黃昭陽(yáng),張炎華,朱 穎,翁育偉,

2019年12月,中國(guó)武漢報(bào)道了由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的肺炎病例[1],世界衛(wèi)生組織將該病(World Health Organization,WHO)命名為COVID-19(Coronavirus disease 2019)。2020年3月11日,WHO宣布COVID-19已形成“全球大流行”。截至2023年2月10日,全球有超過(guò)200個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)告COVID-19確診病例超過(guò)7.55億,死亡病例683萬(wàn)例。SARS-CoV-2具有高度變異性,自新冠病毒武漢株之后,先后進(jìn)化成為Alpha、Beta、Gamma、Zeta、Delta等多種變異株以及數(shù)量不等的子代進(jìn)化分支。伴隨病毒持續(xù)變異和進(jìn)化,SARS-CoV-2傳染性逐步增強(qiáng),并顯示出逐漸增強(qiáng)的免疫逃逸性,2021年11月在南非被首次確認(rèn)的Omicron變異株更是具有高度的傳染性和免疫逃逸能力,對(duì)全球公共衛(wèi)生產(chǎn)生了巨大挑戰(zhàn)。由于SARS-CoV-2高度的傳染性和致病性,我國(guó)將其列為第二類病原微生物進(jìn)行管理。根據(jù)《國(guó)家實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB19489-2008),涉及SARS-CoV-2活病毒的試驗(yàn)均應(yīng)在BSL-3(Bio-safety level-3)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,但由于BSL-3實(shí)驗(yàn)室建設(shè)要求高,數(shù)量較少,極大限制了SARS-CoV-2病原學(xué)、免疫學(xué)等研究工作的開(kāi)展。

假型化病毒(Pseudotyped virus)是一種被異源外膜蛋白包被,通過(guò)基因工程技術(shù)引入復(fù)制缺陷表型的病毒顆粒[2],能很好模擬野生病毒吸附、進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程,同時(shí)可避免病毒泄漏導(dǎo)致的人員感染,是可替代野生病毒在低生物安全等級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)研究的安全有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚3]。在體外抗病毒分析和體內(nèi)生物分布分析的數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn),使用假型化病毒與使用活的野生型病毒產(chǎn)生的結(jié)果高度相關(guān)[4-5]。鑒于假型化病毒的相對(duì)安全性和可操作性,它被廣泛用于各類新發(fā)和再發(fā)傳染性病毒的實(shí)驗(yàn)研究,包括MERS-CoV[6]、狂犬病毒(Rabies virus)[7]、埃博拉病毒(Ebola virus)[8]、拉薩病毒(Lassa virus)[9]等。為安全、高效開(kāi)展SARS-CoV-2抗體中和試驗(yàn),本研究基于HIV包裝系統(tǒng),通過(guò)密碼子優(yōu)化和體外包裝條件的優(yōu)化,構(gòu)建了表達(dá)S蛋白的假型化SARS-CoV-2,并比較了其與野生型病毒在抗體中和試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性和一致性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒、血清 HEK 293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC,Vero E6細(xì)胞由本課題組保存,pCR-XL-2-TOPO和E.coliTOP 10購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購(gòu)自南京金斯瑞生物科技股份有限公司,慢病毒骨架載體pHAGE-CMV-Luc2-IRES-ZsGreen-W、pHDM-Hgpm2、pRC-CMV-Rev1b、pHDM-Tat1b購(gòu)自Addgene。S基因的密碼子優(yōu)化和合成委托南京金斯瑞生物科技股份有限公司進(jìn)行。血清采集自新冠滅活疫苗加強(qiáng)免疫后(第3劑)人群,本研究通過(guò)福建省疾病預(yù)防控制中心倫理審查[閩疾控倫審(2021)第(021)號(hào)]。實(shí)驗(yàn)所用野生型SARS-CoV-2均為福建省疾病預(yù)防控制中心BSL-3實(shí)驗(yàn)室分離。

