2017-2019年濟寧市健康人群腦膜炎奈瑟菌流行病學和基因組學分析

王 珊,杜照中,尹 強,韓淑琪,趙 劍,江亞娟,王勝男,溫紅玲

腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis,N.meningitidis)是一種革蘭氏陰性雙球菌,人是它的唯一易感宿主,有10%的人群都為腦膜炎奈瑟菌的攜帶者[1]。當腦膜炎奈瑟菌穿過黏膜上皮侵入到血液時,就會引起嚴重的侵入性腦膜炎球菌病(invasive meningococcal disease,IMD)[2-3],其主要包括流行性腦脊髓膜炎和菌血癥[4]。

根據(jù)腦膜炎奈瑟菌莢膜多糖的結構,可以將其分為13個血清群,而大部分的腦膜炎球菌病是由A群、B群、C群、Y群、W群和X群這6個血清群的菌株引起的[5]。目前已有研制出針對于A群、C群、Y群和W群莢膜多糖的疫苗,針對于B群表面蛋白也已研發(fā)出疫苗,并且可以覆蓋部分B群腦膜炎奈瑟菌[5-6]。由于疫苗的使用,世界各國引起腦膜炎球菌病的菌株的血清型組成發(fā)生了很大的變化。在中國,隨著1982年開始普及A群莢膜多糖疫苗,原來占據(jù)主導的A群腦膜炎奈瑟菌的發(fā)病率穩(wěn)步下降[7],而B群和C群成為腦膜炎球菌病主要致病菌[8]。腦膜炎球菌病主要由健康人群的上呼吸道分泌物傳播,而腦膜炎奈瑟菌的傳播和攜帶階段是致病的先決條件,對健康人群攜帶腦膜炎奈瑟菌情況進行研究,可以幫助了解腦膜炎奈瑟菌的流行病學情況,并有針對性地采取預防措施[9-10]。

近幾年,基因組測序技術發(fā)展迅速,細菌全基因組測序的成本也逐漸降低。腦膜炎奈瑟菌在全球范圍傳播的過程中不斷地進化,其基因組復雜多變,并且其經(jīng)常會發(fā)生同源重組現(xiàn)象,因此對其進行全基因組研究很有必要[11]。利用基因組測序的數(shù)據(jù),我們可以基于腦膜炎奈瑟菌的核心基因進行cgMLST,這比傳統(tǒng)的MLST要更加精準[12]。本研究針對濟寧市2017—2019年健康人群腦膜炎奈瑟菌攜帶情況進行調(diào)查,并且分析檢出的腦膜炎奈瑟菌的基因組特征。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑 巧克力雙抗平板和氧化酶試劑購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,革蘭染液購自珠海貝索生物技術有限公司,生化鑒定試劑購自青島海博生物,Remel腦膜炎奈瑟菌多價族凝集血清,腦膜炎奈瑟菌乳膠凝集試劑(bioMerieux),QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit(51306)。

1.1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方 法

1.2.1 樣本采集 根據(jù)《山東省健康人群流行性腦脊髓膜炎帶菌狀況調(diào)查方案》,每一次調(diào)查均隨機抽取濟寧市嘉祥縣2個鄉(xiāng)鎮(zhèn)及1個街道辦事處,每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)(街道辦事處)選取2個村(居委會)設置調(diào)查點,調(diào)查對象分為<3歲、3歲～、6歲～、13歲～、17歲～、≥20歲6個年齡組,并且保持男女比例均衡。于2017年4月(流行期)、2018年1月(流行前期)、2018年4月(流行期)、2018年5月(流行后期)、2019年4月(流行期),采集健康人群咽拭子,并對咽拭子標本進行N.meningitidis的檢測。

1.2.2 菌株分離、鑒定及血清分型 參照《流行性腦脊髓膜炎診斷標準附錄A》(WS295-2008),將采集的咽拭子標本直接接種在提前預熱的巧克力雙抗平板上,保溫運送至實驗室,放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從平板上挑出中等大小、表面光滑、濕潤、略帶灰白色、半透明露珠狀的菌落繼續(xù)傳代培養(yǎng)。分離的菌株進行革蘭染色、氧化酶試驗、生化鑒定,將革蘭染色呈陰性咖啡豆形雙球菌、氧化酶陽性、能夠分解葡萄糖和麥芽糖且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的菌株初步鑒定為N.meningitidis,通過血清玻片凝集試驗并輔以乳膠凝集試驗進行血清凝集。

