花青素協(xié)同酶水解法對翅果油粕蛋白功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的影響

王江濤，趙曉瑜，郭彩霞

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

翅果油樹（Elaeaguns molisDiels）是我國稀有物種，屬胡禿子科胡禿子屬，主要分布于山西和陜西等地[1-2]。翅果油種仁富含油脂、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)32%～36%[3]，翅果油種仁蛋白含有17 種氨基酸，其中人類必需氨基酸7種，對人體有益的谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸的含量較高，具有很好的保健作用和開發(fā)潛能[4]。然而，翅果油粕蛋白在中性條件下的溶解性較差[5]，這極大地限制其開發(fā)和應(yīng)用，因此改善翅果油粕蛋白的功能性質(zhì)十分必要。

目前，蛋白改性常用的方法有物理法、化學(xué)法、酶解法等，其中酶解法通過蛋白酶催化肽鍵斷裂，使大分子蛋白變?yōu)樾》肿佣嚯?，從而提高其體內(nèi)消化吸收率并且改善植物蛋白功能性質(zhì)[6-7]。此外，多酚結(jié)合法改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)。多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，通過相互作用改變蛋白結(jié)構(gòu)從而提高功能性質(zhì)和生理活性，拓寬蛋白質(zhì)的應(yīng)用范圍。多酚與蛋白質(zhì)之間相互作用會(huì)受到溫度、pH、多酚類型和蛋白類型等因素的影響，其中pH 決定多酚與蛋白質(zhì)間相互作用類型[8]，多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用可以分為共價(jià)作用和非共價(jià)作用。在堿性條件下，多酚易被氧化成醌，醌類物質(zhì)會(huì)和蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生不可逆的共價(jià)結(jié)合，而多酚與蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)作用是通過疏水相互作用和氫鍵等相對較弱的作用力發(fā)生可逆結(jié)合[9]。

花青素（Anthocyanin）是一種天然的水溶性植物色素，屬于黃酮類化合物[10]，作為天然的抗氧化劑，花青素對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷具有一定的保護(hù)作用[11]，現(xiàn)有研究表明花青素與蛋白質(zhì)結(jié)合可有效地提高蛋白溶液的功能性質(zhì)[12-13]。然而，目前花青素結(jié)合法均是對大分子蛋白進(jìn)行改性，對于花青素結(jié)合法與酶解法協(xié)同作用于蛋白，提高其功能性質(zhì)的研究不足。本文通過花青素與酶水解法協(xié)同作用對翅果油粕蛋白進(jìn)行改性，探究了花青素結(jié)合法和酶水解法協(xié)同對翅果油粕蛋白功能性質(zhì)及抗氧化活性的影響，并利用熒光光譜和紫外光譜探究花青素對翅果油粕蛋白及其酶解產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，為拓寬翅果油粕蛋白在食品行業(yè)中的應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

翅果油粕 山西琪爾康翅果生物制品有限公司；花青素（純度為95%）天津尖峰天然研究產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、十二烷基苯磺酸鈉（SDS）、甘氨酸、谷胱甘肽（GSH）北京索萊寶科技有限公司；四甲基乙二胺（TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（TRIS）、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、過硫酸銨 上海麥克林生化科技有限公司；1-苯胺基-8-萘基磺酸鹽（ANS）上海賢鼎生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）美國Sigma 公司；實(shí)驗(yàn)室所用試劑 均為國產(chǎn)分析純。

STARTER2100 pH 計(jì) 奧豪斯儀器有限公司；SC-3614 型低速離心機(jī)、KDC-140HR 型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HH-S 型水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；DYCZ-24DN 型雙垂直電泳槽 北京六一儀器廠；LS-55 型熒光分光光度計(jì) 珀金埃爾默儀器有限公司；UV-2550 型紫外-可見光譜儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 翅果油粕蛋白粉的制備 將翅果油粕與蒸餾水以料液比1:75 混合，用0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH為11，于55 ℃水浴55 min 提取蛋白。冷卻至室溫后，于4000 r/min 離心15 min，收集上清液備用。上清液用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 為4.5 進(jìn)行酸沉蛋白，30 min 后結(jié)束酸沉，于4000 r/min 離心15 min，收集蛋白進(jìn)行真空冷凍干燥得到純度為84.03%的翅果油粕蛋白。

