH2 結(jié)構(gòu)域中有一個(gè)與TCR 和CD3 鏈的酪氨酸基激活基序相關(guān)的自發(fā)位點(diǎn)突變，這些小鼠表現(xiàn)出胸腺細(xì)胞中T 細(xì)胞受體減少，改變陽性與陰性選擇閾值，并使自身反應(yīng)性T 細(xì)胞能夠逃入外周。 因此SKG 小鼠被視為隱性突變基因的自發(fā)性關(guān)節(jié)炎模型，可能與RA-ILD疾病有密切關(guān)聯(lián)。

在SKG 小鼠體內(nèi)注射酵母聚糖（zymosan，ZyA）是建立RA-ILD 動(dòng)物模型的方案之一［26］。 選取SKG小鼠腹腔注射ZyA 以誘發(fā)模型，2 周后，由于T 細(xì)胞的高反應(yīng)性和滑膜細(xì)胞對(duì)炎癥刺激敏感性的獨(dú)特組合導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)了對(duì)稱性關(guān)節(jié)腫脹，足趾及趾間多關(guān)節(jié)炎性關(guān)節(jié)炎，有自小關(guān)節(jié)至大關(guān)節(jié)蔓延之勢(shì)，同時(shí)出現(xiàn)明顯滑膜炎。 關(guān)節(jié)腫脹炎癥在注射后6 ～8 周達(dá)到峰值，然后逐漸下降，并于16 周繼續(xù)上升，并于注射后8 個(gè)月開始出現(xiàn)軟骨破壞融合、關(guān)節(jié)脫位及骨質(zhì)疏松。 在此過程中，SKG 小鼠中類風(fēng)濕因子等自身抗體及促炎因子表達(dá)升高，破壞周圍軟骨和骨的增量。 第12 周時(shí)，高達(dá)89%的小鼠肺部出現(xiàn)片狀胸膜下和支氣管血管周圍混合炎癥，可觀察到肺泡隔內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維膠原的斑片狀沉積，沉積中可見CD4＋T 細(xì)胞、CD8＋T 細(xì)胞、B220＋B 細(xì)胞及CD11b＋巨噬細(xì)胞聚集；肺內(nèi)氣道上皮和氣管區(qū)域顯示出磷酸化Smad2、3 陽性細(xì)胞數(shù)量增加，與肺實(shí)質(zhì)中活躍的TGF-β 信號(hào)有關(guān)。

SKG 小鼠腹腔注射酵母多糖后，肺部與人類RA-NSIP 病理表現(xiàn)非常相似，常用于環(huán)境暴露、免疫和炎癥之間的機(jī)制研究。 但注射酵母多糖18 周后，SKG 小鼠肺中膠原沉積增加，并未出現(xiàn)纖維化UIP表型，這與RA-ILD 的病理過程有差異。 此外，SKG基因小鼠在相同生存環(huán)境下不僅可自發(fā)出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，也可能表現(xiàn)出其他疾病現(xiàn)象。

1.2.2 TNF-Tg 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

TNF-Tg 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備選用C57BL／6小鼠與CBA 小鼠雜交，再與DBA／1 小鼠回交，利用基因載體將腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）基因ARE 的3’-UTR 端由β 球蛋白的3’-UTR端代替，建立慢性持續(xù)性過表達(dá)人TNF-α 基因的TNF-Tg 動(dòng)物模型。

模型在8 周齡左右開始出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)腫脹，12 周齡時(shí)出現(xiàn)炎性糜爛性關(guān)節(jié)炎。 此外TNF-Tg 小鼠亦可出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)引流淋巴結(jié)功能障礙，其特征是腘窩淋巴結(jié)體積進(jìn)行性增加，其中由于滑膜空間的淋巴運(yùn)輸增加，活性單核細(xì)胞、常規(guī)樹突細(xì)胞和CD23＋／CD21hiB 細(xì)胞積聚，爪甲握力下降。 爪甲握力和淋巴結(jié)的總體積反映了炎癥性關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)展和活動(dòng)性。 TNF-Tg 小鼠12 ～13周齡肺部可出現(xiàn)肺間質(zhì)性炎癥浸潤(rùn)、血管壁增厚、血管周圍炎癥和缺乏生發(fā)中心的濾泡樣結(jié)構(gòu)的形成，但無明顯纖維化表現(xiàn)，肺組織中CD11b＋／CD11c＋細(xì)胞凋亡顯著增加，活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［27］。

