劉 柳,劉 艷,李金鳳,張 璐,張曉曼

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院,河北保定 071000)

二型花柱是由基因控制的花的多態(tài)性,根據(jù)柱頭與花藥位置的不同分為長花柱和短花柱,是一種特殊的雌雄蕊異位方式[1],有利于花粉的準(zhǔn)確傳遞,促進(jìn)異交, 避免自花授粉和和形態(tài)內(nèi)授粉。自1583年在耳報春(Primulaauricular)和粉報春(Primulafarinose)中報道二型花柱現(xiàn)象以來,至少在28個由動物授粉的開花植物中發(fā)現(xiàn)過這種特殊的花部結(jié)構(gòu)[2-5],這是植物長期繁育和對環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化的必然結(jié)果。二型花柱植物通常具有自交不親和性,但在不同植物中所表現(xiàn)的可育性不同。此外,不同花柱之間還常伴有花粉數(shù)量、花藥大小、顏色、柱頭的形狀、突起高度、密度、分布的差異性[6-8],二型花柱的研究是生態(tài)學(xué)的熱點之一。

歐報春(Primulavulgaris)是報春花科(Primulaceae)報春花屬(PrimulaL.)多年生草本花卉。歐報春全株具香氣,葉面皺,呈長橢圓形,株高10～15 cm,是報春花屬中花色豐富度最高、品種相對最多,且應(yīng)用最為廣泛的植物,無論是在觀賞價值還是抗性方面都優(yōu)于其他報春,具有良好的開發(fā)前景。目前,對歐報春的研究較少,且已有的研究主要集中在花色形成機理與遺傳[9-10]、栽培育種[11-14]、組培體系的建立[15-16]等方面,缺乏對歐報春二型花柱的花部形態(tài)特征、繁育特性等基礎(chǔ)性研究。本文探究了歐報春二型花柱花部特征差異和繁育特性,為二型花柱植物自交不親和機制的研究奠定基礎(chǔ),對歐報春今后育種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究供試材料于2021年5月栽培于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室中(溫度維持在20～25 ℃)。2021年11月-2022年5月選取生長良好的歐報春植株進(jìn)行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 花部形態(tài)特征觀測

選擇處于盛花期的歐報春長花柱和短花柱各30株,每株選擇1個花序用游標(biāo)卡尺分別測量花冠直徑、花冠筒高度、柱頭高度(從子房基部到柱頭頂部距離)、花藥高度(從子房基部到花藥頂部距離)、花筒中部直徑(花冠筒的最窄處)等形態(tài)特征, 并將測量的數(shù)據(jù)分別詳細(xì)記錄,單位精確到0.01 mm。

1.2.2 花粉、柱頭形態(tài)掃描電鏡觀察

選取處于盛花期的長花柱和短花柱各10朵,分別將花粉用導(dǎo)電膠粘在金屬臺上,噴金,鍍膜,于Prisma E型掃描電鏡中拍照,觀察和測量觀察花粉赤道面觀、極面觀、表面紋飾和網(wǎng)眼形狀,測量花粉極軸長(P)、赤道軸長(E)。同樣步驟觀察花柱,測量花柱直徑和柱頭乳突細(xì)胞長度,拍照。

1.2.3 花粉/胚珠比、花粉活力和柱頭可授性測定

選取處于花蕾期的(雌雄蕊成熟但未散粉)長花柱和短花柱各20朵。參照Cruden[17]的方法,摘取所有花藥,用1.0 mol/L HC1在60 ℃條件下水解去除花藥壁,制成2.5 mL的懸浮液。先吸取0.01 mL,制片,重復(fù)記數(shù)直至觀察完所有懸浮液,分別統(tǒng)計歐報春長花柱和短花柱的花粉量;在解剖鏡下用解剖針挑破子房壁統(tǒng)計胚珠數(shù)量。

花粉/胚珠比=該花的花粉總量/胚珠數(shù)量。

于上午9:00,分別取開花1,3,5,7,9,11,13,15 d的長花柱和短花柱花粉,用 TTC染色法來測定花粉活力[18]。

花粉活力=具有花粉活力花粉數(shù)/觀察花粉總數(shù)×100%。

將上述檢測花朵的柱頭用鑷子取下,用聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液來檢驗歐報春柱頭的可授性[19]。參考孫建等[20]的分級標(biāo)準(zhǔn),1級:少量氣泡,可授性低,標(biāo)記為+/-;2級:氣泡較多,可授性中等,標(biāo)記為+;3級:有大量氣泡,可授性高,標(biāo)記為+/+。

