富煒濤，柯迪，李丹 ，侯廷軍

（1.江蘇威凱爾醫(yī)藥科技有限公司創(chuàng)新藥研發(fā)中心，江蘇 南京 211800；2.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.浙江大學(xué)金華研究院，浙江 金華 321000）

雄激素受體（androgen receptor，AR）及其配體雄激素在男性第二性征、肌肉和骨骼等發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用[1-2]。異常的AR 信號(hào)與多種疾病密切相關(guān)，如前列腺癌、雄激素不敏感綜合征（androgen insensitivity syndrome，AIS）、脊髓延髓肌萎縮癥等[3-5]。其中，前列腺癌位列男性腫瘤發(fā)病率第2 名，且是男性致死率第5 名的惡性腫瘤[6]。在我國(guó)，前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)[7]。作為威脅人類生命健康的重大疾病，前列腺癌的新型治療策略是各大制藥公司和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)研究的熱點(diǎn)。其中，AR 信號(hào)通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，靶向AR 的小分子藥物開(kāi)發(fā)已獲得了巨大的成功，并且已有多款上市藥物在全球范圍內(nèi)使用，包括第1 代的羥基氟他胺（1）、尼魯米特（2）和R-比卡魯胺（3），以及第2 代的恩雜魯胺（4）、阿帕魯胺（5）和達(dá)洛魯胺（6）（見(jiàn)圖1）[3]。

圖1 第1 代和第2 代靶向雄激素受體上市藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structures of the first and second generations of approved androgen receptor antagonists

AR 屬于核受體家族，由920 個(gè)氨基酸殘基組成，分為3 個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：N-端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）、DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain，DBD）和配體結(jié)合域（ligand-binding domain，LBD）。AR 信號(hào)通路中，AR 在非活性狀態(tài)下與熱休克蛋白結(jié)合，而當(dāng)有雄激素與AR 結(jié)合時(shí)，AR 會(huì)從熱休克蛋白解離，并募集共激活劑，以AR 二聚體在核內(nèi)與雄激素響應(yīng)元件相結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序，發(fā)揮生物學(xué)功能[3]。

AR 的DBD 和LBD 的6 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)有多種新型小分子拮抗劑通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（computer aided drug design，CADD）相關(guān)技術(shù)被發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖2），這些位點(diǎn)包括AR-DBD 結(jié)合區(qū)域P-Box 和D-Box 附近的2 個(gè)位點(diǎn)，AR-LBD 的配體結(jié)合口袋（ligand-binding pocket，LBP，已上市小分子藥物的結(jié)合位點(diǎn)）、激活功能區(qū)2（activation function 2，AF2）、結(jié)合功能區(qū)3（binding function 3，BF3）和二聚體界面結(jié)合口袋（dimer interface pocket，DIP）[3]。

圖2 雄激素受體的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合域已發(fā)現(xiàn)小分子拮抗劑的6 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Figure 2 The 6 binding pockets discovered for the binding of small-molecule antagonists located at AR-DBD and AR-LBD

無(wú)論是第1 代還是第2 代上市藥物，在用藥一段時(shí)間后，AR基因的擴(kuò)增、藥物分子結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基點(diǎn)突變、剪接變異體的出現(xiàn)等，導(dǎo)致這些AR 靶向藥物發(fā)生不同程度的耐藥，甚至從拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榧?dòng)劑，極大限制了臨床治療效益[8]。為了提供新的治療策略，多種多樣的技術(shù)應(yīng)用于靶向不同新位點(diǎn)的新型拮抗劑的開(kāi)發(fā)[9-10]。其中，CADD技術(shù)在雄激素受體-配體動(dòng)態(tài)機(jī)制的探討，特別是在耐藥機(jī)制方面的研究，以及新型拮抗劑的發(fā)現(xiàn)和新位點(diǎn)探索上展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。綜述CADD 技術(shù)在AR 相關(guān)的機(jī)制探討和新位點(diǎn)新活性拮抗劑發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用，為后續(xù)CADD 技術(shù)在AR 藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用以及更多核受體中的應(yīng)用提供重要參考。

1 常用的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)

1.1 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和構(gòu)建

當(dāng)靶標(biāo)受體的結(jié)構(gòu)是未知且僅有序列信息的情況下，通過(guò)同源建模和人工智能（artificial intelligence，AI）預(yù)測(cè)是目前常用的有效方法。同源建模是以實(shí)驗(yàn)獲得的同源受體三維結(jié)構(gòu)信息為模板，構(gòu)建目標(biāo)序列三維結(jié)構(gòu)的方法[11]。AI 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)是通過(guò)AI 技術(shù)對(duì)已經(jīng)解析的受體三維結(jié)構(gòu)和序列之間的關(guān)系進(jìn)行訓(xùn)練推理，用于預(yù)測(cè)未解析的三維結(jié)構(gòu)。AI 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)達(dá)到原子水平的準(zhǔn)確度，代表性的技術(shù)如AlphaFold，RoseTTAFold，ColabFold，Uni-Fold 等[12-15]。

