姚廷山,莫其會(huì),鐘林宇,胡軍華,晏承泉,李慶春,楊顏芳

(1 西南大學(xué)柑桔研究所,重慶,400712;2 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,重慶,400716)

柑桔是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。近年,由子囊菌門(mén)真菌柑桔間座殼菌Diaporthecitri(無(wú)性態(tài)為柑桔擬莖點(diǎn)霉菌Phomopsiscitri,屬于半知菌類(lèi)擬莖點(diǎn)霉屬)侵染引發(fā)的病害發(fā)展成為我國(guó)柑桔主要病害,因受害部位及癥狀不同,分別被稱(chēng)為砂皮病(侵染葉片、小枝及幼果,患病組織表面常有紫褐色至黑褐色硬質(zhì)、略突出的膠點(diǎn),呈現(xiàn)為砂皮狀)、樹(shù)脂病(侵染枝干)、蒂腐病(侵染貯藏期果實(shí))。防控該病原菌的為害主要依靠化學(xué)防治,三唑類(lèi)、多菌靈、甲基硫菌、吡唑醚菌酯等殺菌劑效果良好[1-4]。目前我國(guó)農(nóng)藥劑型主要為乳油和可濕性粉劑等,載藥顆粒大,分散性能差,導(dǎo)致農(nóng)藥易流失,利用率不高。近年來(lái),納米材料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到應(yīng)用,納米試劑可以改善農(nóng)藥對(duì)靶標(biāo)的親和性,減少流失與分解,控制藥物釋放速率,延長(zhǎng)持效期,降低其在非靶標(biāo)區(qū)域和環(huán)境中的投放量與殘留污染,從而實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥的減量增效[5-6]。本試驗(yàn)從重慶市長(zhǎng)壽區(qū)“愛(ài)媛38”(現(xiàn)在普遍被稱(chēng)為“紅美人”)雜柑園采集典型砂皮病葉,分離純化及鑒定病原菌,研究其生物學(xué)特性,篩選對(duì)其具抑制作用的納米藥劑,以期為防控該菌侵染為害提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年4—5月從重慶市長(zhǎng)壽區(qū)“愛(ài)媛38”柑桔園采集砂皮病典型癥狀病葉。

培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA,馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA,馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA,胡蘿卜200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA,燕麥片30 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L)、Czapek培養(yǎng)基(硝酸鈉2 g,磷酸氫二鉀1 g,氯化鉀0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,硫酸鎂0.5 g,蔗糖30 g,瓊脂20 g,水1 L)[7]。

納米試劑包括土霉素碳量子點(diǎn)(OTC-CQDs)納米試劑(西南大學(xué)柑桔研究所提供)、SiO2納米試劑(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供)和星狀陽(yáng)離子聚合物(SPc)納米載體(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供)。

殺菌劑包括32%噻呋·氟環(huán)唑SC(山東省青島瀚生生物科技股份有限公司生產(chǎn))、430 g/L戊唑醇SC(拜耳股份公司生產(chǎn))和40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC(江西中迅農(nóng)化有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與鑒定 采用組織分離法[7],在病葉上取病健交界處組織3～4塊,消毒后放于PDA培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d,純化分離菌株,然后接種于PDA培養(yǎng)基上24 ℃培養(yǎng)7 d,觀察菌落培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子形態(tài)特征等。

采用科赫氏法則鑒定分離菌株的致病性。將分離菌株培養(yǎng)7 d后,接種菌餅在柑桔果實(shí)刺傷處,以接種無(wú)菌PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。使用無(wú)菌水浸濕脫脂棉保濕,28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察癥狀。取接種果實(shí)發(fā)病處組織再次分離病菌,與接種菌進(jìn)行比較[8]。

提取分離菌株DNA進(jìn)行分子鑒定。用滅菌的直徑5 mm的打孔器取菌餅,接種于PDA培養(yǎng)基上24 ℃恒溫保濕培養(yǎng)。當(dāng)菌落擴(kuò)展到培養(yǎng)皿的2/3時(shí),用滅菌的接種鏟輕輕地刮取菌絲,置于滅菌研缽中加入液氮充分研磨,至粉末狀。用滅菌藥匙將菌絲粉末轉(zhuǎn)移到滅菌的1.5 mL離心管中,采用真菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA,然后利用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。PCR反應(yīng)體系含有2×Taq PCR MasterMix 12 μL,引物ITS1 1 μL,引物ITS4 1 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min→(94 ℃變性1 min,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán))→72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)濃度,然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察,檢測(cè)到單一清晰的條帶,純化后送測(cè)序公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序所得序列,在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì),然后基于GenBank中報(bào)道的其他病原菌的序列信息,利用最大似然法(Maximum Likehood,ML)通過(guò)MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 病原菌生物學(xué)特性 設(shè)置不同的碳源、氮源、光照、溫度及pH值[10-11]等,觀測(cè)不同培養(yǎng)條件對(duì)分離菌株菌絲生長(zhǎng)的影響。