1.2 主要試劑和工具酶 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、青/鏈霉素等購(gòu)自GIBCO公司。限制性內(nèi)切酶KpnI、NotI購(gòu)自NEB公司,引物序列由尚亞生物科技有限公司合成,質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京全式金公司,膠回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司,質(zhì)粒大提試劑盒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine 3000)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司,兔抗SARS-CoV-2 S蛋白和山羊抗兔lgG H&L購(gòu)自Abcam公司,螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 SARS-CoV-2 S基因優(yōu)化、設(shè)計(jì)與表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 從COVID-19病例(武漢類似株感染者)樣本提取病毒RNA,使用RT-PCR擴(kuò)增獲得S蛋白編碼基因全長(zhǎng)(引物Spike-Fw/Bw,見(jiàn)表1),反應(yīng)條件為:98 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸4 min,循環(huán)30次;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)純化后插入pCR-XL-2-TOPO并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,重組質(zhì)粒經(jīng)sanger法測(cè)序后進(jìn)行S基因全長(zhǎng)密碼子優(yōu)化,優(yōu)化后的S基因插入pcDNA3.1(+)。

表1 本研究使用的引物序列信息

使用引物(表1)分別對(duì)密碼子未優(yōu)化和優(yōu)化后的S基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)設(shè)計(jì)S蛋白C端肽段缺失13個(gè)(SEPVLKGVKLHYT)和19個(gè)(KFDEDDSEPVLKGVKLHYT)氨基酸的引物,擴(kuò)增不同長(zhǎng)度S基因。在上游引物序列加入kozak序列用以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率。將擴(kuò)增產(chǎn)物分別插入pcDNA3.1(+)并轉(zhuǎn)化E.coliTOP 10,得到6種S蛋白表達(dá)載體,即未經(jīng)密碼子優(yōu)化和優(yōu)化后的全長(zhǎng)(W-S1、W-OS1)、C末端缺失13個(gè)氨基酸(W-△S13、W-△OS13)、C末端缺失19個(gè)氨基酸(W-△S19、W-△OS19)。按照上述方法,參考GenBank病毒序列,構(gòu)建Delta(GISAID:EPI_ISL_10067523.1)和Omicron(GISAID:EPI_ISL_6913991.1)變異株S蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(D-△OS13、O-△OS13)。

1.4 假型化病毒包裝與表達(dá)質(zhì)粒篩選 293T細(xì)胞(2.5×105/孔)接種于細(xì)胞板,待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將上述構(gòu)建的6種S蛋白表達(dá)質(zhì)粒和空載pcDNA3.1(+)分別與pHAGE-CMV-Luc2-IRES-ZsGreen-W、pHDM-Hgpm2、pRC-CMV-Rev1b、pHDM-Tat1b用Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染6 h后更換為2%血清的培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清。

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定,0.5% Triton X-100室溫通透細(xì)胞,5% BSA封閉,加入兔抗SARS-CoV-2 S1(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜,山羊抗兔lgG(1∶2 000)室溫孵育1 h,DAPI對(duì)細(xì)胞核染色,在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

將VeroE6細(xì)胞(4×104/孔)接種于96孔板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,加入病毒上清(100 μL/孔),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞,再加入100 μL螢光素酶底物,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的螢光相對(duì)發(fā)光值(Relative luminescence units,RLU),篩選螢火蟲(chóng)螢光酶活性最高的表達(dá)質(zhì)粒類型。

1.5 假型化病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染比例的確定 采用不同比例的包裝質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒,以及不同比例的DNA和Lipofectamine 3000,共9種不同組合共轉(zhuǎn)染293T,24 h后收獲上清。上清感染Vero E6細(xì)胞24 h后,檢測(cè)每組RLU。

1.6 不同時(shí)間點(diǎn)收獲轉(zhuǎn)染后假型化病毒感染細(xì)胞的能力測(cè)定 為確定轉(zhuǎn)染后假型化病毒收集和假型化病毒在Vero E6細(xì)胞最佳表達(dá)時(shí)間,分別于轉(zhuǎn)染293T后24～96 h,間隔24 h收集假型化病毒上清,同時(shí)在感染VeroE6后24～96 h內(nèi),間隔24 h檢測(cè)RLU。

1.7 假型化病毒的滴定 將Vero E6(4×104/孔)接種于96孔板,24 h后吸棄培養(yǎng)液。用含2%FBS培養(yǎng)基系列稀釋(1∶10)假型化病毒,加入細(xì)胞培養(yǎng)孔(100 μL/孔),每個(gè)稀釋度做4個(gè)復(fù)孔,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后檢測(cè)RLU。以高于細(xì)胞對(duì)照均值10倍的孔判定為陽(yáng)性孔,Reed-Muench法計(jì)算假型化病毒的50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。

1.8 中和抗體水平檢測(cè)

