萬 倩, 劉萬學(xué), 呂志創(chuàng), 郭建洋, 黃 聰, 嚴(yán) 盈, 楊念婉,3*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害綜合治理全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2. 德國吉森大學(xué)昆蟲生物技術(shù)研究所，植物保護(hù)昆蟲生物技術(shù)系，吉森 35394；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院西部農(nóng)業(yè)研究中心，昌吉 831100)

自然界中,生物的性別決定機(jī)制復(fù)雜多樣,大體可分為遺傳性別決定(genotypic sex determination, GSD)和環(huán)境性別決定(environmental sex determination, ESD)兩大類[1]。昆蟲作為動(dòng)物界中最大的一個(gè)類群,其性別決定機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)。對(duì)不同昆蟲性別決定通路和關(guān)鍵基因功能的探究,既能揭示昆蟲物種分化的關(guān)系,也能為基于基因編輯技術(shù)的昆蟲不育技術(shù)(sterile insect technique, SIT)提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)[2]。昆蟲的性別決定機(jī)制復(fù)雜多樣,性別決定關(guān)鍵基因?qū)€(gè)體雌雄性別分化的調(diào)控表現(xiàn)為級(jí)聯(lián)反應(yīng)。主要的表達(dá)模式為早期胚胎中性別決定初始信號(hào)調(diào)控關(guān)鍵靶基因進(jìn)行雌雄差異性表達(dá),關(guān)鍵靶基因表達(dá)產(chǎn)物在其他因子的幫助下作用于級(jí)聯(lián)反應(yīng)底層的雙性基因doublesex(dsx),使dsx產(chǎn)生雌雄特異性剪接產(chǎn)物,從而調(diào)控下游雌雄性別偏向基因的表達(dá),最終實(shí)現(xiàn)昆蟲的性別分化;而缺乏性別決定初始信號(hào)的則為默認(rèn)的表達(dá)模式,最后個(gè)體呈現(xiàn)出與之相反的性別分化[3]。

鱗翅目Lepidoptera是昆蟲綱Insecta中僅次于鞘翅目Coleoptera的第二大目,包括蛾類和蝶類。鱗翅目昆蟲大多為植食性,許多成蟲能傳粉,在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用;一些物種還在人類社會(huì)生產(chǎn)中發(fā)揮著經(jīng)濟(jì)價(jià)值,如家蠶Bombyxmori和柞蠶Antheraeapernyi的應(yīng)用推動(dòng)了絲綢業(yè)的發(fā)展。也有不少鱗翅目昆蟲為農(nóng)業(yè)重大害蟲,如草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda、蘋果蠹蛾Cydiapomonella、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、草地螟Loxostegesticticalis等。鱗翅目昆蟲繁殖方式以兩性生殖為主,不同于哺乳動(dòng)物以及其他昆蟲的XY/XX性染色體系統(tǒng),鱗翅目大多為ZW/ZZ系統(tǒng),雌性為染色體異配型即ZW型,雄性為ZZ型[4]。因此,鱗翅目昆蟲所特有的W染色體使其性別決定機(jī)制不同于其他昆蟲。在ZW/ZZ系統(tǒng)中,位于W染色體的性別決定初始信號(hào)沉默Z染色體上的雄性化關(guān)鍵基因Masc,然后位于常染色體上的dsx基因被雌性特異性剪接,實(shí)現(xiàn)雌蟲分化;而雄蟲中無W染色體,Masc基因正常表達(dá)并調(diào)控dsx基因的雄性特異性剪接,促進(jìn)雄性偏向基因的表達(dá),完成雄性發(fā)育。本文對(duì)鱗翅目昆蟲性別決定機(jī)制的研究以及性別決定機(jī)制在鱗翅目昆蟲種群遺傳調(diào)控中的應(yīng)用進(jìn)行綜述,以期為鱗翅目重要經(jīng)濟(jì)昆蟲的性別篩選和防治有性繁殖的重大害蟲的種群遺傳防控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 鱗翅目昆蟲性染色體研究進(jìn)展