1.2.3 基因組提取與測序 復蘇2017-2019年菌株(共21株菌株,2株復蘇失敗),成功復蘇的19株N.meningitidis(菌株編號為LN1～LN19)見表2。使用QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit(51306)提取細菌基因組,由上海伯杰科技有限公司進行基因組序列測定。使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit進行文庫的構建,在Illumina NovaSeq 測序平臺上進行了基因組的測序。采用FastQC對數(shù)據(jù)進行質量控制。采用A5-MiSeq[13]和SPAdes[14]對去除接頭序列的測序數(shù)據(jù)進行從頭拼裝,獲得最終的基因組框架圖。測得的基因組數(shù)據(jù)上傳到了PubMLST數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/organisms/neisseria-spp)中的 Bacterial Isolate Genome Sequence Database(BIGSdb)[15],以進行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 使用PubMLST網(wǎng)站上的MLST分析工具得到了19株菌株的MLST分型,同時得到了菌株的抗原編碼基因的分型,包括PorA-VR1、PorA-VR2和FetA-VR。同時,對19株菌株進行了核心基因組多位點序列分析(cgMLST),并將90%的菌株都存在的基因序列導出,使用IQ-TREE[16]構建了ML系統(tǒng)發(fā)育樹(bootstrap值為1 000),選擇Z2491 (GenBank accession No.NC_003116)作為根。為了進一步研究菌株的詳細分群和進化關系,本研究選擇了PubMLST數(shù)據(jù)庫中的中國的N.meningitidis的基因組一起進行了cgMLST分析。為了保證所選基因組的測序質量,僅選擇了基因組大于1 Mb的基因組,共有436個基因組進行了分析。使用Genome Comparator進行cgMLST分析,參數(shù)選擇N.meningitidiscgMLST v1.0。使用Splits Tree(v4.18.2)對cgMLST分析得到的差異矩陣進行網(wǎng)絡構建。

1.2.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用卡方檢驗比較率的差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 2017-2019年濟寧市N.meningitidis流行情況 2017-2019年共檢測1 086份健康人群咽拭子標本,檢出21株N.meningitidis,帶菌率為1.93%。其中2017年帶菌率最高,為3.63%;2019年最低,為0.46%。各年齡組的帶菌率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=20.601,P<0.01),17～19歲年齡組帶菌率最高,為6.11%,3～5歲、≥20歲年齡組未分離出N.meningitidis。男性的帶菌率為2.31%,女性的帶菌率為1.53%,二者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.869,P>0.05)。見表1。分離到的21株腦膜炎奈瑟菌分為3個血清型,其中B群最多,為15株,C群僅有1株,不可分群為5株。流行期帶菌率為2.30%(15/652),流行前期帶菌率為0.93%(2/216),流行后期為1.83%(4/218),不同流行時期帶菌率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.398,P>0.05)。

表1 2017—2019年濟寧市不同年齡組、不同性別健康人群腦膜炎奈瑟菌帶菌率

2.2 19株N.meningitidis的基因組特征、MLST分型及系統(tǒng)發(fā)育樹 19株N.meningitidis菌株均成功獲得了基因組數(shù)據(jù),其基因組大小為2.05～2.18 Mb,GC含量均在51.5%～51.9%,具體見表2。值得注意的是,19株N.meningitidis菌株通過血清分型實驗測得有3株菌株為不可分群菌株(NG),而通過基因組預測其莢膜血清型均為B型。

表2 19株腦膜炎奈瑟菌的基因組信息

通過MLST分型,19株N.meningitidis菌株的ST序列分型為ST-12301(5株)、ST-14655(4株)、ST-5664(1株)、ST-4821(1株)、ST-5662(1株)、ST-3012(1株)、ST-16838(1株)、ST-17464(1株)、ST-17465(1株)、ST-17466(1株)、ST-17467(1株)和ST-17468(1株)。見圖1。其中菌株LN3、LN4、LN5、LN6和LN15的序列型之前從未發(fā)現(xiàn)過,為本研究新發(fā)現(xiàn)的ST型。