培養(yǎng)基的影響:將直徑5 mm的菌餅接種在PDA、PSA、CA和OA平板上,將接種好的平板倒置在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每個(gè)處理重復(fù)3次,培養(yǎng)7 d后觀察培養(yǎng)性狀,用十字交叉法測(cè)菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。

碳源的影響:基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Czapek培養(yǎng)基,把Czapek培養(yǎng)基的蔗糖分別換為相同碳量的乳糖、甘油、麥芽糖、可溶性淀粉和甘露醇葡萄糖,以配制不同碳源的培養(yǎng)基,接種直徑5 mm菌餅,每處理重復(fù)4次,25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)10 d后觀察培養(yǎng)性狀。

氮源的影響:基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Czapek培養(yǎng)基,把Czapek培養(yǎng)基的硝酸鈉分別換為相同氮量的尿素、蛋白胨、賴(lài)氨酸、甘氨酸和氯化銨,以配制不同氮源培養(yǎng)基,接種直徑5 mm菌餅,每處理重復(fù)4次,25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)10 d后觀察培養(yǎng)性狀。

光照的影響:將直徑5 mm菌餅接種PDA平板上,置于25 ℃恒溫培養(yǎng),分別設(shè)置24 h全光照、12 h光暗交替和24 h全黑暗培養(yǎng)等光照條件,每處理組重復(fù)4次,培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)10 d后觀察培養(yǎng)性狀。

溫度的影響:將直徑5 mm菌餅接種到PDA上,分別置于15、20、25、30、35 ℃等溫度條件下進(jìn)行完全黑暗培養(yǎng),每處理重復(fù)4次,培養(yǎng)2 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)7 d后觀察培養(yǎng)性狀。

pH值的影響:PDA培養(yǎng)基滅菌后,在無(wú)菌條件下利用鹽酸和氫氧化鈉溶液將PDA培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為5、6、7、8和9,制成不同pH值的平板,接種直徑5 mm菌餅,每處理重復(fù)4次,25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)7 d后觀察培養(yǎng)性狀。

1.3 不同試劑對(duì)病菌抑制作用測(cè)定

供試各納米試劑和抑菌劑各配成一定濃度溶液,分別與PDA混合制成含藥平板,使含藥平板中供試藥劑最終濃度分別為10、1、0.1、0.01、0.001 μg/mL等5個(gè)濃度處理,以加入等量無(wú)菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照,每處理重復(fù)3次,接種直徑8 mm菌餅于平板中央,28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,計(jì)算各處理菌絲生長(zhǎng)抑制率。抑制率(%)=[(對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-8)]×100。使用GraphPad prism 8軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),將藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)(x),菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成抑制概率值(y),計(jì)算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)及抑制中濃度(EC50)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 從采集病樣中,分離和純化培養(yǎng)獲得3個(gè)分離物,分別接種于PDA上24 ℃培養(yǎng),觀察病菌形態(tài)特征和分生孢子。其中,S2菌株的菌落白色,有花瓣?duì)钶喖y,氣生菌絲與培養(yǎng)基上菌絲較為發(fā)達(dá),未產(chǎn)生分生孢子。應(yīng)用菌餅接種法接種分離菌株于刺傷柑桔果實(shí)上,S2菌株可產(chǎn)生明顯的砂皮病癥狀,且從發(fā)病組織上再分離得到的菌與接種菌相同(見(jiàn)圖1)。

圖1 柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌絲形態(tài)及菌落形態(tài)

2.1.2 分子鑒定 利用rDNA-ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì),結(jié)果顯示S2菌株與Diaporthecitriasiana(KJ490616.1、MN816406.1)的同源性為100%。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示,S2菌株與Diaporthecitriasiana(亞洲柑桔間座殼)聚類(lèi)到一起,形成明顯分支(圖2)。