1.2 分子對(duì)接

分子對(duì)接是依據(jù)結(jié)構(gòu)形狀匹配和能量匹配，預(yù)測(cè)受體和配體之間結(jié)合模式的一種技術(shù)。在個(gè)人電腦上，分子對(duì)接即可快速預(yù)測(cè)受體分子和配體分子之間的結(jié)合模式。配體可以是化學(xué)小分子、多肽、蛋白、DNA 和RNA。在蛋白-小分子預(yù)測(cè)方面，經(jīng)典的基于搜索的對(duì)接方法有AutoDock，Vina，Glide 等，以及新型的基于擴(kuò)散生成模型DiffDock 等[16-17]。

1.3 基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選

基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選是指在有合適受體晶體結(jié)構(gòu)或者構(gòu)建的合理模型結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)，將化合物庫(kù)（含數(shù)萬(wàn)到數(shù)億）的分子一一對(duì)接到受體，并按照打分函數(shù)進(jìn)行打分排序，優(yōu)選排序靠前、結(jié)構(gòu)新穎的化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這一技術(shù)能夠快速篩選大規(guī)模的化合物庫(kù)，優(yōu)選合適的潛在活性化合物，在效率和成本上相比基于實(shí)驗(yàn)的高通量篩選具有明顯的優(yōu)勢(shì)[17-18]。

1.4 基于配體的虛擬篩選

基于配體的虛擬篩選依據(jù)作用于特定靶標(biāo)的已知活性分子構(gòu)建合適的活性預(yù)測(cè)模型，以篩選出結(jié)構(gòu)多樣且具有生物活性的分子。隨著AI 技術(shù)的不斷發(fā)展，多種多樣活性預(yù)測(cè)模型和分子生成等技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，基于配體的虛擬篩選在定量構(gòu)效關(guān)系分析、藥效團(tuán)模型構(gòu)建等傳統(tǒng)模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用范圍得到了極大拓展[19-21]。

1.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬

基于同源建?；蛘逜lphaFold 等AI 技術(shù)構(gòu)建的結(jié)構(gòu)或者晶體結(jié)構(gòu)通常是靜態(tài)結(jié)構(gòu)，難以反映研究對(duì)象的動(dòng)態(tài)過(guò)程，而分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬是研究這樣動(dòng)態(tài)過(guò)程的重要技術(shù)。MD 模擬基于分子力場(chǎng)，通過(guò)在模擬過(guò)程中不斷求解牛頓運(yùn)動(dòng)方程，以模擬研究對(duì)象的動(dòng)態(tài)過(guò)程。對(duì)動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究，能夠更清晰地了解研究對(duì)象的動(dòng)態(tài)機(jī)制，如受體氨基酸殘基點(diǎn)突變對(duì)配體結(jié)合的耐藥機(jī)制、受體-配體結(jié)合解離的機(jī)制等[22]。此外，MD 模擬還能輔助結(jié)構(gòu)相對(duì)單一的受體晶體結(jié)構(gòu)或者構(gòu)建的模型結(jié)構(gòu)獲得多樣性的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 結(jié)合自由能預(yù)測(cè)

考察受體與配體結(jié)合強(qiáng)度的關(guān)鍵表征指標(biāo)即兩者的結(jié)合自由能。結(jié)合自由能常用的方法有打分函數(shù)（傳統(tǒng)的和新型基于機(jī)器學(xué)習(xí)的打分函數(shù)）、基于過(guò)程的能量計(jì)算（傘形采樣、拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬等）和兩點(diǎn)式自由能計(jì)算[分子力學(xué)/廣義波恩表面積（molecular mechanics/generalized Born surface area，MM/GBSA）、分子力學(xué)/泊松-波爾茲曼表面積（molecular mechanics/Poisson Boltzmann surface area，MM/PBSA）、煉金術(shù)自由能（熱力學(xué)積分、自由能微擾）][23-26]。不同的自由能預(yù)測(cè)方法有不同的適用范圍，如打分函數(shù)預(yù)測(cè)速度快，常用于大規(guī)模虛擬篩選；煉金術(shù)自由能由于計(jì)算速度慢且對(duì)計(jì)算分子間結(jié)構(gòu)的相似性要求高，同時(shí)精度較高，因此，常用于苗頭分子的理性設(shè)計(jì)；而能夠較好平衡計(jì)算精度和效率的MM/GBSA 和MM/PBSA方法在基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選重打分和基于結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)中被廣泛應(yīng)用[27]。

