吳康，蘇安琪，田雪嬌，李傳收，付志順，楊靜靜，宿紅艷

(魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264025)

納米材料和植物納米生物技術(shù)是新興的正處于發(fā)展中的國(guó)際前沿研究領(lǐng)域，其對(duì)世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及人們的生產(chǎn)生活會(huì)產(chǎn)生非常重要的影響。碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)是一種工程碳基納米材料，按照所含石墨烯片的層數(shù)可分為單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)。 目前，CNTs 已被廣泛應(yīng)用于航空航天、醫(yī)療、工業(yè)等領(lǐng)域[1-4]。 隨著納米技術(shù)的發(fā)展，CNTs在植物生物技術(shù)以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域(例如納米農(nóng)藥、納米肥料、納米殺蟲劑或納米仿生)的應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注[5-6]。 因此，探究CNTs 對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)促進(jìn)其更好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和作物管理具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開展過(guò)一系列關(guān)于CNTs 影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的研究。 現(xiàn)階段有關(guān)CNTs 對(duì)植物生長(zhǎng)影響的研究大致持兩種觀點(diǎn):一部分研究認(rèn)為CNTs 對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用或者沒(méi)有明顯毒性作用，另一部分研究則認(rèn)為CNTs 能夠通過(guò)影響植物根系水分吸收、光合作用等過(guò)程抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。 Ca?as 等[7]研究表明，相對(duì)低劑量的SWCNTs 可以穿透種皮，促進(jìn)番茄幼苗生長(zhǎng)；相反地，Stampoulis 等[8]的研究表明，1 000 mg/L MWCNTs 會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧(ROS)并損傷抗氧化系統(tǒng)，擾亂正常代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程導(dǎo)致其生物量降低。 此外，有研究表明適宜濃度的CNTs 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶(如SOD、POD 和CAT)活性，進(jìn)而提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性[9-11]。 可以看出，CNTs 對(duì)植物生長(zhǎng)的利弊與其自身特性、環(huán)境條件及植物種類密切相關(guān)。

雖然目前關(guān)于CNTs 對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育的影響已有大量研究報(bào)道，但受試物種主要集中在擬南芥、番茄、小麥、紅波菜和水稻等模式植物及禾本科植物上，而關(guān)于CNTs 對(duì)木本植物蘋果生長(zhǎng)影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 鑒于此，本試驗(yàn)以蘋果砧木平邑甜茶幼苗為材料，測(cè)定分析不同濃度(0、10、20 mg/L)羧基化單壁碳納米管(SWCNTs)對(duì)平邑甜茶幼苗生長(zhǎng)、葉片光合作用、葉綠素含量以及抗氧化酶活性的影響，旨在探討SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗生長(zhǎng)的影響和作用機(jī)理，以期為CNTs在環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的安全使用和處理處置提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020—2021 年在魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行。 2021 年2 月1 日挑選飽滿一致的平邑甜茶種子，用0.2%高錳酸鉀消毒30 min，流水沖洗12 h，然后置于4 ℃下沙藏40 天。 SWCNTs 干粉購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司(http:/ /www.cioc.ac.cn/)，產(chǎn)品具體參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 羧基化單壁碳納米管(SWCNTs)參數(shù)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

2021 年3 月中旬選擇露白一致的平邑甜茶種子播種于穴盤(540 mm×280 mm)中，其育苗基質(zhì)為蛭石與營(yíng)養(yǎng)土混合(1∶1)基質(zhì)，待長(zhǎng)至4 片真葉時(shí)移栽到培養(yǎng)缽(7 cm×7 cm)中，之后進(jìn)行正常肥水管理。 稱取一定量的SWCNTs 粉末加入到去離子水中，超聲分散(100 W、40 Hz)1 h，配制成不同濃度(0、10 mg/L 和20 mg/L)SWCNTs 懸浮液。 待植株長(zhǎng)至8 片真葉時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，分為3 組，以15 棵苗為1 組，葉面噴施0、10 mg/L 和20 mg/L SWCNTs 懸浮液，分別記為CNTs0、CNTs10 和CNTs20 處理。 每個(gè)處理獨(dú)立重復(fù)3 次。 約20 天后，植株表型出現(xiàn)明顯差異，收集暴露于SWCNTs 的植株葉片以供指標(biāo)分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 生物量測(cè)定 處理20 天時(shí)，每組隨機(jī)選取5 株平邑甜茶幼苗，用米尺測(cè)定株高；取地上部莖葉用分析天平稱取鮮重，之后放入烘箱內(nèi)，105 ℃殺青30 min 后70 ℃連續(xù)烘干72 h，至恒重時(shí)記為干重。