1.8.1 假型化病毒中和抗體試驗(yàn) 采用上述方法構(gòu)建的假型化病毒檢測(cè)201份新冠疫苗加強(qiáng)免疫后的血清中和抗體滴度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)對(duì)照,即陰性對(duì)照:未接種新冠疫苗者血清和假型化病毒;病毒對(duì)照:只加入假型化病毒;空白對(duì)照:不含血清和假型化病毒。將Vero E6(4×104/孔)接種于96孔板,24 h后吸棄培養(yǎng)液,用2% FBS培養(yǎng)基系列稀釋(1∶2～1∶512)血清樣本,每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)孔。用2%FBS培養(yǎng)基將假型化病毒稀釋至100 TCID50/50 μL。取70 μL稀釋后的血清樣本與70 μL稀釋于含 2% FBS培養(yǎng)基的假型化病毒液混合,37 ℃孵育1 h,取100 μL假型化病毒-血清混合液加入細(xì)胞孔,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后檢測(cè)RLU。感染抑制率(%)=(1-血清組RLU/病毒對(duì)照組RLU)×100%。抑制率≥50%判定為具有中和活性。該稀釋度即血清中和抗體滴度。

1.8.2 野生型病毒中和抗體試驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)在福建省疾病預(yù)防控制中心BSL-3實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)操作與假型化病毒血清中和抗體檢測(cè)操作一致,每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)孔。野生病毒感染細(xì)胞后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至7 d,觀察細(xì)胞病變情況,采用Reed-Muench 法計(jì)算50%感染抑制率時(shí)血清稀釋倍數(shù),該稀釋度即為該血清樣品的中和抗體滴度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn);采用Spearman秩相關(guān)性分析,一致性分析采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SARS-CoV-2 S基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 從病例樣本中擴(kuò)增的S蛋白全長(zhǎng)基因(圖1A),測(cè)序結(jié)果表明序列為SARS-CoV-2武漢類似株S基因全長(zhǎng)序列。對(duì)S基因密碼子優(yōu)化前后的全長(zhǎng)、C末端不同缺失長(zhǎng)度的基因進(jìn)行擴(kuò)增,并于與載體pcDNA3.1(+)連接,獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒用KpnI和NotI雙酶切,其片段大小均與預(yù)期相符合(圖1B),同時(shí)測(cè)序結(jié)果顯示6種S基因表達(dá)序列正確。

2.2 S蛋白表達(dá)質(zhì)粒的確定 6種武漢類似株S蛋白表達(dá)質(zhì)粒分別與包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞,收集轉(zhuǎn)染后病毒上清,感染Vero E6細(xì)胞。感染24 h后的免疫熒光顯示,Vero E6細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)有綠色熒光(圖2A-B);感染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性顯示(圖3),基于W-△OS13構(gòu)建的假型化SARS-CoV-2的熒光素酶活性最高(H=0.329,P=0.566)。參照W-△OS13構(gòu)建方法,構(gòu)建Delta和Omicron變異株的S蛋白表達(dá)質(zhì)粒(D-△OS13和O-△OS13)?；?種變異株S蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的假型化SARS-CoV-2感染Vero E6細(xì)胞,感染24 h后胞漿內(nèi)可見(jiàn)有綠色熒光(圖2C-F)。

注:A-B.W-△OS13;C-D.D-△OS13;E-F.O-△OS13。

圖3 基于6種武漢類似株S蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的假型化SARS-CoV-2感染后細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性

2.3 假型化病毒包裝系統(tǒng)的優(yōu)化和收獲病毒感染細(xì)胞時(shí)間點(diǎn)的確定 包裝質(zhì)粒和目的質(zhì)粒(S蛋白表達(dá)質(zhì)粒)比例分別以1∶1、3∶1、4∶1混合,同時(shí)以1∶1、1∶2、1∶3比例(μg∶μL)混合質(zhì)粒DNA和Lipfectamine 3000,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并收集假型化病毒上清,上清感染Vero E6細(xì)胞后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性,各組間比較,結(jié)果為在包裝質(zhì)粒∶目的質(zhì)粒=3∶1、轉(zhuǎn)染總質(zhì)粒DNA∶Lipfectamine 3000=1∶2條件下,測(cè)得的螢火蟲(chóng)螢光素酶活性最高(H=19.143,P<0.000 1,圖4)。

注:應(yīng)用不同條件下包裝的假型化病毒(W-△OS13)感染Vero E6后,熒光素酶活性差異顯著。control:無(wú)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的空白對(duì)照。***:P<0.001;****:P<0.000 1。

