齊 丹,曹玉芬,胡紅菊,張小雙,田路明,董星光,張 瑩,霍宏亮,徐家玉,劉 超,詹俊宇,張思夢

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧興城,125100;2 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所,武漢,430064)

梨屬(PyrusL.)屬于薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科(Maloideae)或梨亞科(Pomoideae)。我國是梨起源中心,也是栽培梨多樣性中心之一。我國梨栽培品種主要以傳統(tǒng)地方品種為主,約占栽培總面積的60%[1]。梨地方品種在經(jīng)過復(fù)雜的地理環(huán)境適應(yīng)和長期的人工選擇后,具有豐富的遺傳多樣性,是各具特色的一類品種。適于原產(chǎn)地的地方品種是梨種質(zhì)資源保存和改良的重要資源,深入了解梨地方品種的遺傳多樣性和遺傳變異,對于梨種質(zhì)資源多樣性的保護(hù)和重要農(nóng)藝性狀的遺傳改良具有重要意義。

隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展,分子標(biāo)記技術(shù)成為評估種質(zhì)資源遺傳差異和鑒定親緣關(guān)系的有效手段。Yamamoto等[2]最早開發(fā)了梨基因組的SSR(simple sequence repeats,簡單重復(fù)序列)引物;在梨基因組測序完成后,開發(fā)出了更多的梨基因組SSR引物[3]。SSR引物在梨屬植物的遺傳多樣性分析、品種鑒定、親緣關(guān)系分析、群體結(jié)構(gòu)分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面得到應(yīng)用[4-13]。

本研究利用均勻分布在梨染色體上的17對熒光SSR引物,使用分辨率高、重復(fù)性好、靈敏度高的毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測[14],對保存于國家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃和國家果樹種質(zhì)武昌砂梨圃的154份梨地方品種進(jìn)行遺傳背景分析,探討遺傳多樣性水平和群體遺傳結(jié)構(gòu),為梨地方品種的收集、保存、指紋圖譜構(gòu)建和分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料保存在國家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃和國家果樹種質(zhì)武昌砂梨圃的起源于12個省區(qū)的梨地方品種154份,其中,湖北13份,湖南7份,云南19份,四川29份,貴州7份,安徽9份,江蘇9份,江西15份,浙江13份,福建11份,廣西13份,廣東9份,具體見表1。

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增DNA提取:采用改良CTAB法提取葉片DNA,經(jīng)濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,通過Nano-200(奧盛儀器有限公司,杭州)微量分光光度計檢測將濃度稀釋至50 ng/μL備用。

SSR引物篩選:合成普通SSR引物300余對,對來自梨5個不同種的材料(白梨:秋白;砂梨:豐水;秋子梨:京白;新疆梨:花長把;西洋梨:哈代)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,篩選出多態(tài)性好、均勻分布在梨17對染色體上的SSR引物,對引物的5’端進(jìn)行6’-FAM熒光修飾。熒光修飾SSR引物由上海生工有限公司合成。

PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增體系為20 μL,其中DNA模板2 μL,Buffer 2 μL,dNTPs 2 μL,0.25 U Taq DNA聚合酶(英濰捷基貿(mào)易有限公司,上海),反應(yīng)程序參考本實(shí)驗(yàn)室的方法[15]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行3730XL毛細(xì)管電泳(ABI,美國),以GeneScanTM500 LIZ為分子內(nèi)標(biāo),獲得原始基因型數(shù)據(jù),利用GeneMapper 4.0軟件獲得擴(kuò)增片段的數(shù)值和峰圖。

1.3 數(shù)據(jù)分析利用GenAlEx 6.50軟件[16]計算多態(tài)性等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)及固定指數(shù)(F)等遺傳參數(shù),并分析群體間的群體遺傳距離(GD)和遺傳一致度(GI)。遺傳多樣性指數(shù)PIC計算公式:PIC=1-∑fij2,fij為第i個位點(diǎn)第j個等位基因出現(xiàn)的頻率。