1.3.2 光合速率及葉綠素含量測(cè)定 選擇上午9∶00—11∶00，用LI-6400 光合測(cè)定儀測(cè)定植株功能葉的光合速率。 葉綠素含量測(cè)定采用分光光度法[12]，即利用95%乙醇提取色素，分別測(cè)定665、649 nm 處的OD 值，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總含量。

1.3.3 抗氧化酶活性和其它理化指標(biāo)測(cè)定 超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定[13]；過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[14]；過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法測(cè)定[15]。 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[16]；過(guò)氧化氫(H2O2)含量采用TiCl4沉淀法測(cè)定[17]。

1.3.4 AsA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)指標(biāo)測(cè)定 抗壞血酸(AsA) 和脫氫抗壞血酸(DHA) 含量參照Ma等[18]的方法測(cè)定。 谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量參照Anderson 等[19]的方法測(cè)定。 抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性的測(cè)定[20]，監(jiān)測(cè)APX 氧化AsA 引起的290 nm 處光吸收值的下降。 脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性的測(cè)定[21]，監(jiān)測(cè)由AsA 的生成引起的265 nm 處吸光值的上升。 谷胱甘肽還原酶(GR) 活性的測(cè)定[22]，監(jiān)測(cè)由NADPH 氧化所引起的340 nm 處吸光值的下降。

1.3.5 透射電子顯微鏡(TEM)觀察SWCNTs 在葉片細(xì)胞中的分布 將對(duì)照和暴露于SWCNTs 的植株葉片放于固定液中，用手術(shù)刀切割組織取樣1 mm3左右，經(jīng)脫水、包埋、切片、染色后于透射電子顯微鏡下觀察，并采集圖像分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019 和IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，用One-way ANOVA 方法進(jìn)行Duncan’s 檢驗(yàn)(P＜0.05)，數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n ＝3，3 個(gè)生物學(xué)重復(fù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面噴施SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗地上部生長(zhǎng)的影響

如圖1 所示，葉面噴施SWCNTs 可顯著影響平邑甜茶幼苗株高、地上部鮮重和干重。 與對(duì)照相比，不同濃度SWCNTs 處理下，平邑甜茶幼苗株高、地上部鮮重和干重均有不同程度提高，其中10 mg/L SWCNTs 處理下平邑甜茶幼苗株高顯著增高21.2%，地上部鮮重顯著增加25.7%。

圖1 不同濃度SWCNTs 處理下平邑甜茶幼苗表型

2.2 葉面噴施SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗葉片光合作用和葉綠素含量的影響

圖2顯示，與對(duì)照相比，葉面噴施SWCNTs 顯著提高平邑甜茶幼苗葉片的凈光合速率，其中10、20 mg/L SWCNTs 處理凈光合速率分別提高10.9%和12.3%。 隨著SWCNTs 濃度升高，葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總含量均有不同程度提高，其中，20 mg/L SWCNTs 處理葉綠素a 含量提高11.7%，葉綠素b 含量提高16.4%，葉綠素總含量提高13.3%。

圖2 不同濃度SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗葉片光合作用的影響

2.3 葉面噴施SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗葉片MDA 和H2O2含量的影響

如圖3 所示，與對(duì)照相比，噴施10、20 mg/L SWCNTs 處理平邑甜茶幼苗葉片的丙二醛(MDA)和過(guò)氧化氫(H2O2)含量略微增加。 這表明該濃度范圍內(nèi)SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗葉片沒(méi)有產(chǎn)生明顯的毒性作用。

圖3 不同濃度SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗葉片MDA 和H2O2含量的影響

2.4 葉面噴施SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

如圖4 所示，葉面噴施SWCNTs 可提高平邑甜茶幼苗葉片SOD、POD、CAT、DHAR、APX、GR活性。 SWCNTs 處理組平邑甜茶幼苗葉片SOD、CAT 活性顯著高于對(duì)照，其中10 mg/L SWCNTs 處理葉片CAT 活性較對(duì)照提高23.7%(P＜0.05)，20 mg/L SWCNTs 處理葉片SOD、POD、CAT 活性較對(duì)照分別提高25.5%、11.9%和19.6%(P＜0.05)。葉面噴施SWCNTs 后平邑甜茶幼苗葉片APX、DHAR、GR 活性均有不同程度的升高，與對(duì)照相比，10 mg/L SWCNTs 處理葉片APX、DHAR、GR活性分別提高28.9%、44.8%和16.6%(P＜0.05)，但10、20 mg/L SWCNTs 處理之間DHAR 和GR活性無(wú)顯著差異。