綜合菌株的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和rDNA-ITS序列比對(duì)結(jié)果,將S2菌株鑒定為Diaporthecitriasiana。

2.2 病菌生物學(xué)特性

2.2.1 培養(yǎng)基的影響 試驗(yàn)結(jié)果看出,S2菌株在4種供試培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng),但菌絲形態(tài)和擴(kuò)展速度存在差異。在OA上,菌落白色,邊緣棉絮狀,無(wú)輪紋,菌絲稀薄,菌絲擴(kuò)展速度最快,培養(yǎng)7 d,菌落直徑達(dá)到55.50 mm。在CA上,菌落灰色,邊緣白色、棉絮狀,具花瓣?duì)钶喖y,菌絲旺盛,菌絲擴(kuò)展速度最慢,培養(yǎng)7 d菌落直徑為44.05 mm。在PDA上,菌落白色,邊緣規(guī)則,具花瓣?duì)钶喖y,菌絲旺盛,培養(yǎng)7 d菌落直徑54.80 mm。在PSA上,菌落中心棕色,邊緣棉絮狀,無(wú)輪紋,菌絲稀薄,培養(yǎng)7 d菌落直徑52.33 mm(見(jiàn)圖3)。

圖3 柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌落形態(tài)

2.2.2 碳源的影響 在不同碳源Czapek培養(yǎng)基上,S2菌株均能生長(zhǎng),但菌落形態(tài)和菌絲擴(kuò)展速率存在差異。碳源為可溶性淀粉時(shí)培養(yǎng)10 d的菌落直徑63.50 mm,碳源為蔗糖處理時(shí)培養(yǎng)10 d的菌落直徑僅44.75 mm,兩者差異顯著(見(jiàn)表1和圖4)。

表1 柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在不同碳源Czapek培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d菌落生長(zhǎng)情況

圖4 柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在不同碳源Czapek培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d的菌落形態(tài)

2.2.3 氮源的影響 在不同氮源Czapek培養(yǎng)基上,S2菌株均能生長(zhǎng),但菌絲擴(kuò)展速率存在差異。氮源為蛋白胨時(shí)培養(yǎng)10 d的菌落直徑達(dá)到70.40 mm,氮源為氯化銨時(shí)培養(yǎng)10 d的菌落直徑僅33.3 mm,兩者差異顯著(見(jiàn)表2和圖5)。

表2 柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在不同氮源Czapek培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d菌落生長(zhǎng)情況

注:賴(lài)氨酸氮源處理培養(yǎng)基呈黃色,未接種菌株前即呈黃色。

2.2.4 光照的影響 不同光照條件下,S2菌株菌絲擴(kuò)展速率存在差異。在全光照條件下,菌絲擴(kuò)展速度最快,培養(yǎng)10 d的菌落直徑80.60 mm;在光暗交替條件下,菌絲擴(kuò)展速度最慢,培養(yǎng)10 d的菌落直徑77.30 mm(見(jiàn)表3和圖6)。

表3 柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在PDA培養(yǎng)基上不同光照條件培養(yǎng)10 d菌落生長(zhǎng)情況

圖6 柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在PDA培養(yǎng)基上不同光照條件培養(yǎng)10 d的菌落形態(tài)

2.2.5 溫度和pH值的影響 S2菌株在15～30 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),35 ℃時(shí)不能生長(zhǎng),最適合生長(zhǎng)的溫度為20～30 ℃(見(jiàn)圖7)。S2菌株在pH值5～9范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),最適合生長(zhǎng)的pH值范圍為5～7(見(jiàn)圖8)。

圖7 柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在PDA培養(yǎng)基上不同溫度下培養(yǎng)7 d的菌落形態(tài)

圖8 柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在不同pH值PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌落形態(tài)

2.2 殺菌劑和納米試劑的室內(nèi)毒力

3種殺菌劑對(duì)S2菌株的抑制作用強(qiáng),EC50值為40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC<32%噻呋·氟環(huán)唑SC<430 g/L戊唑醇SC,抑制效果為40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC>32%噻呋·氟環(huán)唑SC>430 g/L戊唑醇SC。3種納米試劑對(duì)S2菌株的抑制作用較強(qiáng),且同種試劑濃度越高,菌落直徑越小,抑制率越高。在納米試劑中,SiO2納米試劑的毒力最強(qiáng),EC50為1.024 μg/mL;星狀陽(yáng)離子聚合物(SPc)納米載體的毒力最弱,EC50為6.928 μg/mL(見(jiàn)表4)。