鱗翅目昆蟲性染色體系統(tǒng)多為ZW/ZZ型,雌性為ZW型,雄性為ZZ型(表1)[5-23]。少部分缺失W染色體,雌性表現(xiàn)為Z0型,雄性ZZ型,歸為Z0/ZZ系統(tǒng),如蓑蛾科Psychidae的Proutiabetulina、Taleporiatubulosa和Diplodomalaichartingella的雌蟲均缺失W染色體[16]。還有部分鱗翅目昆蟲表現(xiàn)出截然不同的性染色體系統(tǒng),如小蔗桿草螟Diatraeasaccharalis雌蟲減數(shù)分裂產(chǎn)生了三價(jià)體WZ1Z2,雄蟲則表現(xiàn)為Z1Z1Z2Z2[18]。在小粉蝶屬Leptidea中還發(fā)現(xiàn)了W1-3Z1-3/Z1-3Z1-3、W1-3Z1-4/Z1-4Z1-4和W1-3Z1-6/Z1-6Z1-6等性染色體系統(tǒng)的存在[5-6]。

表1 鱗翅目昆蟲性染色體研究進(jìn)展Table 1 Research progress on sex chromosomes in lepidopteran insects

一般認(rèn)為鱗翅目ZW/ZZ系統(tǒng)是從古老的Z0/ZZ系統(tǒng)中演化而來。對(duì)鱗翅目和毛翅目進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),雌性異配型性別染色體系統(tǒng)至少存在1.8億年,而W染色體約0.9億～1億年前才出現(xiàn),存在于更為高級(jí)的物種中,且正在快速進(jìn)化,Z染色體則較為保守[4,24-26]。最初對(duì)W染色體上基因的研究發(fā)現(xiàn),W染色體存在很多雌性特異的重復(fù)序列,未發(fā)現(xiàn)能編碼蛋白質(zhì)的基因。如利用W染色體來源的細(xì)菌人工染色體(W chromosome-derived bacterial artificial chromosome,W-BAC)作為探針進(jìn)行基因組原位雜交(genomic in situ hybridization,GISH),或利用高通量測(cè)序技術(shù)等對(duì)家蠶、地中海粉螟Ephestiakuehniella、蘋果蠹蛾W染色體進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)W染色體上存在大量的功能性轉(zhuǎn)座元件(transposable elements, TEs)和其他重復(fù)序列[14,27-28]。近年來,隨著對(duì)鱗翅目染色體研究的深入,陸續(xù)在一些鱗翅目昆蟲W染色體上發(fā)現(xiàn)了能編碼蛋白的基因,如Deng等[29]在棉鈴蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)鱗翅目昆蟲W染色體上特異性編碼蛋白的基因GUW1。在水稻常發(fā)害蟲稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis的W染色體上則發(fā)現(xiàn)了755個(gè)編碼蛋白的基因,但只有5%是能鑒定的蛋白[19]。

不同于W染色體,鱗翅目昆蟲Z染色體上富含能編碼蛋白質(zhì)的基因,如家蠶的Z染色體上有編碼肌動(dòng)蛋白的基因[30]。同時(shí),Z染色體上還有與雄性分化有關(guān)的基因,如條紋小粉蝶LeptideasinapisZ染色體上富集了大量雄性偏向表達(dá)的基因[31]。在煙草天蛾Manducasexta和君主斑蝶Danausplexippus的Z染色體中也發(fā)現(xiàn)了大量的精子蛋白基因[32]。在具有XY/XX性別決定系統(tǒng)的生物中,兩性的X染色體數(shù)量不同,但X染色體連鎖基因在2種性別中卻有著相等或近乎相等的表達(dá)量,這種能平衡性染色體連鎖基因的遺傳效應(yīng)叫做劑量補(bǔ)償效應(yīng)(dosage compensation)[33-34]。對(duì)鱗翅目昆蟲性染色體劑量補(bǔ)償?shù)难芯堪l(fā)現(xiàn),Z染色體的劑量補(bǔ)償機(jī)制在鱗翅目中普遍存在[35]。利用RNA-seq技術(shù)對(duì)蘋果蠹蛾Z染色體的劑量補(bǔ)償模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),Z染色體連鎖基因在兩性中的表達(dá)水平相當(dāng),且低于二倍體常染色體基因的表達(dá)水平,即Z≈ZZ