利用POPULATION 1.2[17]軟件基于Neighbor-joining法構(gòu)建群體聚類和個體聚類圖,利用在線軟件iTOL[18]對個體聚類圖進(jìn)行加工修飾。

利用Structure 2.3.4軟件[19]分析154份梨地方品種的群體遺傳結(jié)構(gòu),采用的數(shù)據(jù)模型為混合模型。設(shè)置群體數(shù)K值為2～10,每個參數(shù)運(yùn)行10次,每次運(yùn)行的burn-in time設(shè)置為100 000,重復(fù)次數(shù)為200 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選篩選的17對熒光SSR引物名稱及來源見表2。

表2 南方梨地方品種在17對SSR熒光標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳多樣性特征

2.2 SSR位點(diǎn)多態(tài)性比較利用17對SSR熒光標(biāo)記位點(diǎn)在154份梨地方品種中共得到303個等位基因。不同位點(diǎn)上檢測到的等位基因數(shù)Na范圍為10(NH029a)～27(NAUpy63n)個,平均值為17.8個。不同位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)Ne范圍為2.581(NH029a)～12.326(NAUpy08t)個,平均值為6.407個。不同位點(diǎn)的香農(nóng)信息指數(shù)I范圍為1.324(NH029a)～2.779(NAUpy08t),平均值為2.150。不同位點(diǎn)的觀測雜合度Ho范圍為0.312(NAUpy09t)～0.851(NAUpy08t),平均值為0.690。不同位點(diǎn)的期望雜合度He范圍為0.613(NH029a)～0.919(NAUpy08t),平均值為0.822。固定指數(shù)F在NH029a和NAUpy54b中為負(fù)值,在其余15個引物中為正值,說明在154份供試材料中純合子較多,雜合子較少。不同位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)值范圍為0.578(NH029a)～0.913(NAUpy08t),平均值為0.805,說明所有位點(diǎn)均為高度多態(tài)性信息位點(diǎn)(PIC≥0.5)[20]?？梢?17個SSR位點(diǎn)的多態(tài)性豐富,能提供可靠的遺傳信息,可以檢測到供試材料間豐富的遺傳多樣性(見表2)。

2.3 群體間的遺傳距離12個群體間的遺傳距離(GD)為0.181～1.576,平均值為0.537;遺傳一致度(GI)為0.207～0.834,平均值為0.610。遺傳距離越大,說明親緣關(guān)系越遠(yuǎn),遺傳相似性越低。廣東群體和貴州群體之間的遺傳距離最大(1.576),遺傳一致度最小(0.207),說明兩者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。云南群體和四川群體之間的遺傳距離最小(0.181),遺傳一致度最大(0.834),兩者的親緣關(guān)系較近(見表3)?；谌后w之間的遺傳距離,構(gòu)建以Neighbor-Joining法構(gòu)建的聚類結(jié)果見圖1?？梢?群體間遺傳相似性和地理分布有一定關(guān)聯(lián),地理分布越近,群體間遺傳距離越小,遺傳一致度越高,親緣關(guān)系越近。

注:AH指安徽,JS指江蘇,ZJ指浙江,HJ指福建,JX指江西,HB指湖北,GZ指貴州,YN指云南,SC指四川,HN指湖南,GX指廣西,GD指廣東,圖4同。

表3 南方梨地方品種12個群體間的遺傳距離(GD,對角線下方)與遺傳一致度(GI,對角線上方)

