拉薩大黃中曲札茋苷的提取工藝研究

周劍 方芳 劉建文 付彬彬 龔云麒 劉軍鋒 （昆藥集團(tuán)股份有限公司 昆明 650100）

拉薩大黃Rheum lhasaenseA. J. Li et P. K. Haiao屬于亞大黃，是傳統(tǒng)藏藥［1］?！缎滦蘧е楸静荨分杏涊d：“亞大黃，苦、澀、銳、寒，清腑熱，瀉疫癘、消腫、愈瘡?！本哂兄委煾瓱帷⒛憻?、腹痛、便秘、傷口不愈等作用［2］。拉薩大黃主要分布在中國陜西、四川、湖北、貴州、云南、河南等地［3］。

白皮杉醇-3'-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷（Piceatannol-3'-O-β-D-glucopyranoside，PG），又名曲札茋苷，是拉薩大黃主要有效成分，是植物體內(nèi)產(chǎn)生的天然二苯乙烯類物質(zhì)，具有抗炎［4］、抗腫瘤［5］、保護(hù)心血管［6］等作用。傳統(tǒng)提取方法有煎煮法、滲濾法、蒸餾法、回流法［7］。目前對曲札茋苷的提取工藝研究較少，本實驗采用單因素實驗與正交試驗相結(jié)合的方式，以曲札茋苷提取轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，對曲札茋苷的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為拉薩大黃的工業(yè)化提取提供參考，也為曲札茋苷的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（島津LC-2030）；電子天平（梅特勒-托利多公司，XSE205DU）；電熱套、循環(huán)冷卻水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司) ；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi，R-3）。

“老先生，我已經(jīng)看了核磁共振結(jié)果了，您看這張圖，白色的是椎管，可以看到脊髓和馬尾神經(jīng)都受到了壓迫，基本可以確診為腰椎管狹窄癥了。咱們啊，先保守治療三個月，看看效果如何，如果效果不佳，就得考慮手術(shù)治療了。當(dāng)然，如果這期間出現(xiàn)了下肢肌肉力量的減退，也是手術(shù)治療的絕對適應(yīng)癥。因為肌力下降以后如果不及時手術(shù)，神經(jīng)長時間受壓迫，肌力恢復(fù)的可能性就比較小了?！?/p>

1.2 原料及對照品

拉薩大黃干燥根，產(chǎn)自西藏自治區(qū)，2～3 年生拉薩大黃的根部，經(jīng)中科院昆明植物所鑒定為蓼科植物拉薩大黃Rheum lhasaenseA. J. Li et P. K. Haiao，批號20110505。曲札茋苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號20140104，昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院自制）。

2 方法

2.1 對照品溶液制備

精密稱取曲札茋苷對照品19.8 mg，用甲醇定容于100 mL容量瓶中，取對照品溶液0.25、0.5、1、2、2、1、2、5 mL 分別置100、100、100、50、25、10、10、10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋成一系列濃度梯度的溶液，分別進(jìn)行HPLC 檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 色譜條件

提取溶劑、提取時間、料液比是影響曲札茋苷提取率的重要因素，不同因素對提取率的影響不同，通過單因素實驗考察每個因素的重要性，確定各因素水平的設(shè)定范圍。

清代的《紅樓夢》更是為后人所稱道，無論是藝術(shù)上，還是思想上都成為古典小說的經(jīng)典之作，魯迅在《中國小說的歷史變遷》中就講：“自有《紅樓夢》出來以后，傳統(tǒng)的思想和寫法都打破了?！逼渲校婕暗綈矍?、婚姻方面，曹雪芹講述了寶、黛、釵的愛情婚姻故事，以寶玉、黛玉追求的“木石前盟”與賈薛兩家期望的“金玉良緣”相對抗，也演繹了寶玉、黛玉這一對才子佳人反對封建禮教，追求自由愛情的故事。

表1 洗脫梯度

2.3 提取轉(zhuǎn)移率計算

測定提取時間對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，在2 h 以內(nèi)，曲札茋苷提取轉(zhuǎn)移率逐漸升高，2 h 時達(dá)到最大值，可以看出提取時間對曲札茋苷的提取影響較大，但在2 h 以后，轉(zhuǎn)移率變化差別不大。綜合考慮生產(chǎn)需求，確定提取2 h 為最佳提取時間。