1.2.2 翅果油粕酶解蛋白的制備 配制底物濃度為4%的翅果油粕蛋白溶液，選用堿性蛋白酶，在酶添加量為10000 U/g、酶解pH11、酶解溫度50 ℃的條件下，酶解50 min，將酶解液冷凍干燥，制得水解度為10%的蛋白酶解物。

1.2.3 花青素-翅果油粕蛋白復(fù)合物的制備 根據(jù)李揚(yáng)等[8]的方法制備復(fù)合物。具體步驟為：將樣品粉末用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.4）配制成1%的蛋白樣液，向樣液中加入0.05%花青素，充分混合后調(diào)節(jié)溶液pH 分別為3、5、7，室溫?cái)嚢? h，得到花青素與蛋白非共價(jià)結(jié)合復(fù)合物。同樣地，將溶液pH調(diào)整到9、11，室溫?cái)嚢?4 h，得到花青素與蛋白共價(jià)結(jié)合復(fù)合物。測定復(fù)合物溶液清除DPPH 自由基清除能力，選取清除DPPH 自由基能力最強(qiáng)的pH 作為制備具有較強(qiáng)抗氧化能力花青素-蛋白復(fù)合物的最適pH。

1%蛋白溶液中分別加入0.025%、0.05%、0.1%花青素，充分混合后調(diào)節(jié)混合溶液pH 至花青素結(jié)合蛋白的最適pH，室溫?cái)嚢? h，即得到不同質(zhì)量比的花青素-翅果油粕蛋白復(fù)合物（A-P）和花青素-酶解蛋白復(fù)合物（A-EP）。其中，P 代表翅果油粕蛋白，0.025%、0.05%、0.1%花青素與翅果油粕蛋白形成的復(fù)合物用0.025% A-P、0.05% A-P、0.1% A-P 表示；EP 代表酶解蛋白，0.025%、0.05%、0.1%花青素與酶解蛋白形成的復(fù)合物用0.025% A-EP、0.05% A-EP、0.1% AEP 表示。

1.2.4 溶解性測定 根據(jù)Lowry 等[14]的方法測定翅果油粕蛋白、酶解蛋白及1.2.3 中制備的不同質(zhì)量比的花青素-蛋白復(fù)合物的溶解性。將樣品配制成濃度為0.25 mg/mL 的蛋白溶液，分別調(diào)整pH 到3、7，室溫?cái)嚢?0 min，于4000 r/min 離心10 min，收集上清液。取0.2 mL 上清液與1 mL 堿性銅溶液混合，室溫放置10 min。加入0.1 mL 酚試劑迅速搖勻，繼續(xù)放置30 min。以蒸餾水為空白對照，于750 nm 處測定吸光度值。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.0034x+0.1183，R2=0.999），上清液吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量，并按照公式計(jì)算溶解性。

式中：m：樣品中蛋白質(zhì)含量，mg；m1：上清液中蛋白質(zhì)含量，mg。

1.2.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定 根據(jù)Sze-Tao 等[15]的方法測定翅果油粕蛋白、酶解蛋白及1.2.3 中制備的不同質(zhì)量比的花青素-蛋白復(fù)合物的起泡性能。取100 mL 蛋白濃度為1 g/mL 樣品溶液，分別調(diào)整溶液pH 到3、7，將溶液于10000 r/min 的高速分散器中分散2 min，記錄泡沫的體積。室溫靜置30 min后再次記錄泡沫體積。按照公式計(jì)算起泡性和起泡穩(wěn)定性。

式中：V0：樣品溶液的起始體積，mL；V1：分散后0 min 泡沫體積，mL；V2：靜置30 min 后泡沫體積，mL。

1.2.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定 根據(jù)Kevin 等[16]的方法測定翅果油粕蛋白、酶解蛋白及1.2.3 中制備的不同質(zhì)量比的花青素-蛋白復(fù)合物的乳化性能。取100 mL 蛋白濃度為1 g/mL 樣品溶液，分別調(diào)整溶液pH 到3、7，并按3：1 體積比與大豆油混合，混合后于10000 r/min 的高速勻漿機(jī)中均質(zhì)2 min。從溶液底部吸取100 μL 乳狀液，用0.1%的SDS 溶液稀釋至5 mL。乳狀液靜置放置10 min，重復(fù)上述步驟。以0.1% SDS 溶液為空白，測定500 nm 處吸光度值。按照公式計(jì)算樣品的乳化性及乳化穩(wěn)定性。