1.2.4 雜交指數(shù)估測和雜交親和性測定

依Dafni[21]的方法,通過對歐報春成熟情況,性器官空間位置和花序直徑來估算歐報春雜交指數(shù)。

對歐報春的栽培種群進(jìn)行人工授粉,設(shè)置6種授粉組合:(1) 同型自花授粉,每日上午8:00,分別選擇當(dāng)天開放長花柱和短花柱的花朵,在未開放前套袋,7 d后揭開袋子,用潔凈的刷子蘸取同一朵花的花粉進(jìn)行授粉并套袋,標(biāo)記具體的授粉時間。(2)異株同型授粉,每日上午8:00,分別選擇當(dāng)天開放長花柱和短花柱的花朵,未散粉前對母本去雄并套袋。父本花粉,選擇不同株的同型植株,未開花前進(jìn)行套袋,待開花7 d后收集花粉用潔凈的刷子對母本進(jìn)行授粉并套袋,標(biāo)記具體的授粉時間和父母本。(3)異型花間授粉,每日上午8:00,分別選擇當(dāng)天開放長花柱和短花柱的花朵,未散粉前對母本去雄并套袋。父本花粉,選擇異型植株,未開花前進(jìn)行套袋,待開花7 d后收集用潔凈的刷子對母本進(jìn)行授粉并套袋,標(biāo)記具體的授粉時間和父母本。同株長花柱記作P,短花柱記作T,不同株長花柱記作P1,短花柱記作T1。每種處理做50個重復(fù),結(jié)實后在解剖鏡下統(tǒng)計飽滿種子數(shù)。

為了觀察6種授粉組合授粉后花粉的萌發(fā)、花粉管的生長和進(jìn)入子房的情況,于授粉后1 h,2 h, 4 h, 6 h,8 h,12 h,18 h,24 h,48 h,72 h取下各組合的雌蕊,裝入FAA溶液的離心管中處理24 h,放入70%的乙醇中進(jìn)行儲存?zhèn)溆?。取出雌?用蒸餾水沖洗3～4次,將長花柱、短花柱雌蕊分別放入盛有2 mol/L、4 mol/L的NaOH溶液的離心管中,分別軟化60 min,30 min后取出,用蒸餾水沖洗,放入0.1%水溶性苯胺藍(lán)溶液中進(jìn)行染色。采用常規(guī)制片法制片[22],用熒光顯微鏡觀察,測量花粉管長度和花柱長度,計算相對位置。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用 SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,用Duncan法比較不同處理間差異,采用Excel匯總數(shù)據(jù)和制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 花部形態(tài)特征觀測

通過觀察花部結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn),歐報春為典型的二型花柱植物。長花柱柱頭高于花藥,在花冠口處可見(圖1,A、B);短花柱柱頭低于花藥,雄蕊在花冠口處可見(圖1,C、D)。

A. 長花柱花部形態(tài);B.長花柱剖開圖;C.短花柱花部形態(tài);D.短花柱剖開圖

由表1可知,長花柱的花冠直徑為3.86 cm,短花柱為3.74 cm, 長花柱大于短花柱0.12 cm, 差異不顯著;長花柱的花冠筒長度為1.43 cm,短花柱為1.55 cm,長花柱小于短花柱0.12 cm,差異顯著;長花柱柱頭高度為1.28 cm,短花柱為0.79 cm,長花柱大于短花柱0.49 cm,差異極顯著;長花柱花藥高度為0.83 cm,短花柱為1.35 cm, 長花柱小于短花柱0.52 cm,差異極顯著;長花柱花筒中部直徑為0.37 cm,短花柱為0.36 cm, 長花柱大于短花柱0.01 cm,差異顯著。綜上所述,長花柱和短花柱的相同花部之間存在差異。

表1 長花柱和短花柱的花部形態(tài)特征

2.2 花粉、柱頭觀察

歐報春的長花柱和短花柱花粉粒較小,并都以單粒的形式存在,形狀均為超長球形,因而不易從外形上將2種花粉區(qū)別開;花粉赤道面觀均為近橢圓形(圖2,A、C);極面觀均為近圓形(圖2,B、D);外壁紋飾為網(wǎng)狀雕紋;網(wǎng)眼形狀為密網(wǎng)紋;具有萌發(fā)溝;長花柱的極軸長和赤道軸長分別為15.62,17.09 μm,短花柱相對應(yīng)各部分別為24.08,25.57 μm,長花柱均小于短花柱,呈極顯著差異(表1)。

A. 長花柱花粉, 標(biāo)尺=5 μm;B.長花柱花粉, 標(biāo)尺=10 μm;C.短花柱花粉, 標(biāo)尺=10 μm;D.短花柱花粉, 標(biāo)尺=10 μm;E.長花柱, 標(biāo)尺=500 μm;F.長花柱, 標(biāo)尺=200 μm;G. 短花柱, 標(biāo)尺=500 μm;H.短花柱,標(biāo)尺=200 μm。