本模型的優(yōu)點(diǎn)是體現(xiàn)了肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞集聚向NSIP 發(fā)展的過程，可用于研究RA-ILD 的炎癥期。 鑒于TNF-Tg 小鼠與腫瘤壞死因子間的相互關(guān)系，其亦可用于對(duì)各種生物制劑療法的評(píng)估。 但由于TNF-Tg 小鼠在表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎早期癥狀后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的間質(zhì)性肺疾病過程，模型整體建立時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)成本高，死亡率高壽命較短。 且該模型不使用任何造模方法，模型性質(zhì)相對(duì)單一，與RA-ILD 由多因素相互作用的病理過程差別較大。

1.2.3 D1CC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

將人類CIITA 基因與大鼠CII 啟動(dòng)子和增強(qiáng)子連接，可導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合體MHCII 的異常表達(dá)，這種方法可將DBA／1 小鼠進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，形成D1CC 轉(zhuǎn)基因小鼠［28］。 少量bCⅡ佐劑干預(yù)的D1CC 轉(zhuǎn)基因小鼠可誘導(dǎo)RA-ILD 的發(fā)生。

將CFA 等體積乳化的bCⅡ皮內(nèi)注射于D1CC小鼠尾根部、腹股溝淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)處，然后于第21、42、63 天在同一位置使用IFA 乳化的bCⅡ增強(qiáng)注射。 初次免疫后11 周，關(guān)節(jié)軟骨和滑膜細(xì)胞增殖形成泛膜，出現(xiàn)早期骨侵蝕；第21 周觀察到小鼠骨內(nèi)礦物質(zhì)密度下降，在髕骨、股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和腓骨觀察到骨破壞、關(guān)節(jié)間隙狹窄和糜爛；第6 個(gè)月小鼠表現(xiàn)出所有關(guān)節(jié)完全破壞和指骨縮短，同時(shí)抗CCP 抗體水平較高，肺損傷浸潤(rùn)炎性細(xì)胞為粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，伴肺部細(xì)胞增生和纖維化改變，混合細(xì)胞炎癥分布在支氣管周圍和血管周圍區(qū)域，伴有纖維化與新合成的彈性纖維沉積。 第10 個(gè)月，小鼠血清SP-D 水平顯著升高，這可能是RA-ILD 肺損傷的標(biāo)志。 同時(shí)D1CC小鼠肺內(nèi)巨噬細(xì)胞TNF-α 表達(dá)、反應(yīng)性肺細(xì)胞中的BAX 表達(dá)、成纖維細(xì)胞中的TNF 表達(dá)、漿細(xì)胞樣細(xì)胞中的IL-6 表達(dá)均升高，8-羥基脫氧鳥苷陽性上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。

D1CC 小鼠模型可以很好地模擬人類RA-ILD復(fù)雜緩慢的疾病進(jìn)展過程，在評(píng)估疾病發(fā)病的生理病理過程中發(fā)揮重要作用。 但該模型需要較長(zhǎng)的時(shí)間才可成型，時(shí)間及費(fèi)用成本較高，且不能完全復(fù)制RA-ILD 中UIP 的相關(guān)肺部病理表現(xiàn)。

1.2.4 HLA-DQ8 轉(zhuǎn)基因小鼠

一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究確定人類白細(xì)胞抗原HLA 基因中的HLA-DR4／DQ8 是導(dǎo)致RA 的最強(qiáng)遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素［29］，并由此培育出表達(dá)HLA-DQ8 且缺乏MHCⅡ類分子的轉(zhuǎn)基因小鼠用于RA-ILD 動(dòng)物模型的建立。

先將HLA-DQ8 小鼠暴露于香煙煙霧（cigarette smoke，CS），皮下注射與CFA 按1 ∶1乳化的cCⅡ進(jìn)行免疫，在首次免疫后第32、40、46 天分別氣管內(nèi)注射BLM，CS 的干預(yù)一直持續(xù)到第一次博來霉素給藥。 這一造模方式小鼠的存活率僅50%，HLA-DQ8小鼠有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肺損傷，肺中心區(qū)域瘢痕的形成可能導(dǎo)致組織收縮，對(duì)肺周圍施加向內(nèi)的力，這可能導(dǎo)致周圍肺泡增大或破壞，出現(xiàn)與限制性肺生理和纖維化一致的肺順應(yīng)性顯著降低。 另外HLA-DQ8 小鼠體內(nèi)促炎細(xì)胞因子TNF-α、膠原蛋白-1、纖維連接蛋白和TGF-β1 的表達(dá)水平增加［30］。

