陳梅玲，袁文，張譜華，王靜，閔凡貴，趙維波，陳梅麗

?

實(shí)驗(yàn)室病原菌檢測(cè)能力的自我評(píng)估

陳梅玲，袁文，張譜華，王靜，閔凡貴，趙維波，陳梅麗

（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所/廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510663）

摘要：目的通過國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)（ICLAS）提供的盲樣對(duì)本實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)能力進(jìn)行自我評(píng)估。方法將ICLAS提供的7個(gè)盲樣接種到血平板培養(yǎng)并純化，依次通過革蘭染色、氧化酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)選擇相應(yīng)的梅里埃生化條上機(jī)進(jìn)行鑒定。對(duì)于上述方法無法確認(rèn)的樣品則采用PCR和基因測(cè)序的方法進(jìn)一步鑒別。結(jié)果對(duì)7個(gè)盲樣進(jìn)行分析后，最終確認(rèn)1號(hào)為金黃色葡萄球菌，2號(hào)為銅綠假單胞菌，3號(hào)為肺炎鏈球菌，4號(hào)為欣氏鮑特菌，5號(hào)為粘質(zhì)沙雷菌，6號(hào)為牛棒狀桿菌，7號(hào)為嗜肺巴斯德桿菌，檢測(cè)結(jié)果與ICLAS提供結(jié)果一致。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)室病原菌檢測(cè)質(zhì)量可靠，實(shí)驗(yàn)人員的檢測(cè)水平合格。

關(guān)鍵詞：國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)；病原菌；盲樣

實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證，是指利用實(shí)驗(yàn)室間指定檢測(cè)數(shù)據(jù)的比對(duì)，確定實(shí)驗(yàn)室從事特定測(cè)試活動(dòng)的技術(shù)能力，是國際通行的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法和認(rèn)可機(jī)構(gòu)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室能力的有效技術(shù)手段［1-2］，對(duì)提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平以及社會(huì)聲譽(yù)有重要意義［3-4］，也是對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的綜合鍛煉與提高。

2007年國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)（the international council for laboratory animal science，ICLAS）建立了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物診斷實(shí)驗(yàn)室績(jī)效評(píng)估項(xiàng)目（PEP），旨在對(duì)動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力進(jìn)行監(jiān)督和自我評(píng)估。該項(xiàng)目向全球的動(dòng)物診斷實(shí)驗(yàn)室開放，每年定期向參與實(shí)驗(yàn)室發(fā)送盲樣，參與實(shí)驗(yàn)室通過提交檢測(cè)結(jié)果并與ICLAS結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證自身的檢測(cè)能力。此外對(duì)于出現(xiàn)問題的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，項(xiàng)目組織者

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-30 11：02 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1102.006.html可以提供相關(guān)的建議和幫助［5］。本單位作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的監(jiān)督檢測(cè)單位，肩負(fù)廣東省乃至華南區(qū)其他部分省份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的檢測(cè)工作，檢測(cè)能力的評(píng)估意義重大。為驗(yàn)證病原菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，本單位在已參加2012年ICLAS-PEP能力驗(yàn)證的基礎(chǔ)上參加了2014年ICLAS-PEP病原檢測(cè)項(xiàng)目，此次實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了樣品培養(yǎng)未能生長(zhǎng)、鑒定結(jié)果的細(xì)菌不在ICLAS-PEP菌種目錄里，現(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果和比對(duì)情況進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 ICLAS提供的7個(gè)盲樣，分別為小鼠肺勻漿（1號(hào)）、水樣（2號(hào)）、大鼠鼻腔內(nèi)容物（3號(hào)）、小鼠鼻氣管內(nèi)容物（4號(hào)）、小鼠盲腸內(nèi)容物（5號(hào)）、小鼠皮拭子（6號(hào)）、大鼠呼吸道內(nèi)容物（7號(hào)）。1.1.2 試劑 血平板（廣州市迪景微生物科技有限公司）；半固體動(dòng)力生化管（北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司）；生化管、桿菌肽紙片和奧卜托新紙片（杭州天和微生物試劑有限公司）；氧化酶試劑和生化鑒定條API STAPH、ID 32E、API 20 Strep、API 20NE、API CORYNE（Biomerieux公司）；RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）；PrimeScript?RT reagent Kit （Takara公司）。

1.1.3 儀器 SPX-288生化培養(yǎng)箱（江南儀器廠）；1300生物安全柜（Thermo公司）；ATB微生物鑒定儀器（Biomerieux公司）；Tprofessional梯度PCR儀（Biometra公司）；Powerpac Basic 164-5050電泳儀（Bio-Rad公司），Gel DocTM XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 參考標(biāo)準(zhǔn) 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)檢測(cè)方法（2）》（GB14926）及第2版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》。

1.2.2 培養(yǎng) 分別從樣品保存管中吸取菌液10～20 μL劃線接種到血平板上，置于生化培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24～48 h后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.3 涂片染色鏡檢 挑取單個(gè)菌落涂片，革蘭染色鏡檢。