2 鱗翅目昆蟲性別決定機(jī)制研究進(jìn)展

昆蟲性別決定表現(xiàn)為級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在鱗翅目昆蟲ZW/ZZ性別決定系統(tǒng)中,位于W染色體的性別決定初始信號(hào)沉默Z染色體上的雄性化關(guān)鍵基因Masc,促使dsx基因形成雌性特異性剪接體,進(jìn)而調(diào)控一系列雌性偏向基因的表達(dá),實(shí)現(xiàn)雌蟲分化;而雄蟲為ZZ型,缺失W染色體上的性別決定初始信號(hào),因此Masc基因正常表達(dá)并產(chǎn)生Masc蛋白,調(diào)控dsx基因形成雄性特異性剪接體,進(jìn)而促進(jìn)雄性分化[41-47](圖1)。

2.1 鱗翅目性別決定初始信號(hào)研究進(jìn)展

在鱗翅目ZW/ZZ系統(tǒng)中,W染色體常與雌性的性別分化有關(guān)。利用GISH、比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)這3種方法對(duì)蘋果蠹蛾3種輻射突變異常的W染色體進(jìn)行詳細(xì)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析,并與野生型雌蟲進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其W染色體上存在雌性決定因子的獨(dú)特序列[48]。目前,鱗翅目昆蟲中已鑒定出的性別決定初始信號(hào)僅有家蠶中和小菜蛾P(guān)lutellaxylostella中的Fem。在雌蟲早期胚胎中,位于W染色體的Fem轉(zhuǎn)錄生成小沉默RNA(small silencing RNA, ssRNA),沉默雄性化基因Masc,實(shí)現(xiàn)雌性的性別分化。ssRNA是一類長度約20～30 nt的小RNA,能與Argonaute蛋白結(jié)合后使靶基因的表達(dá)降低,主要分為microRNA (miRNA)、small interfering RNA (siRNA) 和 Piwi-interacting RNA (piRNA)三類[49]。Fem是piRNA的前體,最終產(chǎn)生一個(gè)長29 nt且3′端被2′-O-甲基化修飾的piRNA。然后該FempiRNA與靶標(biāo)基因Masc第9外顯子上的特異性序列相互作用,沉默Masc,實(shí)現(xiàn)家蠶雌性的發(fā)育[43]。在小菜蛾中,Pxyfem能產(chǎn)生多個(gè)ssRNA,并在雌蟲胚胎期對(duì)PxyMasc轉(zhuǎn)錄本外顯子5進(jìn)行剪切,以沉默PxyMasc基因的表達(dá)[50]。在與家蠶親緣關(guān)系較近的三角斑白蠶蛾Trilochavarians中也發(fā)現(xiàn)了Fem的直系同源基因,但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FempiRNA并不參與三角斑白蠶蛾的性別決定級(jí)聯(lián)反應(yīng);在與家蠶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的蔗莖禾草螟Chilosacchariphagus中,則沒有找到Fem的同源基因[51-52]。棉鈴蟲W染色體上的蛋白質(zhì)編碼基因GUW1可能是其主要的性別決定初始信號(hào),能抑制雌蟲中HaMasc的表達(dá),調(diào)控雌性分化,然而該猜想還需要試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[29,53]。雖然鱗翅目昆蟲的W染色體常與性別有關(guān),但W染色體并不總是對(duì)性別決定起主導(dǎo)作用。如利用樗蠶蛾Samiacynthia的2個(gè)亞種S.cynthiapryeri(WZ/ZZ)和S.cynthiawalkeri(neo-Wneo-Z/neo-Zneo-Z)進(jìn)行正反交試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)F2代中存在無W染色體和 neo-W染色體的雌蟲以及攜帶W染色體或neo-W染色體的雄蟲,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)W染色體和neo-W染色體的存在與否對(duì)卵的孵化率并沒有影響,表明W染色體對(duì)樗蠶蛾這2個(gè)亞種的性別決定和生殖能力不起作用[54]。隨后通過人工合成的多倍體試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)樗蠶蛾的性別是由Z染色體數(shù)量與常染色體數(shù)量的比值所決定[55]。