長花柱的花柱直徑小于短花柱,呈極顯著差異(表1);歐報春柱頭表面未發(fā)現(xiàn)黏性物質(zhì),且分泌物較少,不易捕獲花粉(圖2,E、G);柱頭與花柱連接孔處較光滑,長花柱外壁為細(xì)微的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),短花柱為粗糙的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);柱頭表面均有乳突,長花柱柱頭的乳突細(xì)胞長度顯著大于短花柱(表1),因而容易固定短花柱所產(chǎn)生的較大花粉,短花柱柱頭的乳突較短(圖2,F、H),從而更容易固定長花柱花所產(chǎn)生的較小花粉。

2.3 花粉/胚珠比、花粉活力和柱頭可授性測定

歐報春長花柱單花花粉總量為18 425粒,短花柱為14 918粒,花粉數(shù)量差異不顯著(表2);長花柱胚珠數(shù)量為48.00,短花柱為44.08,胚珠數(shù)量差異不顯著;長花柱P/O比為384.20,短花柱為369.70,按Cruden的標(biāo)準(zhǔn),歐報春的繁育系統(tǒng)屬于兼性異交類型。

表2 花粉-胚珠比值

由表3可知,不同開花時期長花柱和短花柱的花粉活力存在一定差異,花粉活力隨時間的變化相似。歐報春長、短花柱的花粉活力開花后均逐漸升高,在第7天時達(dá)到最高,分別為73.06%和79.90%,然后再降低,第15天時花粉失去活力。不同開花時期長、短花柱的柱頭可授性也存在一定差異,總體呈先升后降的趨勢。開花第1天,長花柱已具備中等程度的可授性,而短花柱可授性低;開花第7～11天時,長、短花柱均具備高可授性;開花第15天,長、短花柱的可授性均由高降為低。綜上所述,長花柱和短花柱的花粉活力和柱頭可授性能在較長時間內(nèi)維持較高活力。

表3 歐報春花粉活力與柱頭可授性檢測結(jié)果

2.4 雜交指數(shù)估測和雜交親和性測定

根據(jù)Dafni 對雜交指數(shù)估算標(biāo)準(zhǔn)(表4),長花柱和短花柱的單花直徑都遠(yuǎn)大于6 mm,賦值為3;花藥開裂與柱頭具有可授性之間不同步,賦值為1; 長花柱的花藥與柱頭在空間上有隔離,不能接觸,賦值為1,雜交指數(shù)值為5; 短花柱的花藥與柱頭雖然在空間上有隔離,但柱頭位于花藥下方,所以花藥與柱頭可能會有接觸,賦值為0,雜交指數(shù)值為4,因此根據(jù)Dafni的標(biāo)準(zhǔn),歐報春的繁育系統(tǒng)類型可定為異交,部分自交親和,需要傳粉者。

表4 歐報春雜交指數(shù)估測

由表5可知,不同授粉組合均可結(jié)實,但結(jié)實數(shù)之間存在差異,具體表現(xiàn)為短花柱為母本的異型花間授粉>長花柱為母本的異型花間授粉>長花柱自花授粉和長花柱異株同型授粉>短花柱自花授粉和短花柱異株同型授粉>長花柱和短花柱的對照。綜上所述,異型花間授粉的結(jié)實數(shù)明顯高于自花授粉和異株同型授粉,短花柱為母本的異型花間授粉組合親和性優(yōu)于其他組合,由對照組可知,在無傳粉昆蟲的溫室中歐報春能少量結(jié)實。

表5 人工授粉結(jié)實數(shù)

花粉管觀察試驗結(jié)果表明,長花柱、短花柱異花授粉無論時間長短花粉管都順利到達(dá)子房,長花柱為母本的異型花花間授粉花粉管在72 h內(nèi)到達(dá)子房(圖3,A),短花柱為母本的異型花間授粉花粉管在48 h內(nèi)到達(dá)子房(圖4),并與胚珠結(jié)合(圖3,B),花粉管的生長速度最快;長花柱自花授粉中部分花粉管72 h可到達(dá)子房(圖3,C),長花柱異株同型授粉僅有少量花粉管到達(dá)花柱與子房的連接處;短花柱自花花粉異株和同型花粉萌發(fā)情況較差(圖3,D),但花粉萌發(fā)后的生長速度與異型花粉授粉無顯著差異。綜上所述,歐報春存在自交不親和,長花柱的自交不親和性低于短花柱。

B圖中箭頭所指位置為胚珠;D圖中箭頭所示為花粉萌發(fā)。

T×P.短花柱×長花柱;P×T.長花柱×短花柱;P×P.長花柱×同株長花柱;P1×P1.長花柱×不同株長花柱;T×T & T1×T1.短花柱×同株短花柱&短花柱×不同株短花柱。