2 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)在雄激素受體靶標(biāo)機(jī)制探索方面的應(yīng)用

由于AR-LBD 的晶體結(jié)構(gòu)解析相對(duì)完整以及AR-LBD 的重要作用，CADD 技術(shù)在基于AR 靶標(biāo)機(jī)制的研究方面主要是圍繞AR-LBD 展開(kāi)。ARLBD 二聚體由2 個(gè)同源AR-LBD 組成，每個(gè)單體具有3層折疊結(jié)構(gòu)，包括由螺旋H1和H3形成的第1層，由螺旋H4，H5，H8 和H9 形成的中間層，以及由螺旋H6，H7，H10-11 和H12 形成的第3 層（見(jiàn)圖3A）。

圖3 AR-LBD 二聚體結(jié)構(gòu)以及雄激素不敏感綜合征相關(guān)點(diǎn)突變位置Figure 3 The structure of AR-LBD dimer and the location of androgen insensitivity syndrome-related mutation

2.1 雄激素不敏感綜合征機(jī)制的研究

AIS 屬于罕見(jiàn)的46XY 性發(fā)育異常疾病，主要表現(xiàn)為染色體46XY，但表現(xiàn)女性的第二性征。依據(jù)AIS不同的嚴(yán)重程度，分為輕型、部分型和完全型。AR作為關(guān)鍵基因，其無(wú)義突變、錯(cuò)義突變、剪接變異體、基因缺失、基因插入與AIS 密切相關(guān)[28]。僅在AR-LBD，就存在40 余個(gè)與AIS 相關(guān)的點(diǎn)突變[29]。作為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的重要補(bǔ)充，MD 模擬在機(jī)制闡明方面發(fā)揮了重要作用，有助于探究這些突變?nèi)绾斡绊慉R 的結(jié)構(gòu)或者雄激素的結(jié)合。

Arg774 突變?yōu)镃ys774（R774C）是導(dǎo)致AIS 的重要點(diǎn)突變，而該突變并不在AR 的LBP 位點(diǎn)，即不在雄激素結(jié)合位點(diǎn)，而R774C 如何影響AR 的功能，尚無(wú)法解釋（見(jiàn)圖3B）。為此，Wu 等[30]設(shè)置不同的模擬溫度，通過(guò)MD 模擬檢測(cè)AR-LBD 野生型（AR-LBDWT）和R774C（AR-LBDR774C）的構(gòu)象變化。結(jié)果顯示：1）AR-LBDR774C導(dǎo)致局部結(jié)構(gòu)紊亂，從而影響AR-LBD LBP 口袋形狀；2）AR-LBDR774C改變AR-LBD 動(dòng)態(tài)性質(zhì)，進(jìn)而誘導(dǎo)更多的AR-LBD LBP 構(gòu)象分布；3）蛋白的構(gòu)象通過(guò)降低溫度能夠逆轉(zhuǎn)，這與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是吻合的。

AR-LBD 二聚體界面間的氨基酸殘基突變，是導(dǎo)致AIS 的重要原因之一，而機(jī)制尚不清楚。Fu 等[31]構(gòu)建了2 個(gè)代表性的AIS 相關(guān)突變AR-LBDW751R和AR-LBDF754V，以及AR-LBDWT的二聚體的MD 模擬，結(jié)果顯示AR-LBDW751R和AR-LBDF754V二聚體在模擬中非常容易被分離，AR-LBDWT則在模擬過(guò)程中始終保持穩(wěn)定。隨后的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證支持了模擬結(jié)果，即AR-LBDWT能保持二聚體，AR-LBDW751R和ARLBDF754V則以單體形式存在。即AR-LBD 二聚體界面間的突變導(dǎo)致AR 無(wú)法二聚化，因此雄激素?zé)o法發(fā)揮正常功能。

2.2 市售小分子藥物耐藥機(jī)制的研究

市售的AR 拮抗劑，在用藥一段時(shí)間后，都會(huì)發(fā)生不同程度的耐藥，甚至部分藥物會(huì)從拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榧?dòng)劑。其中，AR 的點(diǎn)突變是最具代表性的耐藥機(jī)制[3,8]。然而，點(diǎn)突變?nèi)绾斡绊懯荏w結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致藥物耐藥，這一現(xiàn)象難以從單一的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象解釋，計(jì)算機(jī)模擬則給出了重要的補(bǔ)充解釋。

