張方方，邢銀英，張碧宇，張亮，周建峰

（1.溫州市質(zhì)量技術(shù)檢測科學研究院，浙江 溫州，325000; 2.溫州市食品藥品檢驗科學研究院，浙江 溫州，325000）

0 引 言

盲樣考核是驗證實驗室檢測能力，確保日常檢測結(jié)果的準確性和可比性必須運行的一項重要質(zhì)量控制活動[1-2]，是中國計量認證和中國合格評定國家認可委員會認證評審的重要內(nèi)容，也是監(jiān)管機構(gòu)綜合評價實驗室檢測能力的重要手段[3-6]。乳粉是最常見的乳制品之一，目前乳粉中黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1)的常用檢測方法主要依據(jù)為GB 5009.24-2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素M 族的測定》中的第一法“同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法”。

為了最大限度地控制Aflatoxin M1的攝入量，我國及世界上其他許多國家制定了乳及乳制品中Aflatoxin M1的限量標準[7-9]。GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[10]規(guī)定，乳及乳制品中Aflatoxin M1限量為0.5 μg/kg。通過此次考核，可以進一步加強承檢機構(gòu)監(jiān)督管理，提升食品抽檢工作質(zhì)量水平，促進實驗室提高Aflatoxin M1的檢測水平和質(zhì)量，保障乳品質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1290/6470 LC-MS/MS 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（配ESI 源)，美國安捷倫公司；賽默飛世爾LP Vprtex Mixer 渦旋振蕩器，美國賽默飛世爾公司；SIGMA 3K15 冷凍離心機(轉(zhuǎn)速≥10 000 r/min），美國Sigma 公司；氮吹儀，上海安譜科技有限公司；Research Plus 微量移液器，德國艾本德公司；Millipore 超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore 公司；針式濾器(孔徑為0.22 μm）有機相微孔濾膜，上海安譜科技有限公司。

1.1.2 試劑與耗材

黃曲霉毒素M1(AFT M1)標準溶液(10 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素M1(13C17-AFT M1)標準溶液(0.5 μg/mL）、甲醇(色譜純），上海安譜科技有限公司；黃曲霉毒素M1免疫親和柱(AflaStar IAC1005），ROMER 國際貿(mào)易有限公司；考核盲樣(LH-B01)，由浙江省局食品抽檢監(jiān)測秘書處；實驗用水由Millipore 超純水處理系統(tǒng)制備。

1.2 方法

1.2.1 實驗前處理

稱取1 g 樣品(精確到0.001 g) 于50 mL 離心管中，加入13C17- Aflatoxin M1內(nèi)標溶液振蕩混勻后靜置30 min，加入4 mL 50 ℃熱水，渦旋混勻。待樣液冷卻至20 ℃后，加入10 mL 甲醇，渦旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min 下離心10 min。將7 mL 上清液或濾液轉(zhuǎn)移至燒杯中，加40 mL 水稀釋，備用。將低溫下保存的AflaStar IAC1005 黃曲霉毒素M1免疫親和柱恢復至室溫后，將上述混合液體倒入。用10 mL 去離子水緩沖液淋洗免疫親和柱，去離子水淋洗完后將柱體壓干。用2×1.0 mL 純甲醇洗脫免疫親和柱，收集洗脫液，將洗脫液于50 ℃條件下氮氣吹至近干，用初始流動相定容至1.0 mL，渦旋30 s 溶解殘留物，0.22 μm濾器過濾，收集濾液于進樣瓶中待測。

圖1 黃曲霉毒素M1 免疫親和柱操作示意

1.2.2 色譜條件

色譜柱型號：Zorbax Eclipse Plus C18 (2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，美國安捷倫公司；液相流速：0.2 mL/min；柱溫箱溫度：35 ℃；進樣體積為1 μL；流動相A：甲醇；流動相B：水(含0.1%甲酸和5 mmoL/L 乙酸銨)；梯度洗脫比例為：0~0.1 min，10%A~10%A；0.1~2.0 min,10%A~40%A；2.0~4.0 min，40%A~70%A；4.0~4.1 min，70%A~ 90%A；4.1~6.0 min，90%。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：ESI 電離源，正離子模式，離子源溫度350 ℃，質(zhì)譜毛細管電壓4 500 V，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速：11 L/min；霧化器壓力：310.26 ka；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，監(jiān)測參數(shù)如表1 所示。

表1 黃曲霉毒素M1 和13C17-黃曲霉毒素M1 質(zhì)譜參數(shù)

1.2.4 標準溶液的配制

準確吸取10 μg/mL AFT M1標準溶液100 μL 于10 mL 容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，得到100 ng/mL的AFT M1標準工作液。取AFT M1同位素內(nèi)標(0.5 μg/mL)250 μL，用乙腈稀釋至25 mL，得到5.0 ng/mL 的13C17-AFTM1標準液。

標準系列工作溶液：分別準確吸取AFT M1標準工作液20、40、60、80、100 μL 至10 mL 容量瓶中，加入500 μL 5.0 ng/mL 的同位素內(nèi)標工作液，用初始流動相定容至刻度，配制AFT M1的濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ng/mL 的系列標準溶液。