3 討 論

二型花柱植物在形態(tài)上的差異除了雌雄蕊高度外還有花部特征的多樣性[23]。歐報春長花柱的花冠直徑和花筒中部直徑大于短花柱,這通常被認(rèn)為是一種機制,以補償花粉粒到達(dá)長花柱的偏差,迫使長花柱比短花柱吸引更多的傳粉者[24]。歐報春長花柱的花柱高度與短花柱的花藥高度相近,與買金梅對刺葉彩花(Acantholimonalatavicum)的研究結(jié)果[25]一致,究其原因,應(yīng)是避免雌雄蕊的相互干擾,同時促進(jìn)異型花間的授粉。研究發(fā)現(xiàn)歐報春長花柱的花粉和花柱形態(tài)與短花柱不同,長花柱柱頭的乳突較短花柱的長,容易固定短花柱產(chǎn)生的較大的花粉,短花柱柱頭的乳突較短,從而更容易固定長花柱花產(chǎn)生的較小的花粉,與馮建菊等人對新疆紫草(Arnebiaeuchroma)和盧婉佩對小報春(Primulaforbesii)的研究結(jié)果[26-27]一致?；ǚ坌螒B(tài)和柱頭乳突的差異葉會導(dǎo)致花粉粘附能力的不同,從而影響植物的繁殖特性,如對二型花柱植物白花丹(Plumbagozeylanica)的花粉外壁與柱頭角質(zhì)層形態(tài)研究發(fā)現(xiàn),其會影響物理接觸和化學(xué)過程[28]。此外,有研究表明不親和反應(yīng)與花粉和柱頭結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分有關(guān)[29]。

傳粉在對植物的繁育中有重要意義,花粉活力和柱頭可授性是影響傳粉成功的重要因素[30]。TTC染色法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等特點,聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性在報春中被廣泛應(yīng)用[31]。柱頭是接受花粉的部位,其活性影響花粉的附著、萌發(fā)和花粉管伸長。當(dāng)花粉活力與柱頭可授性都處于高活力時,是收集花粉的最佳時期,也是最佳的授粉時段,有利于植物順利進(jìn)行授粉受精過程。根據(jù)花粉/胚珠比、雜交指數(shù)估測結(jié)果來看,歐報春的繁育系統(tǒng)為異交和自交都有。雖有研究表明二型花柱植物往往遵循的嚴(yán)格自交不親和繁育系統(tǒng)[32-34],與本試驗結(jié)果不同。但也存在二型花柱的植物具有部分自交親和[23,35],如紫草科的一些品種通常具有自交親和性[36],四季報春(Primulaobconica)[31],翠南報春(Primulapatens)[37]也存在自交親和性。同一屬中花柱異型的植物的繁育特性可能也不同,與所處環(huán)境有關(guān),如在水仙屬中比利牛斯山黃水仙(Narcissusalbimarginatus)和密花兜被(N.calcicola),是自交不親和的, 而非洲之戀水仙(Narcissusrupicola)是自交親和的,是因為該物種是分布于地中海的高海拔地區(qū),環(huán)境惡劣, 傳粉昆蟲甚少, 在此環(huán)境下植物失去自交不親和系統(tǒng),來確保繁殖成功[38]。歐報春這種自交親和的繁育系統(tǒng)可能是與其生活史相適應(yīng)的[39],是對自身的一種生殖保障。

雜交授粉試驗表明長花柱的自交不親和性顯著低于短花柱,這與Massinga等人的研究結(jié)果,存在部分報春花屬植物的長花柱具有一定的自交親和性,而短花柱表現(xiàn)為嚴(yán)格的自交不親的一致[8],其原因還需進(jìn)一步探究。熒光顯微觀察表明,無論是自花花粉、異型花粉還是異花花粉均能在長花柱的柱頭上萌發(fā),只是異型花粉的萌發(fā)速度快于其他類型,而短花柱為母本的植株無論自交還是同型異株授粉更多的表現(xiàn)為自交不親和,花粉無法在柱頭上萌發(fā),與邵劍文等人對安徽羽葉報春的研究結(jié)果[40]一致。這是因為長花柱依靠控制花粉管的生長對花粉進(jìn)行選擇和識別,短花柱于花粉在柱頭表面萌發(fā)的階段對花粉進(jìn)行識別。Tremayne對報春花屬植物研究發(fā)現(xiàn)自交阻礙發(fā)生在花柱中的類型比自交阻礙發(fā)生在柱頭表面的類型更容易產(chǎn)生種子[41],本試驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了這一結(jié)論。