在上述轉(zhuǎn)染條件下,間隔24 h收取病毒上清,感染Vero E6細(xì)胞并測(cè)定螢光素酶活性,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后24 h收集的假型化病毒,螢光素酶活性最高,隨著收樣時(shí)間的延長(zhǎng),滴度降低(H=32.838,P<0.000 1,圖5A);對(duì)假型化病毒感染后的不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定螢光素酶活性,結(jié)果表明,感染后48 h時(shí)螢光素酶活性最高,72 h、96 h活性下降(H=15.295,P<0.000 1,圖5B)。

注:A.轉(zhuǎn)染后24 h收獲的假型化病毒(W-△OS13);B.該病毒感染細(xì)胞后48 h檢測(cè),熒光素酶活性相較高。control:無(wú)添加假型化病毒的空白對(duì)照。**:P<0.01; ****:P<0.000 1。

2.4 中和抗體試驗(yàn) 分析3種不同變異株的假型化病毒(W-△OS13、D-△OS13、O-△OS13)與相應(yīng)野生型病毒(Wuhan-like、Delta、Omicron)中和抗體實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性,結(jié)果顯示(圖6A-C),3種變異株假型化病毒與相應(yīng)野生型病毒的中和試驗(yàn)結(jié)果呈較強(qiáng)的相關(guān)性(R2分別為0.915 0、0.898 4和0.799 0,均P<0.001);進(jìn)一步分析3種變異株假型化病毒與相應(yīng)野生型病毒的中和試驗(yàn)的一致性,Bland-Altman圖(圖7A-C)可見(jiàn)大部分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)落在95%一致性界限之內(nèi),對(duì)應(yīng)的ICC分別0.957、0.943和0.880,顯示假型化病毒與野生型病毒中和試驗(yàn)結(jié)果有較好的一致性(P<0.001,表2)。

注:A.野生型病毒W(wǎng)uhan-like與假型化病毒W(wǎng)-△OS13;B.野生型病毒Delta與假型化病毒D-△OS13;C.野生型病毒Omicron與假型化病毒O-△OS13。圖中上、下虛線為95%一致性界限的上、下限。

表2 野生型病毒與假型化病毒組內(nèi)相關(guān)系數(shù)

3 討 論

隨著新冠病毒感染疫情的持續(xù)蔓延和大量變異株的出現(xiàn),研發(fā)有效的疫苗和抗病毒藥物是當(dāng)前控制新冠病毒感染疫情的迫切需要,而相關(guān)研發(fā)工作無(wú)法避免使用病毒分離株。出于實(shí)驗(yàn)室生物安全的考慮,以及生物安全管理的限制,目前SARS-CoV-2無(wú)法在低等級(jí)實(shí)驗(yàn)室使用,極大限制了上述研發(fā)工作的開(kāi)展。由于假型化病毒表面可嵌合異源病毒表面蛋白,能夠很好的模擬異源野生型病毒,同時(shí)極大減少人員感染和病毒的傳播,因此許多研究者采用人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV-1)和水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)包裝系統(tǒng),構(gòu)建假型化病毒用于替代野生型SARS-CoV-2,開(kāi)展疫苗和藥物研發(fā)以及其他涉及活病毒的科研工作。Schmidt F等[10]利用復(fù)制缺陷的HIV-1病毒質(zhì)粒,將其與密碼子優(yōu)化后的SARS-CoV-2刺突蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生SARS-CoV-2假型化病毒。Ou X等[11]將SARS-CoV-2 S蛋白表達(dá)質(zhì)粒psPAX2和pLenti GFP共轉(zhuǎn)染到HEK 293T細(xì)胞中,成功構(gòu)建出SARS-CoV-2假型化病毒。Nie J等利用SARS-CoV-2 S蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1和VSV包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞構(gòu)建成功假型化病毒,并在 VSV基因組中攜帶螢火蟲(chóng)熒光素酶[12],成功建立了基于假型化病毒的抗體中和試驗(yàn)[13]。