R-比卡魯胺（3）和化合物7 結(jié)構(gòu)高度相似（見(jiàn)圖1 和圖4）。有趣的是，R-比卡魯胺在ARLBDWT情況下顯示具有拮抗活性，在AR-LBD 點(diǎn)突變Trp741 突變?yōu)長(zhǎng)eu741（AR-LBDW741L）情況下，則表現(xiàn)為激動(dòng)活性，類似物7 則無(wú)論是否發(fā)生ARLBDW741L突變，均表現(xiàn)為激動(dòng)活性。Bisson 等[32]對(duì)化合物3 和7 分別在AR-LBDWT和AR-LBDW741L突變體中進(jìn)行MD 模擬以探討機(jī)制。結(jié)果顯示，ARLBDW741L中H3，H5，H11 和H12 的氨基酸殘基表現(xiàn)更為穩(wěn)定，而在AR-LBDWT中，R-比卡魯胺通過(guò)降低氨基酸殘基Met895 和Trp741 的穩(wěn)定性而達(dá)到拮抗效果。即Trp741 通過(guò)穩(wěn)定AR 構(gòu)象在激活狀態(tài)導(dǎo)致耐藥。Osguthorpe 等和Liu 等隨后在對(duì)R-比卡魯胺和類似物7 的模擬研究中也得到了類似的結(jié)論，即AR-LBDW741L影響H12 的構(gòu)象是拮抗劑和激動(dòng)劑變化的關(guān)鍵點(diǎn)[33-34]。除了AR-LBDW741L，Liu等[35]對(duì)多種耐藥突變W741C，W741L，W741C_T877A，T877A，F(xiàn)876L，F(xiàn)876L_T877A 和L701H的模擬研究顯示，這些耐藥突變的共同點(diǎn)是會(huì)誘導(dǎo)Met895 對(duì)R-比卡魯胺結(jié)合的能量貢獻(xiàn)增加，進(jìn)而穩(wěn)定H12 的構(gòu)象以形成有利于共激活劑結(jié)合的AF2 位點(diǎn)。

圖4 化合物7～11 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式以及化合物3，7，10 與AR-LBD 的結(jié)合模式Figure 4 Structures of compounds 7-11 and the binding modes of compounds 3，7 and 10 with AR-LBD

突變影響AR-LBD H12 構(gòu)象作為拮抗劑和激動(dòng)劑轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵點(diǎn)，除了在化合物3 和7 中被觀察到，在其他拮抗劑中同樣有類似的現(xiàn)象。如羥基氟他胺（1，見(jiàn)圖1）在AR-LBD 的Thr877 突變?yōu)锳la877（AR-LBDT877A）時(shí)，會(huì)由拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榧?dòng)劑。Bisson 等和Liu 等的常規(guī)MD 模擬、Zhou 等的副本交換MD 模擬同樣顯示，AR-LBDT877A突變導(dǎo)致AR-LBD H12 的構(gòu)象外移，進(jìn)而影響AF2 位點(diǎn)的構(gòu)象，是誘導(dǎo)化合物1 轉(zhuǎn)變?yōu)榧?dòng)劑的關(guān)鍵[32,36-37]。

第2 代拮抗劑面臨類似問(wèn)題，如AR-LBD 的Phe876 突變?yōu)長(zhǎng)eu876（AR-LBDF876L）。由于第2 代拮抗劑與AR-LBD的結(jié)合模式類似于第1代拮抗劑，兩者的藥物轉(zhuǎn)變機(jī)制也類似。如Balbas 等和Liu 等的MD 模擬顯示，AR-LBDF876L導(dǎo)致恩雜魯胺（4）的耐藥與AR-LBD H12 構(gòu)象的變化密切相關(guān)[38-39]。Gim 等[40]對(duì)雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT，天然激動(dòng)劑）、RU59063（AR 激動(dòng)劑）以及AR 拮抗劑3～ 5 的加速M(fèi)D 模擬，也進(jìn)一步驗(yàn)證了ARLBD H12 的動(dòng)態(tài)波動(dòng)是拮抗劑和激動(dòng)劑互相轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。