這一模型使具有人類RA 相關(guān)HLA 基因的小鼠發(fā)展出人類RA 的關(guān)節(jié)炎以及肺氣腫和肺纖維化的組合表型，與人類RA 肺部疾病高度相似，能夠反應(yīng)急性肺損傷后的RA-ILD 模型。 但本模型引發(fā)RA關(guān)節(jié)炎癥狀的病因單一，缺乏系統(tǒng)性炎癥和自身免疫的生理病理過程，限制了博來霉素誘導(dǎo)小鼠模型作為研究RA 相關(guān)肺部疾病發(fā)病機(jī)制的工具的實(shí)用性。RA-ILD 動(dòng)物模型造模方法、特點(diǎn)及缺點(diǎn)見表1。

2 SSc-ILD 動(dòng)物模型構(gòu)建

2.1 BLM 誘導(dǎo)模型

博來霉素是誘導(dǎo)ILD 的最常用藥物，如肺組織結(jié)構(gòu)、成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞活化和膠原沉積的變化。 因此BLM 被用于誘導(dǎo)SSc 相關(guān)ILD 表現(xiàn)，BLM 誘導(dǎo)的ILD 以時(shí)間依賴的方式發(fā)展，炎癥在第3 天出現(xiàn)，在第7 天達(dá)到高峰，而肺纖維化在第7 天開始發(fā)展，在BLM 給藥后的第21 天達(dá)到高峰［38］。但關(guān)于博來霉素誘導(dǎo)的方法有多種，有研究采用一次性氣管內(nèi)注入博來霉素溶液構(gòu)建SSc-ILD 動(dòng)物模型，模型約7 d 后進(jìn)入急性炎癥期，28 d 后達(dá)到纖維化期［39－40］；另有研究通過皮下注射博來霉素誘導(dǎo)SSc 自發(fā)ILD，將BLM 皮內(nèi)注射到模型小鼠的背中央?yún)^(qū)域部，連續(xù)28 d，小鼠出現(xiàn)皮膚樣改變，肺部發(fā)生明顯炎癥浸潤(rùn)與纖維化，這些改變可能與TGF-β1升高關(guān)系密切，且伴隨α-SMA、膠原蛋白-Ⅰ、CD8＋T細(xì)胞、CD68＋巨噬細(xì)胞增多［41］。 有研究表明通過滲透微型泵釋放BLM 誘導(dǎo)亞急性-慢性間質(zhì)性肺疾病模型被用于評(píng)估纖維化化合物在皮膚或肺中的作用［42］。 其通過小鼠皮下植入滲透微型泵全身遞送BLM，被用于實(shí)驗(yàn)?zāi)MSSc-ILD 的臨床典型特征。在泵模型中，小鼠體重減輕更少、存活率更高，肺部表現(xiàn)為胸膜下受累，僅有有限的炎癥，同時(shí)誘導(dǎo)了肥大的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞群和皮膚，以及肺纖維化，表現(xiàn)更接近人類SSc 疾病。

本模型造模方法較為簡(jiǎn)單、成本較低，基本能模擬出SSc-ILD 的基本臨床表現(xiàn)。 但單純使用博來霉素造模與肺纖維化經(jīng)典模型一致，模型鼠的自身免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)表現(xiàn)特異性不強(qiáng)。