表4 供試殺菌劑和納米試劑對(duì)柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制作用及毒力

3 討論與結(jié)論

前人研究表明,不同地域條件對(duì)病原菌的生物學(xué)特性基本無(wú)顯著影響,而相同菌株在不同培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特性存在差異。本研究分離鑒定獲得的柑桔砂皮病菌S2菌株,在不同培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特性與前人研究結(jié)果基本一致[10]。該菌株對(duì)甘油、麥芽糖和可溶性淀粉等碳源的利用效果較佳,菌絲擴(kuò)展速度最快;對(duì)蛋白胨氮源的利用效果最好;在15～30 ℃均能生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為20～30 ℃,致死溫度為35 ℃;pH值5～9均能生長(zhǎng),最適pH值為5～7;光暗交替培養(yǎng)時(shí),菌落才出現(xiàn)花瓣?duì)钶喖y。

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明,3種殺菌劑對(duì)柑桔砂皮病菌S2菌株的抑制作用強(qiáng),與前人研究結(jié)果一致[13-14],其中,40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC抑制作用最強(qiáng),EC50值為1.024 μg/mL。供試納米試劑對(duì)柑桔砂皮病菌S2菌株均具有較強(qiáng)抑制作用,抑制效果為SiO2納米試劑>土霉素碳量子點(diǎn)納米試劑>星狀陽(yáng)離子聚合物(SPc)納米載體。SPc納米載體具有高效、簡(jiǎn)便及安全的納米傳遞系統(tǒng),可有效提升藥劑活性,在本試驗(yàn)中SPc納米載體單獨(dú)使用即可達(dá)到較好的抑制效果,EC50為6.928 μg/mL,后期結(jié)合篩選出的化學(xué)藥劑,提升效果的潛力巨大,但有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。國(guó)內(nèi)目前針對(duì)柑桔砂皮病菌,室內(nèi)篩選出的殺菌劑以苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯、咪鮮胺、代森錳鋅等殺菌劑為主,EC50范圍為0.099～0.950 μg/mL,殺菌效果顯著[8,15]。周娜等[16]測(cè)定了33種殺菌劑對(duì)柑桔砂皮病菌的毒力,表明雙胍三辛烷基苯磺酸鹽毒力最強(qiáng)(EC50為0.011 2 μg/mL),氟硅唑、多菌靈、咪鮮胺錳鹽、吡唑醚菌酯、肟菌·戊唑醇、唑醚·代森聯(lián)、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺和戊唑醇的毒力較強(qiáng)(EC50均在1 μg/mL以下),并推薦田間以使用氟硅唑和多菌靈為主防控柑桔砂皮病。田間防控砂皮病發(fā)現(xiàn),代森錳鋅等保護(hù)性殺菌劑具較好防效,但需連續(xù)多次施藥才能達(dá)防控效果,人工成本和用藥成本高[17],且易造成環(huán)境污染。將礦物油等增效劑與農(nóng)藥聯(lián)用可以增加農(nóng)藥黏性,增強(qiáng)藥效,達(dá)到減量增效的目的[18]。納米材料具有小尺寸效應(yīng)、大比表面積、高反應(yīng)活性、量子效應(yīng)等理化特性[19],這些特性使得納米材料應(yīng)用于農(nóng)藥時(shí),能提高農(nóng)藥對(duì)生物靶標(biāo)表面的黏附性和滲透性,減少流失和分解,控制農(nóng)藥釋放速度,延長(zhǎng)農(nóng)藥持效性,提高農(nóng)藥利用率[20]。目前在我國(guó)還未見(jiàn)關(guān)于納米農(nóng)藥用于柑桔砂皮病防控的報(bào)道。本試驗(yàn)篩選的3種納米試劑對(duì)柑桔砂皮病菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,為納米農(nóng)藥用于柑桔砂皮病的防控提供了依據(jù)。

在本研究中,未能測(cè)定柑桔砂皮病菌S2菌株的產(chǎn)孢時(shí)間及產(chǎn)孢量,也未涉及納米試劑與農(nóng)藥混合使用的效果及納米試劑對(duì)農(nóng)藥藥效的影響等內(nèi)容。這有待于進(jìn)一步研究。