前述研究在對(duì)AR-LBD單體和拮抗劑的模擬中，共同得到了AR-LBD H12 是拮抗態(tài)和激動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變的核心結(jié)構(gòu)這一啟示。而隨著AR-LBD 的二聚體晶體結(jié)構(gòu)被解析，基于AR-LBD 二聚體的模擬成為可能，Cavaliere 等[41]提出了不一樣的耐藥機(jī)制。他們構(gòu)建了AR-LBD 二聚體與化合物3 的構(gòu)象，即每個(gè)單體都結(jié)合化合物3，2 個(gè)單體形成二聚體。MD 模擬研究結(jié)果顯示，化合物3 結(jié)合到AR-LBD 的2 個(gè)單體中會(huì)導(dǎo)致同源二聚體解離，抑制AR 轉(zhuǎn)錄因子活性而發(fā)揮拮抗活性；但當(dāng)AR-LBDW741L突變發(fā)生，同源二聚體則具有類似激動(dòng)劑的行為，即2 個(gè)單體緊密結(jié)合，這一現(xiàn)象為AR-LBDW741L的耐藥機(jī)制提供了可能的新的解釋。

2.3 微小的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致截然不同的拮抗/激動(dòng)活性的機(jī)制研究

在AR 的藥物設(shè)計(jì)，特別是AR-LBD LBP 的藥物設(shè)計(jì)中，微小的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異便會(huì)導(dǎo)致截然不同的拮抗和激動(dòng)活性。為了闡明這一現(xiàn)象的機(jī)制，Nagata 等[42]對(duì)DHT 和4 個(gè)結(jié)構(gòu)相近（四氫喹啉，8～ 11，見(jiàn)圖4A），但性質(zhì)極為不同的ARLBD LBP 配體進(jìn)行MD 模擬。其中，化合物8 為弱AR 結(jié)合，化合物9 和10 對(duì)AR 具有高活性激動(dòng)效應(yīng)，化合物11 則是高效拮抗劑。特別是相較于化合物8，化合物9 增加了羥基從而極大增強(qiáng)了激動(dòng)活性。硝基轉(zhuǎn)變?yōu)榍杌鶗r(shí)（化合物9 轉(zhuǎn)變到化合物11），結(jié)構(gòu)相近的分子從激動(dòng)劑轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓箘?。模擬結(jié)果顯示，化合物10 的羥基和AR-LBD H3 的Asn705 形成氫鍵相互作用，而形成的氫鍵進(jìn)一步穩(wěn)定Asp890，進(jìn)而穩(wěn)定H12 的構(gòu)象（見(jiàn)圖4C）。拮抗劑11 則是影響H12 的穩(wěn)定性，達(dá)到拮抗效應(yīng)。

2.4 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)在環(huán)境污染物機(jī)制預(yù)測(cè)中的應(yīng)用

工業(yè)污染、燃燒產(chǎn)物或農(nóng)藥釋放所產(chǎn)生的持久性有機(jī)污染物（persistent organic pollutants，POPs）在環(huán)境中持久存在。POPs 的持續(xù)暴露與各種生殖障礙密切相關(guān)，如精液質(zhì)量下降、睪丸癌和性別比例失衡等[43-44]。其中，二氯二苯基二氯乙烯（dichlorodiphenyldichloroethylene，p，p'-DDE，12）和多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）是被最廣泛研究的POPs?；衔?2 和13（CB-153）是AR拮抗劑（見(jiàn)圖5），然而，其拮抗機(jī)制尚未得到合理解釋。Xu 等[45]采用分子對(duì)接、MD 模擬以及基于MM/GBSA 的結(jié)合自由能預(yù)測(cè)研究了化合物12和13 與AR-LBD 的結(jié)合模式和拮抗機(jī)制。作者對(duì)幾個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了分析，總結(jié)出3 個(gè)潛在位點(diǎn)，包括AR-LBD 的LBP，AF2 以及N 端的裂口。

圖5 化合物12～ 17 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 5 Structures of compounds 12 -17

溴系阻燃劑如多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是家用和工業(yè)產(chǎn)品中常用的添加劑，由于這些添加劑長(zhǎng)期暴露問(wèn)題，其代謝產(chǎn)物的毒性問(wèn)題備受關(guān)注[46]。PBDEs 最常見(jiàn)的代謝產(chǎn)物14 [（羥基-PBDEs（HO-PBDEs）和甲氧基-PBDEs（MeO-PBDEs），見(jiàn)圖5]，可在人類血液、海洋生物和野生動(dòng)物中等被檢測(cè)到[46-48]。研究顯示HO-PBDEs和MeO-PBDEs 能夠抑制AR 活性，然而其抑制機(jī)制尚不清楚[49-50]。Wang 等[50]通過(guò)細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、分子對(duì)接和MD 模擬相結(jié)合研究了多種HO-PBDEs和MeO-PBDEs 抑制AR 活性的機(jī)制。結(jié)果顯示，ARLBD H12 構(gòu)象的變化是PBDEs 代謝產(chǎn)物具有拮抗活性的重要指標(biāo)，為評(píng)估PBDEs代謝產(chǎn)物提供了預(yù)測(cè)模型。