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)將Structure分析得到的LnP(D)平均值和ΔK值繪制成折線圖(見圖2)。發(fā)現(xiàn),LnP(D)平均值折線圖無明顯折點(diǎn)。依據(jù)Evanno等[19]對最適群體數(shù)的判斷理論,取ΔK最大值對應(yīng)的K值為群體的最適類群數(shù),ΔK值最大時,K=4,即154份材料可劃分為4個類組(見圖3)。4個類組對應(yīng)的顏色分別是藍(lán)色、綠色、紅色和黃色。每個直方柱子代表一個樣本,柱子的顏色及顏色比例代表這個樣品屬于哪個亞群及所占的亞群比例。當(dāng)Q值≥0.6,認(rèn)為該個體的遺傳組分單一,Q值<0.6,認(rèn)為該個體遺傳組分復(fù)雜[24]。對Q值進(jìn)行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)140份材料背景單一,其中,類群1(藍(lán)色)最多為73個,類群2(綠色)為22個,類群3(紅色)為30個,類群4最少(黃色)為15個;14份材料遺傳背景復(fù)雜。類群1(藍(lán)色)品種分布廣泛,除廣東省外其他地區(qū)均有分布;類群2(綠色)主要集中在西南地區(qū),云南、四川和貴州;類群3(紅色)除西南和廣東外均有分布;類群4(黃色)主要分布在廣東,其次是廣西、福建和湖南。

圖2 南方梨地方品種群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中K值分別與LnP(D)和ΔK值的關(guān)系

2.5 個體聚類基于個體之間的Nei’s遺傳距離,以Neighbor-Joining法構(gòu)建的154份梨地方品種的聚類結(jié)果見圖4。在遺傳距離0.54處,154份梨地方品種可劃分為8個類群。類群I與其他類群遺傳距離較遠(yuǎn),親緣關(guān)系較遠(yuǎn),包含4個地區(qū)的6份材料,其中來自四川省2份,湖北省2份,福建省1份,江蘇省1份。類群II包含7個地區(qū)的25份材料,湖北省3份,江西省6份,安徽省6份,福建省5份,江蘇省3份,四川省1份,浙江省1份。類群III包含3個地區(qū)的7份材料,廣西壯族自治區(qū)4份,湖北省2份,云南省1份。類群IV包含8個地區(qū)的32份材料,主要來自長江流域,浙江省11份,江西省8份,福建省4份,安徽省3份,貴州省2份,湖北省2份,湖南省1份,江蘇省1份。類群V包含6個地區(qū)的29份材料,主要來自西南地區(qū)。類群VI包含5個地區(qū)的23份材料,廣東省9份,廣西壯族自治區(qū)6份,湖南省4份,四川省3份,福建省1份。類群VII包含5個地區(qū)的15份材料,其中四川省4份,云南省4份,湖北省3份,廣西壯族自治區(qū)3份,湖南省1份。類群VIII包含17份材料,主要來自西南地區(qū),四川省12份,貴州省4份,還有湖南省1份。個體聚類結(jié)果與地理分布有一定關(guān)聯(lián),也存在不同群體間的互相滲透。

圖4 南方梨地方品種基于Nei’s遺傳距離的NJ聚類

對比群體遺傳結(jié)構(gòu)和個體聚類分析對154份梨地方品種的劃分結(jié)果可發(fā)現(xiàn):類群I、III、VII和VIII基本上由紅色基因庫的品種組成;類群II由紅色和綠色基因庫的品種組成,組成比例為17∶7;類群IV主要由綠色基因庫品種組成,少量為紅色基因庫品種;類群V由所有藍(lán)色基因庫品種和少量紅色基因庫品種組成;類群VI由所有黃色基因庫品種和少量紅色基因庫品種組成;遺傳背景復(fù)雜的14個品種在類群II～VII中均有分布。綜上可見,個體聚類結(jié)果與其自身的遺傳背景相關(guān)。