2.2 鱗翅目昆蟲Masc基因研究進(jìn)展

Masc基因能調(diào)控下游基因dsx形成雄性特異性剪接體,實(shí)現(xiàn)雄性性別分化。Masc基因最初在家蠶Z染色體上發(fā)現(xiàn),由10個(gè)外顯子組成,編碼一種鋅指蛋白Masc,在雌蟲中被FempiRNA沉默,促使Bmdsx形成雌性特異剪接體。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Masc蛋白在胚胎期會(huì)抑制雄蟲Z染色體上基因的表達(dá),具劑量補(bǔ)償?shù)淖饔肹43]。目前,在地中海粉螟、棉鈴蟲、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis、小地老虎Agrotisipsilon、三角斑白蠶蛾、小菜蛾、斜紋夜蛾Spodopteralitura、美國白蛾Hyphantriacunea等鱗翅目昆蟲中均發(fā)現(xiàn)了Masc蛋白,敲除Masc后,雄蟲的外生殖器、精巢等出現(xiàn)異常,生長發(fā)育和生殖能力受到了負(fù)面影響;在部分物種的雄蟲突變體中,甚至出現(xiàn)了胚胎或早期幼蟲致死的現(xiàn)象(表2),表明Masc基因在雄蟲正常生長發(fā)育中起著重要作用[43,51,53,56-61]。

表2 鱗翅目昆蟲Masc基因研究進(jìn)展Table 2 Research progresses in Masc gene in lepidopteran insects

Masc蛋白由588～658個(gè)氨基酸組成,具4個(gè)典型的結(jié)構(gòu),2個(gè)串聯(lián)的CCCH型鋅指結(jié)構(gòu)域(CCCH-type zinc finger domains, ZFs),1個(gè)核定位信號(hào)和1個(gè)高度保守的含11個(gè)氨基酸的區(qū)域[58,62-63]。目前已發(fā)現(xiàn)的Masc蛋白幾乎都有2個(gè)串聯(lián)的ZFs,但有研究表明ZFs對(duì)于鱗翅目昆蟲雄性化和劑量補(bǔ)償不是必須的。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除家蠶Masc基因的ZFs后,發(fā)現(xiàn)突變后的雄性胚胎正常生長,無任何表型缺陷[62]。在對(duì)地中海粉螟的研究中發(fā)現(xiàn),EkMasc和EkMascB兩個(gè)基因只在雄性早期胚胎中表達(dá),編碼類似的Masc蛋白,調(diào)控Ekdsx形成雄性特異剪接體,但在這兩個(gè)Masc蛋白中未發(fā)現(xiàn)ZFs[57]。雖然目前對(duì)ZFs的功能并不清楚,但Masc蛋白C端(210～288個(gè)氨基酸)富含脯氨酸的區(qū)域、第301和304位高度保守的2個(gè)半胱氨酸殘基Cys,都是調(diào)控雄性化和劑量補(bǔ)償?shù)年P(guān)鍵區(qū)域[57,62,64]。

2.3 鱗翅目昆蟲dsx基因研究進(jìn)展

不同昆蟲的性別決定初始信號(hào)不同,但性別決定級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的基因dsx在雙翅目、膜翅目、鞘翅目、直翅目、鱗翅目等昆蟲中均有發(fā)現(xiàn)且保守性較高[65]。dsx基因受上游基因的調(diào)控,形成雌雄性別特異的剪接體,進(jìn)一步調(diào)控下游性別偏向基因的表達(dá),最終實(shí)現(xiàn)雌雄性別分化,是性別決定與性別分化的中間樞紐。dsx編碼的DSX蛋白,N端一般都有一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(OD1),中間有一個(gè)蛋白寡聚結(jié)構(gòu)域(OD2)以及C末端有一個(gè)性別特異的氨基酸序列[66-67]。