化合物15（二苯甲酮-1，benzophenone-1，BP-1，見(jiàn)圖5）是常用的紫外線過(guò)濾材料之一，廣泛應(yīng)用于化妝品和防曬霜等個(gè)人護(hù)理品中。BP-1 殘留物在多種水體如泳池水中被頻繁檢出，對(duì)內(nèi)分泌有一定影響但作用機(jī)制尚不明確。為此，Zhan 等[51]研究了BP-1 在泳池中的氯化過(guò)程，并通過(guò)高斯加速M(fèi)D 模擬評(píng)估了BP-1 氯化產(chǎn)物對(duì)AR-LBD 的影響。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BP-1 在泳池中的氯化產(chǎn)物16（一氯代BP-1）和17（二氯代BP-1）（見(jiàn)圖5）對(duì)AR具有抑制作用；MD 模擬顯示兩者通過(guò)疏水和非極性相互作用與AR 穩(wěn)定結(jié)合，表現(xiàn)出強(qiáng)于化合物15的拮抗活性。研究結(jié)果提示個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品會(huì)阻斷AR 信號(hào)通路，進(jìn)而具有潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。

2.5 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)在共激活劑機(jī)制闡明中的應(yīng)用

共激活劑與AR-LBD 的結(jié)合是AR 調(diào)控男性發(fā)育過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)，不同組織中不同的共激活劑與AR-LBD 的結(jié)合導(dǎo)致AR 的構(gòu)象變化進(jìn)而發(fā)揮不同的生理功能[52]。然而，共激活劑和受體兩者結(jié)合的動(dòng)態(tài)激活機(jī)制尚未明確闡明。

為了探討共激活劑和激動(dòng)劑協(xié)同結(jié)合AR-LBD的機(jī)制，Xu 等[53]構(gòu)建了AR-apo（無(wú)配體的ARLBD）、AR 結(jié)合DHT、AR 結(jié)合類固醇受體共激活劑（steroid receptor coactivator，SRC）、AR 結(jié)合DHT 和SRC 這4 個(gè)不同的結(jié)構(gòu)。通過(guò)MD 模擬探討共激活劑和激動(dòng)劑在AR 轉(zhuǎn)錄中潛在的相互作用模式。模擬結(jié)果顯示：1）當(dāng)共激活劑結(jié)合AR-LBD時(shí)，會(huì)增加AR-LBD 結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性，并誘導(dǎo)增大AR-LBD LBP 位點(diǎn)的體積，促進(jìn)激動(dòng)劑的結(jié)合（見(jiàn)圖6A）；2）類似地，當(dāng)激動(dòng)劑結(jié)合到AR-LBD 時(shí)，會(huì)引起AF2 位點(diǎn)區(qū)域的重排，進(jìn)而誘導(dǎo)出適合共激活劑結(jié)合的結(jié)合區(qū)域（見(jiàn)圖6B）。總的來(lái)說(shuō)，激活劑和激動(dòng)劑兩者結(jié)合AR-LBD是雙向作用，互相促進(jìn)。

圖6 共激活劑和激動(dòng)劑協(xié)同結(jié)合AR-LBD 的機(jī)制示意圖Figure 6 Schematic diagram of the dynamic communication between coactivators and agonists bound to AR-LBD

為了探討激動(dòng)劑和拮抗劑與AR-LBD 結(jié)合后對(duì)AR-LBD 與共激活劑結(jié)合的影響，Liu 等[54]對(duì)多種共激活劑和多種拮抗劑與AR-LBDWT和ARLBDF876L進(jìn)行了MD 模擬，結(jié)果表明不同激動(dòng)劑和拮抗劑結(jié)合AR-LBD 會(huì)調(diào)控與AF2 位點(diǎn)相關(guān)的配體-共激活劑變構(gòu)路徑。自由能計(jì)算表明，共激活劑與AR-apo 之間的結(jié)合親和力大于AR 結(jié)合拮抗劑，小于AR 結(jié)合激動(dòng)劑。此外，AR-LBD 的F876L 突變影響配體-共激活劑的變構(gòu)途徑，可能是點(diǎn)突變誘導(dǎo)拮抗劑（如化合物4）耐藥的重要原因。Jin 等對(duì)AR-LBD 結(jié)合激動(dòng)劑、拮抗劑以及共激活劑的模擬與Xu 等和Liu 等的模擬結(jié)果類似[53-55]。激動(dòng)劑的結(jié)合促進(jìn)了AF2 位點(diǎn)的構(gòu)象形成，拮抗劑則干擾AF2 位點(diǎn)的形成，進(jìn)而減弱與共激活劑結(jié)合[55]。