2.2 Fra-2 轉(zhuǎn)基因模型

Fra-2 是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白酶1 家族中一員，與炎癥反應(yīng)和膠原生成關(guān)聯(lián)密切。 在普遍存在的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類抗原H2Kb 啟動(dòng)子控制下表達(dá)Fra-2 基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可以表現(xiàn)出皮膚纖維化、微血管病和肺部疾?。?3］。 毛細(xì)血管密度在第12 ～13 周出現(xiàn)顯著下降，同時(shí)出現(xiàn)肺動(dòng)脈閉塞，伴有血管周圍炎性浸潤(rùn)。 Fra-2 轉(zhuǎn)基因小鼠還會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的肺動(dòng)脈血管重塑，類似于人類SSc 相關(guān)肺動(dòng)脈高壓特征，如內(nèi)膜增厚伴同心層狀損傷、中層肥大、血管周圍炎性浸潤(rùn)和外膜纖維化［44］。 Boleto等［45］使用13 周齡的Fra-2 轉(zhuǎn)基因小鼠直接作為SSc-ILD，通過microCT 評(píng)估發(fā)現(xiàn)小鼠肺密度升高，肺組織出現(xiàn)纖維化肺泡炎特征，羥脯氨酸含量增加。 Birnhuber 等［46］將博萊霉素以0.8 U／kg 的劑量氣管內(nèi)給藥，誘導(dǎo)Fra-2 小鼠出現(xiàn)ILD 表現(xiàn)，小鼠肺功能出現(xiàn)靜態(tài)順應(yīng)性增加，肺血管周圍區(qū)域膠原沉積增加。

使用Fra-2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以模擬SSc-ILD 特征，但該模型的自身免疫病相關(guān)表現(xiàn)不明顯，肺動(dòng)脈高壓高發(fā)且癥狀嚴(yán)重，易減低小鼠壽命，增加造模成本。 SSC-ILD 動(dòng)物模型造模方法特點(diǎn)及缺點(diǎn)見表2。

表2 SSc-ILD 動(dòng)物模型Table 2 Animal models of SSc-ILD

3 SLE-ILD 動(dòng)物模型構(gòu)建

MRL／lpr 小鼠是第19 條染色體上的Faslpr基因突變產(chǎn)生的基因鼠，其可出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、T 細(xì)胞異常增生、自身抗體、關(guān)節(jié)炎和腎小球腎炎等癥狀。談欣怡等［47］與Gao 等［48］均發(fā)現(xiàn)在MRL／lpr 小鼠生長(zhǎng)至12 周齡開始出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間隔增大，淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)，膠原纖維團(tuán)狀沉積等病理表現(xiàn)；16 ～32 周齡時(shí)肺組織細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，氣管損傷、血管周圍損傷和間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度高。 但由于MRL／lpr 小鼠模型既可作為SLE 與SS 疾病模型，隨著周齡增大亦可自發(fā)狼瘡性腎炎等，涉及疾病較多、發(fā)病過程復(fù)雜、病理過程不明確，且有關(guān)ILD 表現(xiàn)不夠明顯，模型特異性不強(qiáng)。 SLE-ILD 動(dòng)物模型造模方法、特點(diǎn)及缺點(diǎn)見表3。

表3 SLE-ILD 與PM-ILD 動(dòng)物模型Table 3 Animal models of SLE-ILD and PM-ILD

4 PM-ILD 動(dòng)物模型構(gòu)建

有關(guān)多肌炎相關(guān)間質(zhì)性肺病的動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)，選擇4 周齡短毛豚鼠注射柯薩奇病毒B1（coxsackie virus B1，CVB1）建立PM 動(dòng)物模型［49］，該模型豚鼠的肺組織出現(xiàn)炎癥和纖維化。 但此造模方法僅有1 篇相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，且其病理表現(xiàn)與PMILD 患者相比差別較大，因此還需進(jìn)一步研究加以證實(shí)與改善。 PM-ILD 動(dòng)物模型造模方法、特點(diǎn)見表3。