研究發(fā)現(xiàn),黑腹果蠅雌蟲中,dsx在上游基因tra/tra2的調(diào)控下形成雌性特異剪接體,促進(jìn)雌性相關(guān)基因的表達(dá),最終完成雌性的性別分化[68]。在家蠶中鑒定出了一個(gè)與黑腹果蠅dsx同源的基因Bmdsx,其受到Z染色體上Masc基因的調(diào)控。Bmdsx有6個(gè)外顯子,雄性早期胚胎中,Bmdsx轉(zhuǎn)錄成不含外顯子3和4的雄性特異BmdsxMmRNA,編碼蛋白BmDSXM,激活雄蟲中信息素結(jié)合蛋白(pheromone-binding protein, PBP)基因高表達(dá),促進(jìn)雄性生殖器的發(fā)育;而雌性特異BmdsxFmRNA則包含外顯子3和(或)4,編碼BmDSXF蛋白,正向調(diào)控雌蟲中表達(dá)的卵黃蛋白原(vitellogenin,Vg)基因和雌性特異六聚體儲(chǔ)存蛋白1(storage protein 1, Sp1)基因[69-73]。對(duì)其他鱗翅目昆蟲的dsx進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)dsx都在上游基因的調(diào)控下形成性別特異的剪接體,從而促進(jìn)性別偏向基因的表達(dá),實(shí)現(xiàn)性別分化(表3)[56,74-82]。

表3 鱗翅目昆蟲dsx基因研究進(jìn)展Table 3 Research progresses in dsx gene in lepidopteran insects

目前在不少鱗翅目昆蟲中都發(fā)現(xiàn)了dsx的可變剪接,雄蟲大多只有一種剪接體,而雌蟲中卻有多種形式的剪接體。先后在家蠶中發(fā)現(xiàn)了BmdsxF1、BmdsxF2和BmdsxF3等3種雌性特異剪接體,產(chǎn)生的3種蛋白均能調(diào)控Vg、Sp1等在雌蟲中上調(diào)表達(dá)[69,83-84]。在小地老虎和小菜蛾中,dsx分別有6種和3種雌性特異的剪接體[76,78]。但對(duì)美國白蛾的研究發(fā)現(xiàn),雄蛹中至少包含了3種dsx的剪接體,不同于其他物種dsx只有一種雄性特異剪接體的情況[82]。dsx除了能通過可變剪接調(diào)控雌雄性別分化外,還發(fā)現(xiàn)存在基因復(fù)制調(diào)控雌雄二型的分化。如Rodriguez-Caro等[74]在菊黃花粉蝶Zerenecesonia中發(fā)現(xiàn)了dsx的直系同源基因dsxA及其復(fù)制產(chǎn)生的旁系同源基因dsxB,dsxA在雄性翅中表達(dá),dsxB在雌性翅中表達(dá),從而調(diào)控翅膀雌雄二型的發(fā)育。這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn),表明dsx在控制昆蟲性別分化中的功能多樣。

3 鱗翅目性別決定機(jī)制在昆蟲遺傳調(diào)控中的應(yīng)用

昆蟲遺傳調(diào)控技術(shù)是通過對(duì)昆蟲的基因進(jìn)行整合,讓靶標(biāo)基因調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育,從而導(dǎo)致害蟲種群衰退甚至滅亡。鑒于dsx基因的保守性,目前在鱗翅目昆蟲中,dsx是昆蟲遺傳調(diào)控中常用的可遺傳性別決定靶標(biāo)基因[85]。其中基于dsx可變剪接構(gòu)建的昆蟲不育技術(shù)(SIT)和釋放攜帶雌性特異顯性致死基因昆蟲技術(shù)(female-specific release of insects carrying dominant lethal, fsRIDL),已在家蠶、斜紋夜蛾、小菜蛾等昆蟲中進(jìn)行研究。