研究發(fā)現(xiàn)，新型的共激活劑Leupaxin（LPXN）與AR 相互作用，并在前列腺癌的侵襲和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[56]。Khan 等[57]對(duì)LPXN 與AR-LBDWT以及臨床常見(jiàn)的突變AR-LBDH874Y，AR-LBDT877A和AR-LBDT877S的相互作用進(jìn)行了MD 模擬研究。結(jié)果表明，LPXN 能與AR-LBDWT以及突變體穩(wěn)定結(jié)合，并且結(jié)合自由能計(jì)算結(jié)果顯示AR-LBDWT為（－32.95±0.17）kcal·mol-1，而AR-LBDH874Y，ARLBDT877A和AR-LBDT877S分別為（－36.69±0.11），（－38.78±0.17）和（－41.16±0.12）kcal·mol-1，表明這些突變潛在增加了LPXN 的結(jié)合，從而促進(jìn)前列腺癌侵襲和遷移。

3 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)在發(fā)現(xiàn)雄激素受體新位點(diǎn)、新母核方面的應(yīng)用

CADD 技術(shù)除了在機(jī)制探索方面被廣泛應(yīng)用，在尋找靶標(biāo)新位點(diǎn)、新母核方面也具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[58-59]。靶標(biāo)新位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、鑒定以及全新分子的發(fā)現(xiàn)，通常需要消耗大量的人力和物力。傳統(tǒng)模式一般是通過(guò)生物實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)體化合物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，以發(fā)現(xiàn)苗頭分子。這種模式雖能有效發(fā)現(xiàn)苗頭分子，但會(huì)消耗極大量的資源，并存在高假陽(yáng)性率問(wèn)題。隨著靶標(biāo)三維結(jié)構(gòu)被不斷解析，基于CADD 技術(shù)以及融合AI 技術(shù)的結(jié)合口袋探測(cè)、基于受體（或配體）的高通量虛擬篩選的應(yīng)用，為制藥行業(yè)，特別是新分子發(fā)現(xiàn)，帶來(lái)了前所未有的變革[59-61]。

如表1 所示，僅對(duì)于AR 這一靶標(biāo)，就有多個(gè)位點(diǎn)和新型母核小分子（18～ 41）的發(fā)現(xiàn)與CADD 技術(shù)密切相關(guān)。以下就CADD 技術(shù)在AR多個(gè)位點(diǎn)中的“首次應(yīng)用”加以重點(diǎn)描述，以更好地闡述CADD 技術(shù)在AR 新位點(diǎn)、新分子發(fā)現(xiàn)中的重要作用。

表1 通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的靶向雄激素受體的小分子拮抗劑Table 1 The small-molecule antagonists of androgen receptor discovered by computer-aided drug design

Axerio-Cilies 等[63]在2011 年報(bào)道了通過(guò)高通量虛擬篩選發(fā)現(xiàn)AR-LBD AF2 位點(diǎn)拮抗劑的研究結(jié)果。通過(guò)對(duì)約400 萬(wàn)的ZINC 類藥庫(kù)進(jìn)行層級(jí)式虛擬篩選、共識(shí)打分結(jié)合投票（結(jié)合多種打分技術(shù)，構(gòu)象分析等預(yù)測(cè)技術(shù)共同優(yōu)選候選分子）、人工挑選相結(jié)合，不斷縮小候選分子的范圍，最終選擇68個(gè)分子進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，6 個(gè)化合物具有抑制AR 轉(zhuǎn)錄活性的作用。其中，化合物19 通過(guò)與AR-LBD 共晶（PDB 編號(hào)：2YHD）驗(yàn)證了篩選的結(jié)果。

BF3 位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)最早源于高通量篩選發(fā)現(xiàn)的苗頭分子，然而，靶標(biāo)位點(diǎn)親和力不足的問(wèn)題，促使更多的研究采用不同策略發(fā)掘新型母核和具有更高親和力的分子[64,81]。Lack 等[64]采用與Axerio-Cilies等[63]類似的虛擬篩選策略，最終挑選了213 個(gè)候選分子進(jìn)行活性測(cè)試，其中化合物20～ 23 通過(guò)與AR-LBD 共晶（PDB 編號(hào)：2YLP，2YLQ，2YLO，3ZQT）驗(yàn)證了篩選的結(jié)果。