注:紅色虛線框內(nèi)為屬于CC4821群的菌株。

5株ST-12301菌株和菌株LN15有著相同的PorA分型(P1.22,14-6),而它們的FetA可變區(qū)并沒有被匹配到已有的分型中。4株ST-14655菌株中,有3株菌(LN16、LN17和LN19)有著同樣的PorA分型(P1.12-1,13-2)和FetA分型(F4-21),而這3株菌株均在2018年流行后期從同一學校高中學生咽拭子中分離得到,提示該型別腦膜炎奈瑟菌可能已在學生中傳播,有潛在流行風險。另一株ST-14655菌株有著單獨的PorA亞型(P1.12-1,13-9)和FetA亞型(F5-19)。其余菌株各自有獨特的PorA分型和FetA分型(圖1)。

通過對包括這19株在內(nèi)的436株N.meningitidis基因組的cgMLST分析構建Neighbor-net網(wǎng)絡,見圖2。這19株菌株之間的親緣關系與構建系統(tǒng)發(fā)育樹所得到的關系基本一致(圖1)。在這436株菌株中,有235株來自于無癥狀攜帶者,176株來自于患者,有25株并沒有登錄來源信息。從莢膜血清型來看,這436株菌株分別為A群(39株)、B群(232株)、C群(101株)、E群(1株)、W群(32株)、X群(4株)和Y群(8株),有16株為不可分群,有3株菌沒有莢膜血清型信息。由圖3A可以看出,無論是來自于無癥狀攜帶者的菌株還是來自于患者的菌株,B群和C群都是占比最高的兩個類群。來自于患者的菌株中A群和C群的占比要比來自于無癥狀攜帶者的高。

注:節(jié)點顏色代表了菌株的血清群分型。

注:A.患者與健康攜帶者分離的菌株中各莢膜血清型的分類情況;B.各克隆群中莢膜血清型的分類情況;C.各克隆群中菌株分離來源情況。

結合cgMLST分析,我們對這436株N.meningitidis菌株克隆群進行了分析。共有11個克隆群被分析出來,其中包括:CC4821(270株)、CC5(29株)、CC11(27株)、CC1(18株)、CC175(11株)、CC41/44(6株)、CC23(3株)、CC8(1株)、CC103(1株)、CC198(1株)和CC269(1株),其他68株菌為UA菌株。根據(jù)之前的研究[17],CC4821可以分為4個子系:L44.1、L44.2、L44.3及L44.4,其中L44.1子系的致病性較高。CC4821克隆群中,有84株屬于L44.1子系。由圖2、圖3B和圖3C可以看出,各個克隆群中的血清型分布和致病性并不相同。B群和C群主要分布在CC4821和UA群中。而A群主要分布于CC5和CC1克隆群中。W群主要是CC11克隆群。值得注意的是,CC4821中來自于患者的菌株占比為32.6%(88/270),L44.1中來自于患者的菌株占比達到了69.0%(58/84)。

菌株LN3、LN5、LN8、LN10、LN16、LN17、LN18和LN19這8株屬于CC4821,而其他11株菌均為不可歸類的克隆群。見圖2。進一步挑選出436株N.meningitidis中的CC4821構建Neighbor-net網(wǎng)絡(圖4),并根據(jù)之前的研究對其4個子系進行識別,可以看出本研究中分離到的N.meningitidis菌株分屬于不同的子系。菌株LN18屬于L44.1子系,菌株LN3屬于L44.3子系。菌株LN5、菌株LN8以及4株ST-14655(LN10、LN16、LN17、LN19)菌株屬于L44.2子系。

圖4 基于cgMLST構建的CC4821菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 19株N.meningitidis菌株的疫苗抗原分析 對19株N.meningitidis菌株的疫苗抗原分析,發(fā)現(xiàn)它們之間的疫苗抗原類型有明顯的差異(圖1)。有7種fHbp肽分型,其中包括fHbp肽分型16(7株)、分型39(6株)、分型571(2株)、分型18(1株)、分型22(1株)、分型405(1株)以及分型14(1株)。除了菌株LN18,所有的CC4821的菌株的fHbp肽都為分型16。NHBA肽分型要更多,共有9種。其中有6株菌株屬于NHBA肽分型1059,而4株ST-14655菌株屬于NHBA肽分型688。所有的菌株都缺失了NadA肽。

通過分析MenDeVAR指數(shù)[18],部分N.meningitidis的表面抗原對Bexsero和Trumenba兩種疫苗有交叉反應。僅有菌株LN16的表面抗原fHbp肽分型14對疫苗Bexsero有交叉反應。而7株屬于CC4821的菌株的表面抗原fHbp肽分型16和菌株LN6的表面抗原fHbp肽分型14對疫苗Trumenba有交叉反應。