式中：C 為提取液中曲札茋苷的濃度，V 為提取液的體積，M 為拉薩大黃藥材重量，N 為藥材中曲札茋苷含量

2.4.5 溶劑用量對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響 精密稱取拉薩大黃藥材粉末50 g，分別以5、6、7、8 倍量藥材的95%乙醇回流提取3 次，每次提取2 h，合并提取液，減壓濃縮，定容至250 mL，測定曲札茋苷的含量，計算提取轉(zhuǎn)移率。

2.4 曲札茋苷提取工藝單因素實驗法考察

2.4.1 提取溶劑對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響 精密稱取拉薩大黃藥材粉末50 g，分別加入6倍量藥材的水、50%乙醇、95%乙醇回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮，定容至250 mL，測定曲札茋苷的含量，計算提取轉(zhuǎn)移率。

2.4.2 提取方法對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響 精密稱取拉薩大黃藥材粉末50 g，加入8 倍量藥材的95%乙醇，分別采用熱回流提取、超聲波提取、冷浸進(jìn)行提取3 次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮，定容至250 mL，測定曲札茋苷的含量，計算提取轉(zhuǎn)移率。

2.4.3 提取時間對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響 精密稱取拉薩大黃藥材粉末50 g，加入8 倍量藥材的95%乙醇回流提取3 次，每次提取時間分別為1、2、3、4 h，合并提取液，減壓濃縮，定容至250 mL，測定曲札茋苷的含量，計算提取轉(zhuǎn)移率。

2.4.4 提取次數(shù)對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響 精密稱取拉薩大黃藥材粉末50 g，以8 倍量藥材的95%乙醇回流提取2 h，分別提取2、3、4、5 次，合并提取液，減壓濃縮，定容至250 mL，測定曲札茋苷的含量，計算提取轉(zhuǎn)移率。

解法4 直接求出三角形和梯形的面積，從而直接得出兩者的面積比.此種方法沒有用到問題1的結(jié)論，并且需要設(shè)出邊長，雖然計算過程較復(fù)雜，但是解題思路直接明了.

根據(jù)產(chǎn)權(quán)特性，王名（2002年）首次提出“公共財產(chǎn)”和“公益產(chǎn)權(quán)”的概念。其中，公益財產(chǎn)是有別于國有資產(chǎn)、集體資產(chǎn)的，基于公益捐贈而形成的社會公共財產(chǎn)；公益產(chǎn)權(quán)是公益財產(chǎn)的權(quán)屬關(guān)系，以基金會為例，捐贈行為一旦成立，就形成“三權(quán)分離”的特殊產(chǎn)權(quán)形式：委托人享有對捐贈財產(chǎn)的委托權(quán)；受托人承擔(dān)對受贈財產(chǎn)的受托責(zé)任；受益人享有對受贈財產(chǎn)的最終受益權(quán)。王名（2013）進(jìn)一步闡釋了公益產(chǎn)權(quán)的本質(zhì)特征在于“三權(quán)分離”以及由此帶來公益財產(chǎn)的所有者缺位、使用權(quán)受限、無自由轉(zhuǎn)讓權(quán)等特征。

2.5 曲札茋苷提取工藝正交試驗

以提取轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，采用熱回流提取法，分別對溶劑用量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）3 個因素進(jìn)行考查，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，每因素選取3 個水平，按L9（33）進(jìn)行正交試驗，影響因素及水平見表2。

測定不同提取溶劑對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，隨著乙醇濃度的增加，曲札茋苷提取轉(zhuǎn)移率逐漸升高，當(dāng)采用95%乙醇提取時，曲札茋苷的轉(zhuǎn)移率基本達(dá)到了最高值，從經(jīng)濟(jì)性方面考慮，采用95%乙醇是最合理的，既能達(dá)到最大的轉(zhuǎn)移率，也能解決溶劑回收的問題，從而降低生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)成本。

表2 影響因素水平

3 結(jié)果

以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以水為流動相A，乙腈為流動相 B，按表1 中的梯度洗脫，流速為1 mL /min，柱溫為30℃，檢測波長為319 nm，進(jìn)樣體積20 μL。理論塔板數(shù)按曲札茋苷峰計算應(yīng)不低于2 000。

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定不同提取溶劑對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，熱回流提取法提取曲札茋苷轉(zhuǎn)移率達(dá)到了97.40%，效果最佳。此外，從實際生產(chǎn)條件來講，最終確定熱回流進(jìn)行提取。