除了在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)高通量虛擬篩選發(fā)現(xiàn)新型母核，在實(shí)驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的新位點(diǎn)時(shí)，通過(guò)CADD 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)潛在位點(diǎn)，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的新位點(diǎn)進(jìn)行高通量虛擬篩選發(fā)現(xiàn)新型候選分子是CADD 技術(shù)高效優(yōu)勢(shì)的重要體現(xiàn)。Li 等[70]通過(guò)Molecular Operating Environment 軟件的Site Finder模塊對(duì)AR-DBD 區(qū)域進(jìn)行了深入探索，發(fā)現(xiàn)ARDBD 的P-box 區(qū)域與DNA 結(jié)合區(qū)域間存在1 個(gè)結(jié)合口袋（見(jiàn)圖2A）。接著，通過(guò)高通量虛擬篩選以及對(duì)苗頭分子的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，最終得到化合物29。由于與上市藥物恩雜魯胺不在同一結(jié)合區(qū)域，因此化合物29 能夠有效抑制恩雜魯胺耐藥細(xì)胞株的增殖。除了在P-box 區(qū)域發(fā)現(xiàn)候選分子，Dalal 等[72]在AR-DBD 的D-box 發(fā)現(xiàn)存在小分子結(jié)合位點(diǎn)（見(jiàn)圖2A），并在該區(qū)域通過(guò)高通量虛擬篩選發(fā)現(xiàn)候選分子31（結(jié)構(gòu)未公布），該化合物能夠阻斷AR-DBD的二聚化，并抑制AR 轉(zhuǎn)錄活性。

除了在AR-DBD 區(qū)域利用CADD 技術(shù)發(fā)現(xiàn)新位點(diǎn)、新分子，F(xiàn)u 等[31]通過(guò)CADD 技術(shù)發(fā)現(xiàn)了AR-LBD 區(qū)域的第4 個(gè)新位點(diǎn)（DIP 位點(diǎn)，見(jiàn)圖2），并在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了全新的高活性候選分子。他們通過(guò)MD 模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定了AR-LBD 二聚體易被破壞，而如果有小分子阻斷AR-LBD 二聚化，則可能是靶向治療前列腺癌的新策略。幸運(yùn)的是，他們發(fā)現(xiàn)了二聚體界面間存在1 個(gè)較大的空腔，能夠容納小分子。隨后，他們對(duì)商業(yè)化合物庫(kù)進(jìn)行了高通量虛擬篩選，并在發(fā)現(xiàn)苗頭分子的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，最終得到具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)潛力的候選分子41。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

CADD 技術(shù)在現(xiàn)代新藥研發(fā)中，特別是在前期發(fā)現(xiàn)階段，在機(jī)制研究、靶標(biāo)新位點(diǎn)、新母核發(fā)現(xiàn)方面，相比經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方式具有高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。然而，CADD 技術(shù)在不同研發(fā)階段，需要使用不同的方法和技術(shù)。例如，在靶標(biāo)新位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)方面，MD 模擬結(jié)合新口袋檢測(cè)技術(shù)；在動(dòng)態(tài)檢測(cè)新位點(diǎn)方面，相比經(jīng)典實(shí)驗(yàn)更易找到一些變構(gòu)位點(diǎn)以及隱藏的位點(diǎn)；在位點(diǎn)新母核發(fā)現(xiàn)方面，基于受體/配體的發(fā)現(xiàn)方式，結(jié)合多種評(píng)分機(jī)制能夠有效篩選大量的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，提高苗頭分子發(fā)現(xiàn)的效率；在經(jīng)典位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)新母核分子方面，最新的基于大數(shù)據(jù)的分子生成技術(shù)，能夠快速生成性質(zhì)相似，但母核結(jié)構(gòu)不一樣的分子，為快速獲得新母核提供了技術(shù)支持；在已有苗頭分子的基礎(chǔ)上，CADD 技術(shù)也提供了相關(guān)的技術(shù)方案，包括高精度自由能計(jì)算方法（熱力學(xué)積分和自由能微擾等），以及基于AI 的ADMET 預(yù)測(cè)工具，為成藥性開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)支持?？傊珻ADD 技術(shù)貫穿新藥研發(fā)的早期研發(fā)階段，是現(xiàn)代新藥開(kāi)發(fā)不可或缺的輔助技術(shù)。隨著CADD技術(shù)的不斷發(fā)展和實(shí)踐應(yīng)用，該技術(shù)對(duì)包括AR 在內(nèi)的多個(gè)傳統(tǒng)靶標(biāo)，以及一些新興潛力靶標(biāo)，在未來(lái)新藥開(kāi)發(fā)中必將發(fā)揮舉足輕重的作用。