1.2.5 質(zhì)量控制措施

根據(jù)《乳粉中黃曲霉毒素M1的測定作業(yè)指導書》的內(nèi)容說明，此次提供的能力驗證樣品為乳粉樣品，凈重約10 g。為確保數(shù)據(jù)準確，根據(jù)檢測標準GB 5009.24—2016，制定以下質(zhì)量控制措施：測試樣品的含量水平、空白樣品加標回收、人員平行比對（因為此次盲樣考核的時間原因，實驗室未能及時配備乳粉黃曲霉毒素M1的質(zhì)控樣進行質(zhì)量控制）。（1）測試樣品的含量水平。由于作業(yè)指導書沒有明確樣品含量水平，所以實驗先初步測試樣品含量水平，再根據(jù)該水平配制合適的系列標準曲線。（2）空白樣品加標。在確定樣品含量水平后，在后續(xù)實驗進行同等水平的樣品濃度添加回收平行實驗，測定并計算加標回收水平。（3）人員平行比對。實驗中以2 名檢測經(jīng)驗較為豐富的檢測員同時開展盲樣考核實驗進行比對，以此考核人員的檢測能力[11-14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線范圍確定

根據(jù)檢測標準GB 5009.24—2016，對盲樣(LHB01) 進行測試，盲樣中AFT M1含量在0.6 μg/kg 水平，對應(yīng)的待測液濃度為0.3 ng/mL。為確保能夠準確有效校正待測物，本實驗配制了0.2 ~1.0 ng/mL 的系列標準溶液，線性方程為：y=1.606907x-0.038098，R2=0.9996，標準物質(zhì)TIC MRM 圖和系列標準曲線圖，如圖2 和圖3 所示。

圖2 黃曲霉毒素M1 MRM

圖3 黃曲霉毒素M1 系列標準曲線

2.2 盲樣考核結(jié)果

分別稱取平行盲樣(LH-B01)，按照GB 5009.24—2016 以及黃曲霉毒素M1免疫親和柱要求開展實驗，并同時進行空白實驗和空白加標回收平行實驗，測定結(jié)果如表2 所示。由測定數(shù)據(jù)分析得出，測定結(jié)果精密度和RSD 均小于10%，兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值為1.1%，符合要求。由于I 組與II 組相比較，實驗結(jié)果精密度前者為0.16%< 3.04%，且RSD 為0.9%<5.2%，平均回收率良好。依據(jù)質(zhì)控數(shù)據(jù)分析，I組的數(shù)據(jù)可靠性較好，按照作業(yè)指導書保留3 位有效數(shù)字要求，本實驗室選取I 組的數(shù)據(jù)“黃曲霉毒素M1含量為0.618 μg/kg”，作為此次盲樣考核的最終結(jié)果上報。

表2 樣品測定結(jié)果

2.3 實驗室結(jié)果分析

本次盲樣考核要求參加實驗室為25 家，黃曲霉毒素M1考核項目的實際參加實驗室為21 家，本實驗室黃曲霉毒素M1的考核Z 值為“-0.9”，結(jié)果滿意，其他實驗室結(jié)果如表3 所示。本次盲樣考核評價以組織方確認的樣品指定值和能力評定標準差，對參加實驗室的測試結(jié)果進行判定，判定結(jié)果分為通過和不通過 (包括不滿意和可疑)。評判的參數(shù)為實驗室間Z值，Z 值大小體現(xiàn)了實驗室結(jié)果與中位值的偏離程度，Z 值“＋”、“－”表明結(jié)果偏離方向，|Z|≤2.0 為滿意，2.0＜|Z|＜3.0 為可疑結(jié)果，|Z|≥3.0 為不滿意(離群)結(jié)果[15]。

表3 實驗室間黃曲霉毒素M1 考核評價結(jié)果

3 結(jié) 論

從實驗室結(jié)果統(tǒng)計看出，參加黃曲霉毒素M1考核的實驗室測定結(jié)果均為滿意，但是分析結(jié)果均存在負偏離。此次實驗的前處理包括試劑提取、過柱凈化、濃縮步驟，產(chǎn)生測量值呈負偏離的因素可能在于13C17-AFT M1作為待測物內(nèi)標為實驗前臨時添加，而AFT M1在乳品中可能為穩(wěn)定結(jié)合存在，兩者在提取率上存在一定差別，測定時應(yīng)盡可能提取充分；由于黃曲霉毒素M1免疫親和柱的特殊性，盡量按照其說明進行活化、吸附和洗脫，減少待測物的流失或者洗脫不充分因素；在濃縮定容時，盡量按要求保持恒溫進行氮吹，避免待測物因溫度等原因影響回收結(jié)果。

實驗室在此次盲樣考核中取得了滿意結(jié)果，實驗室中的人員檢測能力、設(shè)備性能和涉及的耗材試劑有效性也均得到了確認，這不僅是對實驗室日常檢測工作經(jīng)驗開展的一次總結(jié)，也是對實驗室自身檢測水平的提升。為今后自身的檢測工作和其他盲樣考核、能力驗證工作提供了參照，也為其他食品實驗室的同行檢測人員提供盲樣考核和能力驗證的方案提供了借鑒。