3.2 提取溶劑對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響

圖8的橫軸、縱軸分別代表訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中目標(biāo)框的寬、高。從圖8中可以看出訓(xùn)練集中車輛目標(biāo)框的寬與高值近似,且小目標(biāo)居多。

圖1 提取溶劑對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響

3.3 提取方法對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響

以對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積的平均值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計算，得到線性回歸方程：Y=43.164X+2.756 1，r=0.999 9（n=9），且曲札茋苷在0.495～198 μg/mL 線性關(guān)系良好。

圖2 提取方法對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響

3.4 提取時間對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響

提取轉(zhuǎn)移率（%）=（C×V）/（M×N）×100%

圖3 提取時間對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響

3.5 提取次數(shù)對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響

測定提取次數(shù)對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，隨著提取次數(shù)的增加，曲札茋苷提取轉(zhuǎn)移率逐漸升高，在提取5 次時轉(zhuǎn)移率最大，可以看出提取次數(shù)對曲札茋苷的提取影響較大。綜合考慮生產(chǎn)需求，提取3 次為最佳提取次數(shù)。

我們?nèi)O;e1,e2,e3}為仿射坐標(biāo)系的一組基.記c=e1×e2并設(shè)c=xe1+ye2+ze3,則

圖4 提取次數(shù)對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響

3.6 溶劑用量對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率及含量的影響

測定溶劑用量對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，隨著溶劑用量的增加，曲札茋苷的轉(zhuǎn)移率逐漸增加，當(dāng)溶劑用量為7 倍時，曲札茋苷轉(zhuǎn)移率基本達(dá)到了最大值，隨后增長緩慢，考慮使用7 倍溶劑作為最佳溶劑用量。

圖5 溶劑用量對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響

3.7 正交試驗結(jié)果與分析

以曲札茋苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，通過極差R 和均值K 的比較，優(yōu)化曲札茋苷的最佳提取工藝，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，以曲札茋苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，極值最大的是5.913，可以看出提取工藝中主要的影響因素是溶劑用量（A），各因素影響順序是A＞C＞B，方差分析顯示無顯著性影響。經(jīng)過正交試驗設(shè)計可知，最佳提取工藝A3B3C3。即溶劑用量為8 倍，提取時間為3 h，提取次數(shù)為4 次。

隨著數(shù)據(jù)科學(xué)的深入發(fā)展，歐美等眾多發(fā)達(dá)國家都意識到作為國家戰(zhàn)略資產(chǎn)的數(shù)據(jù)的重要性，分別發(fā)布了大數(shù)據(jù)發(fā)展戰(zhàn)略。美國于2012年頒布了《大數(shù)據(jù)研究和發(fā)展計劃》，包括約 150余個項目類別，計劃項目涵蓋國防、衛(wèi)生、能源等諸多領(lǐng)域。我國也把大數(shù)據(jù)技術(shù)也提到了國家的戰(zhàn)略發(fā)展日程。2013年，國內(nèi)多位院士聯(lián)合建議設(shè)立國家專項，開展大數(shù)據(jù)技術(shù)研究。事實上，大數(shù)據(jù)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在互聯(lián)網(wǎng)、商業(yè)智能、金融業(yè)以及醫(yī)療、零售等行業(yè)，并對社會、經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生了巨大的影響[5]。

表3 正交實驗表

表4 方差分析表

3.8 驗證實驗

分別稱取3 份拉薩大黃粗粉2 kg，加入8 倍體積的95%乙醇，加熱回流提取4 次，每次3 h，合并濾液，減壓濃縮，測定曲札茋苷的含量，計算提取轉(zhuǎn)移率分別為97.12%，96.20%，97.54%，平均為96.95%，RSD值為0.71%，表明工藝具有良好的穩(wěn)定性。

4 討論

本實驗以拉薩大黃為原料，研究了曲札茋苷的提取工藝。分析曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的極差R 和均值K，提取次數(shù)、溶劑用量對曲札茋苷轉(zhuǎn)移率的影響較顯著。綜合考慮采用加8 倍量95%乙醇，提取4 次，每次3 h。驗證試驗結(jié)果可見小試最佳的工藝一定程度適合于生產(chǎn)工藝，為中試提供了相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持，該提取工藝為后續(xù)的生產(chǎn)及中藥材的開發(fā)利用提供了一定的借鑒意義。