式中：A0：乳狀液0 min 時(shí)的吸光度；? A：乳狀液在0 和10 min 吸光度之差；?t：吸取乳狀液的間隔時(shí)間，10 min。

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除能力測定 根據(jù)楊虎等[17]的方法測定樣品DPPH 自由基清除能力。吸取2 mL 1 mg/mL 樣液與2 mL DPPH 標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，為樣品組；2 mL 樣品液和2 mL 無水乙醇混合，為對照組；2 mL 無水乙醇和2 mL DPPH 標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，為空白組，3 組反應(yīng)液室溫下避光反應(yīng)20 min，于517 nm處測定吸光度，按照公式計(jì)算DPPH 自由基清除率，結(jié)果以每克樣品所具有的清除能力相當(dāng)于多少毫克GSH 計(jì)，單位為mg/g。

式中：A1：樣品組吸光度；A2：對照組吸光度；A3：空白組吸光度。

1.2.7.2 ABTS+自由基清除能力測定 根據(jù)鄒容等[18]的方法測定樣品的ABTS+自由基清除能力。將配制好的ABTS 儲(chǔ)備液在室溫下避光反應(yīng)12～16 h，用無水乙醇稀釋，使其在734 nm 處吸光度為0.7±0.02，得ABTS 工作液。取0.1 mL 1 mg/mL 樣液與3.9 mL工作液混合，室溫避光反應(yīng)10 min 于734 nm 處測定吸光度。同時(shí)，用蒸餾水代替樣品做同樣處理作為空白對照。按照公式計(jì)算樣品的ABTS+自由基清除率，結(jié)果以每克樣品所具有的清除能力相當(dāng)于多少毫克GSH 計(jì)，單位為mg/g。

式中：A0：空白對照組吸光度；A1：樣品組吸光度。

1.2.7.3 總還原力測定 根據(jù)秦丹丹[19]的方法測定樣品總還原力。取1 mL 1 mg/mL 樣液與2 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.6）、2 mL 1%鐵氰化鉀溶液混勻，50 ℃水浴20 min，快速冷卻后加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后4000 r/min 離心10 min。吸取2 mL 上清液和2 mL 蒸餾水、0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液混合，室溫反應(yīng)10 min。以蒸餾水作為空白，在700 nm 處測吸光度值。結(jié)果以每克樣品所具有的清除能力相當(dāng)于多少毫克GSH 計(jì)，單位為mg/g。

1.2.8 SDS-PAGE 凝膠電泳測定 根據(jù)Laemmli[20]的方法測定樣品分子量，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：根據(jù)表1 制備12%分離膠和5%濃縮膠。將分離膠和濃縮膠先后灌入制膠器，待凝固后，將膠體放置于裝有電極緩沖液的電泳槽中，浸泡10 min 左右，小心拔出梳子。吸取1 mL 樣品溶液分別與1 mL 未含β-巰基乙醇和含有β-巰基乙醇的樣品緩沖液混合，沸水浴5 min，于12000 r/min 離心2 min，取20 μL 上樣。保持電壓80 V 持續(xù)電泳，直到樣品距離底部0.5～1 cm 處停止電泳。電泳結(jié)束后，小心取出分離膠于考馬斯亮藍(lán)（G-250）染液中。染色結(jié)束后，將分離膠轉(zhuǎn)移至脫色缸，使用提前配制的甲醇-冰乙酸脫色液脫色，直到凝膠上蛋白分子量條帶清晰可見。

表1 分離膠和濃縮膠的制備Table 1 Preparation of the separating gel and stracking gel

1.2.9 本征熒光光譜和紫外吸收光譜測定 根據(jù)Xiong 等[21]的方法測定樣品本征熒光光譜。將未加花青素的蛋白溶液和復(fù)合物溶液均稀釋至蛋白濃度為0.5 mg/mL，固定激發(fā)波長為280 nm，狹縫寬度為5 nm，連續(xù)掃描記錄300～500 nm 范圍內(nèi)的發(fā)射光譜，即為復(fù)合物的本征熒光光譜。