3.1 基于dsx可變剪接構(gòu)建的昆蟲不育技術(shù)(SIT)研究進(jìn)展

SIT是指通過物理、化學(xué)處理或遺傳不育獲得不育雄蟲,然后將大量的不育雄蟲釋放到野外與野生型雌蟲進(jìn)行交配,導(dǎo)致雌蟲不育或產(chǎn)生的后代不育,從而達(dá)到減少害蟲種群數(shù)量的目的。以草地貪夜蛾Sfdsx基因外顯子2、4和5為靶標(biāo)分別設(shè)計(jì)構(gòu)建突變體,其中外顯子2是雌雄蟲dsx剪接體共有的區(qū)域,外顯子4是dsx雌蟲剪接體特有的,而外顯子5是dsx雄蟲剪接體所特有的(圖2);讓這3種突變體分別與野生型的雌雄蟲配對(duì),發(fā)現(xiàn)與野生型相比,這3種突變體繁殖力顯著下降。野生型雌蟲與雄蟲突變體(即突變外顯子5)交配后,其產(chǎn)卵量下降率達(dá)91%,卵的孵化率為0[80]。在美國白蛾中,利用dsx外顯子的特異性,敲除Hcdsx外顯子3和5后,分別獲得了雌蟲和雄蟲的不育突變體(圖2),發(fā)現(xiàn)敲除外顯子3的雄蟲生殖能力不受影響,讓該雄蟲突變體與野生型雌蟲進(jìn)行雜交,顯示這種突變能在子代中繼續(xù)遺傳給下一代,且當(dāng)子代雌性個(gè)體獲得純合的遺傳突變時(shí)表現(xiàn)為不育[61]。雖然鱗翅目昆蟲dsx的突變能產(chǎn)生雌雄性別特異的不育成蟲,但還有待進(jìn)行后續(xù)的田間試驗(yàn)。

圖2 草地貪夜蛾和美國白蛾基于dsx可變剪接構(gòu)建的突變位點(diǎn)示例圖Fig.2 Constructed mutation sites based on dsx variable splicing in Spodoptera frugiperda and Hyphantria cunea

3.2 基于dsx可變剪接構(gòu)建的釋放攜帶雌性特異顯性致死基因昆蟲技術(shù)(fsRIDL)研究進(jìn)展

fsRIDL通過將致死基因與某些能進(jìn)行性別特異剪接的基因或性別特異性啟動(dòng)子相結(jié)合,使致死基因能在雌蟲中特異性表達(dá),而同樣攜帶致死基因的雄蟲則正常生長發(fā)育。當(dāng)攜帶致死基因的雄蟲釋放到田間與野生型雌蟲進(jìn)行交配后,致死基因能在后代中順利表達(dá),并導(dǎo)致子代雌蟲死亡,最終達(dá)到消滅害蟲種群的目的[86-87]。目前,鱗翅目中常見的fsRIDL系統(tǒng)是基于dsx可變剪接構(gòu)建的四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)(Tet-off)。Tet-off有調(diào)節(jié)元件(tTAV)和反應(yīng)元件(tetO)兩部分,正常情況下,tTAV與tetO相結(jié)合,增強(qiáng)tetO下游基因的表達(dá),形成一個(gè)正向反饋循環(huán)系統(tǒng);當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物等解毒劑存在時(shí),解毒劑與tetO結(jié)合,tTAV的表達(dá)被抑制[86]。根據(jù)鱗翅目昆蟲雌雄蟲dsx的剪接形式不同,將調(diào)節(jié)元件tTAV插入雌性特異剪接體所特有的外顯子3中,而反應(yīng)元件tetO則插入到雌雄蟲dsx剪接體所共有的外顯子2中(圖3)。當(dāng)飼料中有解毒劑時(shí),解毒劑與tetO結(jié)合,使得tTAV的轉(zhuǎn)錄停止,雌蟲生長發(fā)育正常;但停止提供解毒劑時(shí),雌蟲中tTAV與tetO正常結(jié)合, tTAV蛋白不斷積累造成對(duì)細(xì)胞的毒害,最終導(dǎo)致雌蟲在幼蟲期就死亡。而雄蟲中dsx的可變剪接不包含調(diào)節(jié)元件tTAV,因此有無解毒劑都不會(huì)激活tetO下游基因的表達(dá),雄蟲均能正常生長發(fā)育?；赿sx可變剪接構(gòu)建的fsRIDL已在棉紅鈴蟲Pectinophoragossypiella、家蠶以及小菜蛾中成功實(shí)現(xiàn)[88-89]。在溫室中引入Tet-off篩選出來的小菜蛾雄成蟲,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因雄成蟲競(jìng)爭(zhēng)野生雌蛾進(jìn)行交配的能力比野生雄蟲強(qiáng),最終成功導(dǎo)致野生種群數(shù)量下降,同時(shí)發(fā)現(xiàn)釋放該轉(zhuǎn)基因雄成蟲還能延緩Bt抗性在小菜蛾自然種群中的擴(kuò)散,具較好的種群控制作用[90]。