1.2.4 氧化酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn) 挑取染色鏡檢為革蘭陰性桿狀的菌落做氧化酶試驗(yàn)；取染色鏡檢為革蘭陽性球狀和革蘭陽性鏈球狀的菌落做觸酶試驗(yàn)。

1.2.5 生化反應(yīng) 挑取純培養(yǎng)物制備一定濃度的菌懸液，無菌操作將菌懸液注入試條的生化反應(yīng)杯中，于29℃或36℃培養(yǎng)24 h后讀取結(jié)果。

1.2.6 嗜肺巴斯德桿菌的PCR方法 挑取樣品，提取RNA，按設(shè)置條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，具體如下：94℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃再次延伸10 min，120 V，25 min凝膠電泳。嗜肺巴斯德桿菌引物序列為：Forward：5′-AATTACAGCTCACTATTCGYCGTCA-3′；Reverse：5′-CCCAATGCAGTAATYAAYGTMCCCA-3′；擴(kuò)增片段大小為1 039 bp。

1.2.7 基因測(cè)序方法 挑取樣品，采用擴(kuò)增細(xì)菌16 S rRNA的通用引物（引物序列為：Forward：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，Reverse：5′-AAG GAGGTGATCCAGCCGCA-3′，擴(kuò)增片段大小為1 540 bp）進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體條件如下：94℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸2 min；最后72℃再次延伸10 min，120 V，25 min凝膠電泳。對(duì)目的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，使用DNASTAR軟件和NCBI中BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，1～6號(hào)盲樣均可在血平板上正常生長(zhǎng)，而7號(hào)盲樣在血平板上未形成任何菌落，同時(shí)后續(xù)使用營養(yǎng)肉湯搖床培養(yǎng)，均未見生長(zhǎng)。

2.2 鏡檢

鏡檢發(fā)現(xiàn)1、3和6號(hào)盲樣為G+菌，2、4和5號(hào)盲樣為G-桿菌，7號(hào)為G-小桿菌。結(jié)果見表1。

表1 革蘭染色鏡檢特征和判定結(jié)果Table 1 Characteristics and results of Gram staining by microscopy

2.3 氧化酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)

根據(jù)鏡檢結(jié)果，對(duì)1和3號(hào)盲樣培養(yǎng)物進(jìn)行觸酶試驗(yàn)，2、4和5號(hào)盲樣培養(yǎng)物進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，并進(jìn)行了初步判斷，結(jié)果見表2。

2.4 生化鑒定

通過生化條對(duì)1～6號(hào)盲樣進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表3。其中，1、2、4、5和6號(hào)盲樣的生化條鑒定結(jié)果的鑒定百分?jǐn)?shù)（%ID）都在96以上，可信度高，綜合鏡檢結(jié)果可以初步確認(rèn)為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鳥博特菌、粘質(zhì)沙雷菌和牛棒狀桿菌。3號(hào)盲樣生化條鑒定結(jié)果無效。

表2 氧化酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of oxidase and catalase tests

表3 生化條鑒定結(jié)果Table 3 Results of biochemical identification

2.5 3號(hào)盲樣的鑒定

3號(hào)盲樣鏡檢和觸酶試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)初步判定為鏈球菌，但生化條鑒定結(jié)果無效。將培養(yǎng)物接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，染色鏡檢為雙球菌。樣品在血平板上培養(yǎng)48 h，菌落中央可凹陷致邊緣隆起而呈臍窩狀，疑似肺炎鏈球菌，進(jìn)行鑒別生化試驗(yàn)。結(jié)果顯示，膽汁溶菌試驗(yàn)陽性、奧卜托新（Optochin）敏感試驗(yàn)陽性，膽汁七葉苷陰性，因此確定3號(hào)盲樣為肺炎鏈球菌。

2.6 4號(hào)盲樣的鑒定

4號(hào)盲樣經(jīng)梅里埃生化條鑒定結(jié)果為鳥博特菌，%ID為96.6，評(píng)價(jià)良好。但是鑒于該菌為稀有菌株，相關(guān)生化反應(yīng)（如觸酶陽性、氧化酶陽性、硝酸鹽還原陰性、尿素陰性、動(dòng)力陰性）與欣氏鮑特菌一致，尚需要進(jìn)一步區(qū)分。為此，項(xiàng)目組開展了相關(guān)的生化試驗(yàn)，結(jié)果見表4。通過生化反應(yīng)仍無法確定4號(hào)盲樣的最終結(jié)果。由于現(xiàn)有的生化反應(yīng)不能區(qū)分兩種菌，項(xiàng)目組對(duì)此結(jié)果不能完全可信。查找相關(guān)文獻(xiàn)，重新進(jìn)行相關(guān)生化反應(yīng)，并進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增特異片段進(jìn)行基因測(cè)序，使用DNASTAR軟件和NCBI中BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)樣品與欣氏鮑特菌3224的核苷酸同源性為100%，因此，確定4號(hào)盲樣為欣氏鮑特菌。