將未加花青素的蛋白溶液和復(fù)合物溶液稀釋均至蛋白濃度為1 mg/mL，在200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，得紫外吸收光譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有的數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 18.0 進(jìn)行ANOVA 差異顯著性分析及相關(guān)性分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異性顯著。處理完畢后用Origin 8.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合物制備pH 條件確定

由表2 可知，pH 在3～11 范圍內(nèi)變化時(shí)，隨著pH 的升高，翅果油粕蛋白對DPPH 自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，酶解蛋白清除DPPH 的能力呈先增強(qiáng)后降低的趨勢，且在pH7 時(shí)最大，GSH 當(dāng)量值為30.05 mg/g，遠(yuǎn)高于相同pH 條件下的翅果油粕蛋白。酶解蛋白的抗氧化能力強(qiáng)，這是由于小分子肽獲得氫離子的可用性強(qiáng)[22]。即與天然蛋白相比，小分子量的酶解蛋白終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)能力更強(qiáng)。加入花青素修飾蛋白結(jié)構(gòu)后，形成的花青素-蛋白結(jié)合復(fù)合物的DPPH 自由基清除能力均有所提高，其中花青素-翅果油粕蛋白復(fù)合物在pH7 制備條件下的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，GSH 當(dāng)量值為43.46 mg/g；花青素-酶解蛋白復(fù)合物在pH3 制備條件下的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，GSH 當(dāng)量值為142.17 mg/g。為進(jìn)一步考察花青素添加量對花青素-翅果油粕蛋白復(fù)合物和花青素-酶解蛋白復(fù)合物的抗氧化能力、功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的影響，分別選取花青素-翅果油粕蛋白復(fù)合物和花青素-酶解蛋白復(fù)合物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)的pH 制備條件，即pH7 和pH3，作為下一步試驗(yàn)的結(jié)合pH 條件。

表2 不同pH 條件下花青素與蛋白和酶解產(chǎn)物復(fù)合物DPPH 自由基清除能力Table 2 DPPH radicial scavenging ability of complexes with protein and hydrolysate under different pH conditions

2.2 復(fù)合物溶液溶解性測定

在pH3 和pH7 條件下復(fù)合物的溶解性如圖1所示，由于酶解蛋白較翅果油粕蛋白溶解度更強(qiáng)，花青素-酶解蛋白復(fù)合物較花青素-翅果油粕蛋白復(fù)合物也具有更好的溶解性。隨著花青素質(zhì)量濃度的而增大，兩種復(fù)合物的溶解性均有一定程度的降低。Prigent 等[23]研究也有相同結(jié)果，添加原花青素后，蛋白質(zhì)溶解度降低，其原因是帶電荷的多酚類物質(zhì)的附著可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的電性，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性的降低。

圖1 pH3（A）和 pH7（B）條件下的復(fù)合物溶解度Fig.1 Solubility of complex at pH3 (A) and pH7 (B)

2.3 復(fù)合物的起泡性及起泡穩(wěn)定性

泡沫是分散在氣液界面連續(xù)相中的亞穩(wěn)態(tài)體系，受到蛋白質(zhì)溶解度，表面性質(zhì)和結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響[24]?；ㄇ嗨?蛋白復(fù)合物的起泡性能如圖2 所示，在pH3 和pH7 條件下，復(fù)合物比未添加花青素的蛋白具有更好的起泡性。pH7，花青素質(zhì)量濃度0.1%的條件下，花青素-酶解蛋白復(fù)合物的起泡性和起泡穩(wěn)定性達(dá)到最大值，分別為157.54%和93.60%。起泡性和起泡穩(wěn)定性的改善可能是由于多酚與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后固有黏度提高，導(dǎo)致排水速度降低，起泡穩(wěn)定性增強(qiáng)[25]。多酚與蛋白相互作用導(dǎo)致界面膜結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而增強(qiáng)了起泡性能[26]。

圖2 pH3（A,C）和pH7（B,D）條件下的復(fù)合物起泡性和起泡穩(wěn)定性Fig.2 Foaming property and foaming stability of complex at pH3 (A,C) and pH7 (B,D)