圖3 基于dsx基因性別特異性可變剪接與Tet-off系統(tǒng)相結(jié)合的fsRIDL結(jié)構(gòu)示例圖Fig.3 Schematic representation of fsRIDL of Tet-off system constructs based on dsx female- and male-specific variable splicing

3.3 其他性別相關(guān)基因在鱗翅目性別篩選中的應(yīng)用

不少研究人員在雙翅目、鞘翅目和膜翅目昆蟲的性別決定通路中都發(fā)現(xiàn)tra和tra2基因參與調(diào)控dsx基因的可變剪接,在家蠶中也發(fā)現(xiàn)tra2的同源基因Bmtra2參與調(diào)控Bmdsx,且敲除Bmtra2后,導(dǎo)致雌雄蟲在胚胎期死亡[91]。基于Bmtra2基因這一性質(zhì),研究人員利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技術(shù)介導(dǎo)同源重組,將Cas9基因轉(zhuǎn)入家蠶W染色體中,構(gòu)建了雌性特異表達(dá)Cas9的品系;以 PiggyBac轉(zhuǎn)座子的方式將sgRNA(靶標(biāo)Bmtra2)整合到雄蟲染色體中,構(gòu)建了雄性特異表達(dá)sgRNA的品系。2種品系雜交產(chǎn)生的子代中,雌蟲Cas9和sgRNA同時(shí)表達(dá)時(shí),Bmtra2被敲除,在胚胎期死亡;而雄胚胎中無Cas9的表達(dá),成功存活(圖4)[92]。這為基于基因組編輯工具對(duì)昆蟲性染色體實(shí)施基因定點(diǎn)整合、實(shí)現(xiàn)蠶業(yè)早期篩選大量雄蠶以及鱗翅目害蟲遺傳調(diào)控技術(shù)提供了理論與實(shí)踐依據(jù)。

圖4 通過CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行家蠶W染色體連鎖靶基因整合操作示例圖Fig.4 Diagram of target gene integration operation linked to the W chromosome of silkworms by CRISPR/Cas9 technology