表4 4號(hào)盲樣生化管鑒定結(jié)果Table 4 Results of biochemical identification of sample 4

2.7 7號(hào)盲樣的鑒定

7號(hào)盲樣在分離培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)菌已經(jīng)死亡，無法使用常規(guī)的方法進(jìn)行鑒定。將該盲樣進(jìn)行革蘭染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)為G-小桿菌，依據(jù)檢測(cè)人員工作經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見病原檢測(cè)情況，疑似嗜肺巴斯德桿菌，進(jìn)而采用PCR方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖1）顯示，7號(hào)盲樣擴(kuò)增片段與陽性嗜肺巴斯德桿菌預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果1 039 bp特異性條帶相符，確認(rèn)7號(hào)盲樣為嗜肺巴斯德桿菌。

1和2為陰性對(duì)照；3和4為陽性嗜肺巴斯德桿菌；5和6為7號(hào)盲樣。圖1 7號(hào)盲樣PCR鑒定結(jié)果Figure 1 PCR results of sample 7

2.8 與ICLAS結(jié)果比對(duì)

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，1號(hào)為金黃色葡萄球菌，2號(hào)為銅綠假單胞菌，3號(hào)為肺炎鏈球菌，4號(hào)為欣氏鮑特菌，5號(hào)為粘質(zhì)沙雷菌，6號(hào)為牛棒狀桿菌，7號(hào)為嗜肺巴斯德桿菌，檢測(cè)結(jié)果與ICLAS提供結(jié)果完全一致。

3 討論

通過本次能力驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在微生物菌株的鑒定過程中，不可一味相信生化反應(yīng)條，特別是對(duì)于同種屬的菌。生化條反應(yīng)的局限性在于對(duì)多個(gè)生化反應(yīng)出現(xiàn)相同結(jié)果的不同菌株無法進(jìn)行區(qū)分，這就導(dǎo)致如果單純依賴生化條進(jìn)行菌株的鑒定不夠科學(xué)。此外，有些菌株可能依靠傳統(tǒng)的檢測(cè)方法難以鑒定，需借助一些其他的輔助手段，如PCR和基因測(cè)序等。PCR方法由于其快速、靈敏的特點(diǎn)，可為傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)提供強(qiáng)有力的補(bǔ)充。

通過本次ICLAS-PEP項(xiàng)目，可以綜合判斷本單位微生物病原菌檢測(cè)結(jié)果是可靠的，實(shí)驗(yàn)人員的檢測(cè)水平和檢測(cè)能力是合格的。此外，通過此次能力驗(yàn)證也提高了本單位微生物檢驗(yàn)人員的分析能力。

參考文獻(xiàn)：

［1］黃薇，黎明，黃劍屏，等.成都市疾控系統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)探討及結(jié)果分析［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38（11）：2132-2134.

［2］中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì).能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南：CNAS—GL02［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014：5-6.

［3］陸娟.一次實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（14）：2700-2702.

［4］中國實(shí)驗(yàn)室國家認(rèn)可委員會(huì).利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的能力驗(yàn)證：GB/T 15483.1—1999［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1999：25.

［5］紀(jì)靜.一次微生物實(shí)驗(yàn)室室間比對(duì)的報(bào)告和體會(huì)［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，29（3）：275-276.

（責(zé)任編輯：幸建華）

中圖分類號(hào)：R372

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-8783（2016）03-0370-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041204

收稿日期：2016-04-12

基金項(xiàng)目：廣東省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A070705003）

作者簡(jiǎn)介：陳梅玲（1985—），女，研究實(shí)習(xí)員，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病原微生物檢測(cè)工作，Email：362265636@qq.com；通信作者：趙維波（1976—），男，副研究員，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)相關(guān)研究工作，Email：183775444@qq.com；陳梅麗（1971—），女，獸醫(yī)師，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化管理，Email：1071138433@qq.com。

Self-assessment of microbiological monitoring capacity in laboratory

CHEN Meiling，YUAN Wen，ZHANG Puhua，WANG Jin，MIN Fangui，ZHAO Weibo，CHEN Meili
（Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute，Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals，Guangzhou 510663，China）

AbstractObjective To test samples supplied by ICLAS for self-assessment of microbiological monitoring capacity in our laboratory.Methods Seven blind samples provided by ICLAS were cultured and purified in blood plates.The samples were tested by Gram staining oxidase test catalase test and the biochemical identification system.PCR and gene sequencing were used to identify the samples that did not be confirmed by the above methods.Results Samples from 1 to 7 were identified as Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Streptococcus pneumoniae Cushing′s thibaut bacteria Serratia marcescens Corynebacterium bovis and Pasteurella pneumotropica respectively.These results were in agreement with those notified by ICLAS.

Conclusion The microbiological monitoring results in this laboratory are reliable and the monitoring level of the laboratory personnel is qualified.

Key wordsICLAS pathogen blind sample