2.4 復(fù)合物的乳化性及乳化穩(wěn)定性

如圖3 所示，在pH3 制備條件下，復(fù)合物的乳化性高于未加花青素的蛋白，而對于酶解蛋白，復(fù)合花青素對于乳化性并未有明顯的影響。在pH7 制備條件下，復(fù)合物的乳化性能高于未加花青素的蛋白。在pH7 制備條件下，花青素質(zhì)量濃度0.1%的條件下，花青素-酶解蛋白復(fù)合物的乳化性和乳化性能穩(wěn)定性較好，分別提高至156.60%和81.48%。復(fù)合物乳化性能的提升，可能是由于多酚羥基與蛋白質(zhì)殘基結(jié)合，改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，導(dǎo)致更多的疏水基團(tuán)暴露，結(jié)合油滴的能力增強(qiáng)，從而增強(qiáng)了乳化性能[25]。綜上所述，花青素結(jié)合法與酶水解法的協(xié)同作用能有效地提高復(fù)合物的功能性質(zhì)。

圖3 pH3（A，C）和pH7（B，D）條件下的復(fù)合物乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.3 Emulsibility and emulsion stability of complex at pH3(A,C) and pH7 (B,D)

2.5 復(fù)合物的體外抗氧化能力

花青素對翅果油粕蛋白及酶解蛋白抗氧化能力的影響如表3 所示，花青素-蛋白復(fù)合物的抗氧化能力優(yōu)于天然翅果油粕蛋白及其酶解蛋白，隨著花青素質(zhì)量濃度增大，復(fù)合物抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。Almajano等[27]研究報(bào)道稱當(dāng)多酚與蛋白質(zhì)相結(jié)合時(shí)，與苯環(huán)相連的自由羥基可發(fā)揮抗氧化能力。同時(shí)多酚與蛋白質(zhì)形成更穩(wěn)定的反應(yīng)產(chǎn)物清除自由基。此外，花青素-翅果油粕蛋白復(fù)合物在pH7 條件的抗氧化能力較強(qiáng)，結(jié)合溶解度推測，這是由于較pH3 的制備條件而言pH7 條件下蛋白及復(fù)合物的溶解度更大。而在pH3 條件下制備的花青素-酶解蛋白復(fù)合物具有更強(qiáng)的抗氧化能力，這可能由于在酸性條件下，花青素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。Li 等[28]對不同pH 條件下大米蛋白與花青素結(jié)合的研究結(jié)果相同，在pH3 條件下，大米蛋白與花青素結(jié)合后具有最強(qiáng)的抗氧化能力，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)表明pH3 條件下大米蛋白具有更強(qiáng)的柔韌性和未折疊的結(jié)構(gòu)，更容易與DPPH 和ABTS+自由基反應(yīng)。綜上所述，通過酶解和花青素結(jié)合協(xié)同作用，在pH3 條件下，向酶解翅果油粕蛋白中添加0.1%質(zhì)量濃度的花青素制備花青素-酶解蛋白復(fù)合物可顯著的提高翅果油粕蛋白的抗氧化性能。

表3 pH3 和pH7 復(fù)合物的抗氧化能力（mg GSH·g-1）Table 3 Antioxidant capacity of complex at pH3 and pH7 (mg GSH·g-1)

2.6 復(fù)合物的SDS-PAGE 凝膠電泳測定結(jié)果

圖4 所示為利用SDS-PAGE 研究與花青素結(jié)合后蛋白亞基的變化，復(fù)合物電泳結(jié)果圖。在非還原和還原條件下，花青素-翅果油粕蛋白復(fù)合物在31.0～66.2 kDa 的條帶強(qiáng)度較翅果油粕蛋白均有所增強(qiáng)，而22.0～14.0 kDa 之間的條帶強(qiáng)度有所下降，且復(fù)合物均為出現(xiàn)新的蛋白條帶；花青素-酶解蛋白復(fù)合物的條帶強(qiáng)度較酶解蛋白也有所增強(qiáng)。這與Sui 等[24]研究結(jié)果相同，蛋白與多酚通過非共價(jià)作用結(jié)合，未發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，沒有形成股具體配合物，未改變蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，推測花青素通過疏水相互作用、氫鍵等非共價(jià)作用力，附著在蛋白質(zhì)的多酚結(jié)合位點(diǎn)上，進(jìn)一步證明了復(fù)合物的形成是由非共價(jià)作用驅(qū)動(dòng)的。