4 展望

傳統(tǒng)的SIT有輻射不育、化學(xué)不育、胞質(zhì)不親和性染色體易位等,研究較多的是輻射不育[93]。但輻射不育的突變體常產(chǎn)生較大的適合度代價(jià),競(jìng)爭(zhēng)交配能力弱,難以持續(xù)有效地控制害蟲的數(shù)量;當(dāng)有新蟲源加入種群,依然有大暴發(fā)的可能性,需要多次大量釋放才能達(dá)到預(yù)期效果[94]。近年來,隨著對(duì)昆蟲性別決定機(jī)制的不斷研究,性別決定途徑已經(jīng)并將繼續(xù)成為昆蟲種群調(diào)控技術(shù)的重要組成部分,對(duì)性別決定和性別分化相關(guān)基因的研究將促進(jìn)SIT的發(fā)展。如對(duì)岡比亞按蚊Anophelesgambiae的dsx基因進(jìn)行雌性特異的突變,導(dǎo)致雌性純合突變體完全不育,但并不會(huì)影響雄蟲的繁殖能力[95]。對(duì)dsx雌雄蟲特異的剪接體進(jìn)行基因編輯獲得雌性或雄性不育的成蟲,已在埃及伊蚊Aedesaegypt、橘小食蠅Bactroceradorsalis、草地貪夜蛾、美國白蛾等多種昆蟲中成功應(yīng)用[61,80,96-97]。除了dsx基因,還有對(duì)性別分化相關(guān)基因的研究,如利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata的tra2基因的ts2位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變,獲得的純合tra2ts2突變體成功實(shí)現(xiàn)了由雌蟲到雄蟲的性別轉(zhuǎn)換[98]。同樣地,利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)敲除斜紋夜蛾雄蟲分化基因Ser2導(dǎo)致了雄蟲不育,而雌蟲生殖功能正常。將構(gòu)建的雄蟲不育品系與野生型雌蟲進(jìn)行雜交后,只有少數(shù)卵能孵化。研究者進(jìn)一步檢測(cè)Ser2突變體雄蟲不育表型的可遺傳性,發(fā)現(xiàn)在斜紋夜蛾中,雄性不育表型能在后代中穩(wěn)定遺傳[59]。除了利用CRISPR直接敲除關(guān)鍵基因,實(shí)現(xiàn)雌蟲的性別逆轉(zhuǎn)或雄蟲不育,基于CRISPR的精確引導(dǎo)SIT技術(shù)(precision guided SIT, pgSIT)則通過同時(shí)破壞雄蟲生殖能力和雌蟲生存能力所必需的基因,確保所有存活的F1代都是不育的雄蟲,以達(dá)到直接釋放基因編輯過的卵就能抑制種群的效果,是一種更實(shí)用的SIT新技術(shù)[99]。該技術(shù)已在果蠅和埃及伊蚊中應(yīng)用,果蠅中同時(shí)敲除βTub、sxl基因成功導(dǎo)致100%的雄性不育和雌性致死;埃及伊蚊中同時(shí)敲除βTub、myo-fem基因成功導(dǎo)致雄性不育和雌性無飛行能力,無飛行能力的雌蟲存活率和繁殖力均明顯降低。模擬pgSIT,基于Wolbachia的不相容昆蟲技術(shù)(incompatible insect technique,IIT)、RIDL和fsRIDL技術(shù)對(duì)種群密度進(jìn)行控制,發(fā)現(xiàn)直接釋放pgSIT處理的埃及伊蚊卵抑制種群的效果最好,表現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力[99-100]。目前在家蠶、香梨優(yōu)斑螟Euzopherapyriella中已發(fā)現(xiàn)tra2的同源基因[77,101]。Ser2基因已被證實(shí)在家蠶、小菜蛾的雄性生殖和不育中發(fā)揮重要作用[102]。因此未來繼續(xù)對(duì)鱗翅目dsx、tra2和Ser2等性別分化相關(guān)基因的功能進(jìn)行研究,將會(huì)豐富SIT的潛在靶基因,為pgSIT等技術(shù)在鱗翅目昆蟲中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

性別決定初始信號(hào)在不同昆蟲中表現(xiàn)出多樣性和專一性,家蠶中以Fem為雌蟲分化的初始信號(hào),果蠅以XSE的表達(dá)量作為調(diào)控性別的初始信號(hào),意大利蜜蜂Apismellifera則以Csd基因的純合/雜合作為信號(hào)[43,103-104]。對(duì)性別決定初始信號(hào)進(jìn)行敲入或敲除,能實(shí)現(xiàn)雌雄蟲完全的性別逆轉(zhuǎn)。如Nix基因是埃及伊蚊雄蟲的性別決定初始信號(hào),研究人員構(gòu)建Nix轉(zhuǎn)基因雌蟲品系,成功實(shí)現(xiàn)了雌蟲100%轉(zhuǎn)化為可育的雄蟲,且該性別逆轉(zhuǎn)獲得的雄蟲能繼續(xù)穩(wěn)定地產(chǎn)生后代。同時(shí)有模擬顯示,釋放這種含性別轉(zhuǎn)化純合基因的雄蟲能實(shí)現(xiàn)種群的自我維持,會(huì)比SIT更有效地抑制害蟲種群[105-107]。然而家蠶雄蟲中表達(dá)Fem時(shí),并未出現(xiàn)從雄性到雌性的性別逆轉(zhuǎn)突變體,推測(cè)家蠶中可能還存在另一種主要的性別決定初始信號(hào)[108]。因此未來繼續(xù)對(duì)鱗翅目性別決定初始信號(hào)進(jìn)行研究,實(shí)現(xiàn)從雌性到雄性的完全性別逆轉(zhuǎn),或?qū)⒔档蛯?shí)現(xiàn)雌雄蟲分離和害蟲防控的成本。