5 CTD-ILD 模型應(yīng)用

目前，RA-ILD 非基因動(dòng)物模型主要應(yīng)用于中藥方劑或有效成分的基礎(chǔ)研究，中藥方劑包含四妙丸［20］、防纖方［10］、芍甘附子湯［31］與通痹顆粒［32］；中藥有效成分的研究?jī)H涉及白藜蘆醇［9，21］，這些研究表明中醫(yī)藥可治療RA-ILD，且中藥有效成分單體的口服給藥途徑是安全的。 RA-ILD 基因動(dòng)物模型主要應(yīng)用在成藥篩選和生物標(biāo)志物開發(fā)的研究，Sendo等［34］研究發(fā)現(xiàn)托法替布通過促進(jìn)單核抑制細(xì)胞在SKG 小鼠肺內(nèi)的擴(kuò)張來抑制ILD 的進(jìn)展；Miura等［37］研究尼達(dá)尼布對(duì)酪氨酸激酶的廣泛抑制作用可能有助于RA-ILD 的整體改善；一項(xiàng)關(guān)于尼達(dá)尼布治療RA-ILD 的臨床前評(píng)估研究表明在SKG 小鼠模型中，尼達(dá)尼布具有防止肺功能下降和減輕關(guān)節(jié)腫脹的作用［50］。 有研究證實(shí)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF［35］與抗氧化劑H2［36］對(duì)RA-ILD模型鼠具有治療作用，其中抗GM-CSF 受體的Mavrilimumab 在RA 患者中的Ⅱ期研究具有顯著療效，同時(shí)中和GM-CSF 能改善SKG 小鼠的ILD，有助于制定疾病的預(yù)防或治療策略。 SSc-ILD 動(dòng)物模型同樣應(yīng)用于藥物篩選的研究，BLM 誘導(dǎo)模型能夠更好地描述潛在臨床候選藥物如尼達(dá)尼布［42］、托法替布和巴瑞替尼［39］的可靠性；Fra-2 轉(zhuǎn)基因模型被用于探究阿巴西普［45］與吡非尼酮［46］的治療作用。SLE-ILD 動(dòng)物模型的應(yīng)用一方面表明FOXJ1 蛋白水平可能間接反映SLE 患者ILD 的嚴(yán)重程度［48］，F(xiàn)OXJ1 蛋白對(duì)SLE-ILD 患者的早期發(fā)現(xiàn)和治療具有重要意義；此外該模型也被應(yīng)用于中藥自擬方自身清的療效評(píng)價(jià)［47］。 PM-ILD 動(dòng)物模型目前僅應(yīng)用于證明組織蛋白酶B 可能是疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

6 討論

多年來研究人員已應(yīng)用多種方法制備CTD-ILD相關(guān)動(dòng)物模型，模型各有特點(diǎn)，目前有關(guān)RA-ILD 模型的研究相對(duì)較多，SSc-ILD、SLE-ILD 與PM-ILD 的相對(duì)較少，其余CTD-ILD 動(dòng)物模型研究尚處于空缺狀態(tài)。 這些模型被用于CTD-ILD 發(fā)病機(jī)制、病因病機(jī)和治療藥物的開發(fā)與驗(yàn)證中，并在臨床前研究中取得了一定的成績(jī)。 但這些成果在臨床的轉(zhuǎn)換率卻較低，可能是因?yàn)榧膊?fù)雜的發(fā)生發(fā)展過程以及人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間的種屬差異，即使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)出相似的病理與癥狀表現(xiàn)，復(fù)雜的內(nèi)在機(jī)制卻有所差別。 采用免疫物質(zhì)刺激制備的非基因動(dòng)物模型操作相對(duì)簡(jiǎn)單，建模實(shí)驗(yàn)成本低，在模擬疾病形成的慢性過程中具有一定優(yōu)勢(shì)。 基因突變模型常用于免疫與炎癥之間關(guān)系的機(jī)制研究，由于突變位點(diǎn)可引起一系列復(fù)雜反應(yīng)，較常出現(xiàn)疾病無關(guān)癥狀。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型具有復(fù)雜的生化和病理等特征，建模周期長(zhǎng)，費(fèi)用成本較高，通常與疾病多因素相互作用的病理過程不盡相同。 目前任何的單一模型均不能夠闡釋疾病的全部臨床特征，在實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用中有一定的局限性。 因此需要根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)的需要，謹(jǐn)慎、合理的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)選擇合適的動(dòng)物模型，考慮根據(jù)各種造模方法的特點(diǎn)將多種方式結(jié)合進(jìn)行動(dòng)物模型的構(gòu)建，或者同時(shí)在多個(gè)動(dòng)物模型中進(jìn)行相關(guān)研究，以確保臨床前研究成果最大可能地轉(zhuǎn)化為人類臨床試驗(yàn)。 同時(shí)應(yīng)該改進(jìn)和探索更符合人類CTD-ILD 發(fā)病機(jī)制和臨床特點(diǎn)的動(dòng)物模型，以期更好地為臨床實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。