圖4 pH3（A，B）和pH7（C，D）條件下的復(fù)合物的電泳譜圖Fig.4 SDS-PAGE profiles of complex at pH3 (A,B) and pH7 (C,D)

2.7 復(fù)合物的本征熒光光譜測定結(jié)果

蛋白質(zhì)的固有熒光是由于色氨酸和酪氨酸殘基在280 nm 的激發(fā)波長下發(fā)射熒光產(chǎn)生的，蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變、亞基的結(jié)合和變性會(huì)引起發(fā)射光譜的變化[29]，因此熒光光譜可用于研究花青素-蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)的變化[10]。在不同pH 條件下，添加不同質(zhì)量濃度花青素的翅果油粕蛋白及其酶解蛋白的內(nèi)源熒光光譜如圖5 所示，隨著花青素質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，表明青素與蛋白質(zhì)之間存在相互作用，促使蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變，熒光強(qiáng)度減弱[30]。Li 等[28]的研究呈現(xiàn)相同的結(jié)果，通過猝滅機(jī)理研究表明，花青素與蛋白之間通過疏水相互作用和氫鍵結(jié)合，導(dǎo)致熒光靜態(tài)猝滅。此外，隨著花青素質(zhì)量濃度的增大，兩種花青素-復(fù)合物的最大發(fā)射波長均發(fā)生了藍(lán)移，表明色氨酸與酪氨酸周圍的微環(huán)境極性減小，疏水性增強(qiáng)，從而引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化[31]。結(jié)合紫外光譜分析，花青素與蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改善了蛋白的功能性質(zhì)。

圖5 pH3（A，B）和pH7（C，D）條件下的復(fù)合物內(nèi)源熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of the complex at pH3 (A,B) and pH7 (C,D)

2.8 復(fù)合物紫外吸收光譜測定結(jié)果

花青素與翅果油粕蛋白及其酶解蛋白復(fù)合物的紫外吸收光譜圖如圖6 所示，兩種花青素-蛋白復(fù)合物溶液在275 nm 附近有明顯的吸收峰，隨著花青素質(zhì)量濃度增大，復(fù)合物溶液紫外吸收帶的強(qiáng)度增強(qiáng)，表明疏水氨基酸與花青素的芳香基團(tuán)之間可能存在疏水相互作用[28]。此外，根據(jù)275 nm 處的吸收峰是由于蛋白質(zhì)分子中的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)π-π*躍遷引起的[29]，這可能是由于花青素與蛋白質(zhì)中的色氨酸殘基結(jié)合，形成新的共軛體系，增加了ππ*躍遷所需能量，導(dǎo)致復(fù)合物的紫外吸收增強(qiáng)。紫外吸收光譜結(jié)果表明，花青素與翅果油粕蛋白及酶解蛋白之間通過相互作用形成了復(fù)合物，這與熒光光譜分析結(jié)果一致。

圖6 pH3（A，B）和pH7（C，D）件下的復(fù)合物的紫外全波長掃描Fig.6 UV of the complex at pH3 (A,B) and pH7 (C,D)

3 結(jié)論

本文研究了花青素結(jié)合對翅果油粕蛋白及其酶解蛋白功能性質(zhì)、結(jié)構(gòu)性質(zhì)和抗氧化活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，花青素結(jié)合法可有效的改善翅果油粕蛋白及其酶解蛋白的乳化性能，起泡性能和抗氧化能力。這可能是由于花青素與蛋白存在氫鍵和疏水作用等非共價(jià)作用，形成了復(fù)合物，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，提高了蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。隨添加花青素質(zhì)量濃度的增大，復(fù)合物的乳化性，乳化穩(wěn)定性，起泡性，起泡穩(wěn)定性和抗氧化能力不斷增強(qiáng)。且花青素-酶解蛋白復(fù)合物的功能性質(zhì)和抗氧化能力強(qiáng)于花青素-翅果油粕蛋白復(fù)合物，遠(yuǎn)高于翅果油粕蛋白。以上結(jié)論表明，花青素結(jié)合法和酶水解協(xié)同作用能夠進(jìn)一步改善翅果油粕蛋白的功能性質(zhì)和抗氧化能力，為翅果油粕蛋白的高效利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。