S蛋白是SARS-CoV-2的主要外膜蛋白,介導(dǎo)病毒吸附和感染,是SARS-CoV-2疫苗和藥物研制主要靶點(diǎn)[14],但S蛋白胞內(nèi)表達(dá)后,需經(jīng)歷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體之間的中間室膜上組裝和“出芽”,由于其C末端二元基序突變或氨基酸缺失可導(dǎo)致缺乏細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào),有利于S蛋白向細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)細(xì)胞表面S蛋白的增加和合胞體的形成并引導(dǎo)感染在細(xì)胞間的傳播[15]。在假型化病毒構(gòu)建中,有研究表明,S蛋白C端缺失18個(gè)[16]或19個(gè)[17]氨基酸可顯著提高SARS-CoV-2假型化病毒滴度;另外,Nie Y等[18]報(bào)道優(yōu)化S蛋白的N 端信號(hào)肽序列亦可提高SARS-CoV-2假型化病毒包裝效率。因此,為提高假型化病毒的滴度,本研究除對(duì)S基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上,對(duì)其C末端進(jìn)行截短,結(jié)果表明,在C端缺失13個(gè)氨基酸條件下所產(chǎn)生的假型化病毒滴度較高。除了對(duì)S基因進(jìn)行優(yōu)化外,本研究還對(duì)包裝條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,當(dāng)包裝質(zhì)?！媚康馁|(zhì)粒=3∶1,質(zhì)粒DNA∶Lipfectamine3000=1∶2,轉(zhuǎn)染后24 h后收獲的假型化病毒滴度較高,同時(shí)細(xì)胞感染48 h后病毒的表達(dá)水平較高。這與其他研究者的結(jié)果類似,有研究表明,當(dāng)骨架質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒配比為2∶1時(shí),所產(chǎn)生的假型化病毒滴度較高[19];Hu J等[17]發(fā)現(xiàn)用轉(zhuǎn)染48 h后收集的假型化病毒侵染細(xì)胞72 h后侵染效率最高等。因此,通過(guò)上述條件的優(yōu)化,我們成功的構(gòu)建了基于HIV包裝系統(tǒng)的假型化SARS-CoV-2,并獲得較高的病毒滴度。

除不斷出現(xiàn)新變異株外,SARS-CoV-2新變異株的復(fù)制、傳播能力也普遍增強(qiáng),有研究顯示,Delta感染后病毒濃度是武漢株的1 000倍[20],傳染性幾乎是最初武漢毒株的兩倍;而Omicron變異株是一種傳播力更強(qiáng)、感染率更高的變異毒株[21-22]。盡管有報(bào)道稱兩次接種早期毒株生產(chǎn)的疫苗對(duì)Delta具有一定的有效率[23],但是隨著病毒變異增加,新變異株是否對(duì)疫苗的保護(hù)產(chǎn)生免疫逃逸,需要更多的研究來(lái)加以評(píng)價(jià)。基于此,本研究在成功構(gòu)建武漢株假型化病毒的基礎(chǔ)上,對(duì)Delta和Omicron這2種主要流行變異株進(jìn)行了假型化,并對(duì)3種假型化病毒的抗體中和檢測(cè)的效果,與基于野生型病毒的中和檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較[24-25],結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的3種假型化病毒檢測(cè)結(jié)果與野生型病毒檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性和相關(guān)性。但同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn),兩者間的相關(guān)性系數(shù)R2和組內(nèi)相關(guān)系數(shù)ICC隨著病毒變異度的增加而逐漸下降,其原因可能在于,本研究中構(gòu)建假型化病毒選取的Delta和Omicron 2種變異株的S蛋白基因來(lái)自于該變異株的原始毒株序列,而野生型病毒來(lái)自于變異株的子代分支(分離株),因此在構(gòu)建假型化SARS-CoV-2以及后續(xù)中和試驗(yàn)的應(yīng)用中,可能需要考慮S基因的來(lái)源問(wèn)題。

綜上,本研究成功構(gòu)建了基于HIV包裝系統(tǒng)的SARS-CoV-2假型化病毒系統(tǒng),中和抗體檢測(cè)結(jié)果表明,3種變異株假型化病毒與野生病毒中和抗體結(jié)果有良好的相關(guān)性和一致性,因此所構(gòu)建的假型化病毒可作為一個(gè)安全、可靠、適宜替代品,用于在低等級(jí)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展SARS-CoV-2相關(guān)的免疫學(xué)等試驗(yàn),同時(shí)本研究的構(gòu)建方法,對(duì)于新發(fā)變異株以及其他高致病性披膜病毒的假型化有重要的參考價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：黃昭陽(yáng),張炎華,朱穎,等.應(yīng)用于抗體中和試驗(yàn)的假型化新型冠狀病毒的構(gòu)建[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(9):857-864.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.102