3 討論

3.1 南方梨地方品種的多樣性分析和品種鑒定SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、可重復(fù)的特性,在種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究、指紋圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系分析等方面應(yīng)用較多。熒光修飾的SSR與TP_M13_SSR相比[25],直接修飾的熒光SSR可以少合成一條引物,省去二次擴(kuò)增的步驟,對退火溫度的要求相對寬松。利用17對熒光SSR引物在154份南方梨地方品種中擴(kuò)增出303個等位基因,平均每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)為17.8,高于Xue等[12]的17對SSR引物通過銀染法在478個梨品種中得到的等位基因數(shù)7.12。可見,與常規(guī)SSR銀染法相比,熒光SSR的PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后可在擴(kuò)增位點(diǎn)上檢測出更多的等位變異。本研究中,154份南方梨地方品種的遺傳多樣性(香農(nóng)信息指數(shù)I=2.150,觀測雜合度Ho=0.690,期望雜合度He=0.822)高于東亞栽培梨品種的遺傳多樣性(香農(nóng)信息指數(shù)I=1.74,觀測雜合度Ho=0.603,期望雜合度He=0.744)[13]。本研究篩選出的17對熒光SSR引物均勻分布在梨染色體上,多態(tài)性信息含量(PIC)值均大于0.5,屬于高多態(tài)性位點(diǎn),有助于梨種質(zhì)資源的進(jìn)一步挖掘利用。

在品種鑒定方面,17對熒光SSR引物可區(qū)分出142份梨品種的基因型。但“西降塢”與其芽變品種“粗皮西降塢”“細(xì)皮西降塢”沒有區(qū)分開;其余4組“建陽大梨”和“政和大雪梨”,“封開惠州梨”和“北流蜜梨”,“高要青梨”、“橫縣蜜(綠)”和“禾花梨”,“細(xì)把清水”和“魯沙”也沒有區(qū)分開,可能為同物異名品種。

3.2 南方梨地方品種的遺傳結(jié)構(gòu)及聚類分析遺傳結(jié)構(gòu)分析可提供個體的血統(tǒng)來源、組成信息和不同基因型遺傳信息的交流情況[26]。在梨屬植物上,Wahocho等[27]開展了基于貝葉斯模型的中國西部梨種質(zhì)資源和國外梨種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)分析,131份梨種質(zhì)資源形成2個不同的亞群,即中國西部梨種質(zhì)資源和國外梨種質(zhì)資源。為了探明中國南方梨地方品種的遺傳結(jié)構(gòu),本研究利用Structure軟件分析推測154個中國南方梨地方品種的遺傳結(jié)構(gòu),其中,140份(90.91%)南方梨地方品種的Q值大于0.6,說明大部分南方梨地方品種的血緣關(guān)系比較單一。其中,云南和四川的梨地方品種的基因來源以類群1(紅色)和類群2(藍(lán)色)為主,貴州的梨地方品種增加了部分類群3(綠色)的基因來源。長江流域的湖北、安徽、江蘇、江西、浙江的梨地方品種的基因來源以類群1(紅色)和類群3(綠色)為主,福建梨地方品種增加了部分類群4(黃色)的基因來源。廣西的梨地方品種的基因來源以類群1(紅色)和類群4(黃色)為主。廣東的梨地方品種的基因來源為類群4(黃色),廣東梨地方品種群與其他地區(qū)梨地方品種群的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。一般認(rèn)為梨屬植物起源于中國西部或西南部山區(qū)。基于12個群體NJ聚類圖來看,梨地方品種的傳播以西南地區(qū)的云南、四川、貴州為起點(diǎn)分為兩支,一支向湖北、安徽、江蘇、江西、浙江和福建傳播,另一支向湖南、廣西和廣東傳播。這與Xue等[12]研究發(fā)現(xiàn)砂梨?zhèn)鞑ヂ肪€是沿珠江和長江流域傳播至中國東南部沿海地區(qū)的結(jié)論相似。

154個南方梨地方品種的聚類結(jié)果和地理來源沒有明顯關(guān)聯(lián),而與其遺傳背景的組成相關(guān)。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能與梨自交不親和特性有關(guān),需要不同品種授粉才能產(chǎn)生后代,同時人類活動也促進(jìn)了不同地區(qū)梨品種的基因交流。近年來隨著梨育成品種的大面積推廣種植,導(dǎo)致傳統(tǒng)梨地方品種栽培面積逐漸減少,分析梨地方品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu),對優(yōu)質(zhì)梨種質(zhì)資源的挖掘利用、育種親本的選配等具有重要的指導(dǎo)意義。