3 討 論

我國的腦膜炎發(fā)病流行期為1-5月,之前的研究表明我國約70%的病例都發(fā)生在流行期[19]。在濟南市2008-2015年的健康人群腦膜炎奈瑟菌帶菌率調(diào)查中,濟南市的平均帶菌率為1.02%,大于7歲年齡組的帶菌率最高[20]。而在山西省2016-2017年的調(diào)查中,其帶菌率為2.99%,15～24歲組帶菌率最高[21]。之前對于全球健康者腦膜炎奈瑟菌帶菌情況的Meta分析表明,腦膜炎奈瑟菌帶菌率在19歲左右達到峰值[1]。本次研究中,流行期健康人群的腦膜炎奈瑟菌帶菌率最高,為2.30%,而平均帶菌率為1.93%,這符合之前的研究結果。本次研究中帶菌者主要分布于17～19歲的年齡組,帶菌率達6.11%,這與之前的研究基本相符,今后應重點關注該年齡組人群。

我國自1982年開始普及A群莢膜多糖疫苗,流腦的發(fā)病率明顯下降,同時我國腦膜炎奈瑟菌的主要血清群由A群向B群和C群轉移[8]。2005-2015年江西省分離到的腦膜炎奈瑟菌中,有60.12%為C群,29.76%為B群,16%為不可分群[22]。2011-2021年,浙江省腦膜炎奈瑟菌的研究中,有53.33%確診病例是由B群腦膜炎奈瑟菌引起的,20%為C群,而健康人群攜帶的腦膜炎奈瑟菌中有70.59%為B群,5.88%為C群,17.65%為不可分群[10]。本次研究中,在濟寧市分離到的陽性菌株里,B群占比最高,為71.43%(15/21),C群為4.76%(1/21),不可分群為23.80%(5/21)。同時,在對全國436株腦膜炎奈瑟菌基因組進行分析時,B群和C群也占據(jù)了主要的類群,這與之前的研究相吻合。值得注意的是,在本研究分離到的菌株中,有3株菌血清型為不可分群,而通過對基因組的分析,其基因型為B型,這可能是因為莢膜基因簇cps中的唾液酸莢膜生物合成基因cssA-C或多聚唾液酸轉移酶基因csb中產(chǎn)生了滑鏈錯配,從而使基因相位變異導致莢膜不能正常表達[23-24]。

CC4821群為我國發(fā)現(xiàn)的一類腦膜炎奈瑟菌,2003年其在安徽省暴發(fā)之后就迅速擴散成為我國腦膜炎奈瑟菌的主要克隆群之一[25]。CC4821群主要由B型和C型血清群構成,且之前的研究發(fā)現(xiàn),它們之間存在著莢膜轉換和基因重組[26-27]。多個研究表明CC4821群內(nèi)存在著明顯的聚類分支[26,28],最近的一項研究將CC4821群分為L44.1、L44.2、L44.3和L44.4四個分支,而多數(shù)的患者分離菌株都為L44.1分支[17]。本研究中完成基因組測序的19株菌株中,有42.1%(8/19)屬于CC4821群,其余菌株都不能歸類于特定的克隆群。其中菌株LN18屬于L44.1分支,其血清型為C型,經(jīng)分析其FetA基因型為3-3,與之前研究L44.1分支中患者分離株的分型相同[17],該菌株可能有潛在的致病性。在對全國436株腦膜炎奈瑟菌基因組進行分析時,有61.93%(270/436)的菌株都屬于CC4821群,而其中L44.1分支來自于患者的菌株占比達到了69.0%(58/84)。這與之前的研究基本一致。這些結果表明在接下來的研究中CC4821群仍是值得重點關注的類群。

綜上,通過研究分析對2017-2019年濟寧市健康人群腦膜炎奈瑟菌的流行情況有了一定了解,同時我們從基因組層面上細致深入的分析了菌株的遺傳特征,發(fā)現(xiàn)5種新的ST型。這為接下來的研究工作打下了基礎,并指引了方向。我們將持續(xù)監(jiān)測濟寧市健康人群腦膜炎奈瑟菌的流行狀況,并從基因組水平研究其進化發(fā)育特征,及早發(fā)現(xiàn)潛在的流行風險,為制定預防控制策略提供依據(jù)。

利益沖突：無

引用本文格式：王珊,杜照中,尹強,等.2017-2019年濟寧市健康人群腦膜炎奈瑟菌流行病學和基因組學分析[J].中國人獸共患病學報,2023,39(9):879-886.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.093