圖4 不同濃度SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.5 葉面噴施SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗葉片非酶抗氧化物質(zhì)含量的影響

如圖5 所示，與對(duì)照相比，10 mg/L SWCNTs處理下，平邑甜茶幼苗葉片AsA、GSH 含量分別提高26.1%和18.2%(P＜0.05)，而DHA、GSSG 含量分別降低21.9%和10.5%(P＜0.05)，AsA/DHA和GSH/GSSG 的比值分別升高49.8%和49.3%。

圖5 不同濃度SWCNTs 對(duì)平邑甜茶幼苗葉片非酶抗氧化物質(zhì)含量的影響

2.6 SWCNTs 在平邑甜茶幼苗葉片中的分布

為了探究SWCNTs 在平邑甜茶幼苗葉片中的吸收和積累情況，利用透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)平邑甜茶葉片進(jìn)行觀察。 如圖6 所示，經(jīng)SWCNTs 處理的葉片細(xì)胞中分布著黑色顆粒團(tuán)聚體，而對(duì)照葉片細(xì)胞中沒(méi)有黑色束或團(tuán)聚體。 這一結(jié)果表明，SWCNTs 能被平邑甜茶葉片吸收。

圖6 對(duì)照(A)和20 mg/L SWCNTs 處理(B)平邑甜茶幼苗葉片透射電鏡(TEM)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

碳納米管(CNTs)對(duì)植物生長(zhǎng)的積極影響及其潛在機(jī)制先前已有報(bào)道。 例如，Seddighinia等[23]研究發(fā)現(xiàn)50 mg/L MWCNTs 促進(jìn)了苦瓜根系和莖的伸長(zhǎng)。 我們最近的研究表明，土壤澆灌50、100 mg/L SWCNTs 顯著上調(diào)楊樹莖中纖維素和木質(zhì)素合成酶(CesA、PAL 和C4H)的活性，促進(jìn)楊樹莖中纖維素和木質(zhì)素的積累[24]。 本研究中，葉片噴施10、20 mg/L SWCNTs 促進(jìn)平邑甜茶幼苗地上部的生長(zhǎng)。

光合作用在植物生命活動(dòng)中具有重要意義，納米材料的應(yīng)用有助于提高植物光合速率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[25]。 Zhang 等[26]發(fā)現(xiàn)，20 mg/L SWCNTs 增加水稻葉片葉綠素含量，促進(jìn)水稻幼苗葉片的光合作用及其生長(zhǎng)發(fā)育，顯著上調(diào)水稻葉綠體發(fā)育所必需的VIRESCENT2 和YGL138(t)基因的轉(zhuǎn)錄水平。 本試驗(yàn)中，葉片噴施10、20 mg/L SWCNTs 顯著提高葉片葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量。 光合色素可以通過(guò)清除ROS 保護(hù)葉綠體，從而減少葉片中的氧化損傷[27]。 葉綠素含量增加表明平邑甜茶幼苗葉片葉綠體保護(hù)機(jī)制可能被SWCNTs 激活。 最近的幾項(xiàng)研究表明，SWCNTs 可以有效地附著在植物光合反應(yīng)中心的蛋白質(zhì)上并與光合反應(yīng)中心交換電子，提高電子傳遞的閾值以及光能利用效率，將光合作用活性提高3 倍以上[28-30]。 相反地，另一項(xiàng)研究表明，高劑量SWCNTs(300 mg/L)會(huì)引起光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心失活以及光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)末端的受體減少，導(dǎo)致葉綠體基粒和基質(zhì)區(qū)的膨脹，顯著降低凈光合速率[30]。 本研究結(jié)果顯示，SWCNTs 能被平邑甜茶幼苗葉片吸收，但其是否能夠附著在葉綠體表面以及是否與葉綠體進(jìn)行電子交換尚不確定。因此，平邑甜茶幼苗葉片增加的光合活性是由于SWCNTs 和葉綠體之間電子轉(zhuǎn)移的增加還是葉綠素含量增加所致仍需要進(jìn)一步的探索。

許多研究表明，碳基納米材料可作為非生物激發(fā)因子誘導(dǎo)植物發(fā)生一定程度的氧化脅迫，但是植物可通過(guò)啟動(dòng)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化物質(zhì)(AsA 和GSH)以及抗氧化酶(POD、SOD、CAT、APX、GR 和DHAR)，響應(yīng)CNTs 造成的氧化脅迫[31-34]。 本研究結(jié)果顯示，10、20 mg/L SWCNTs 均能促進(jìn)平邑甜茶幼苗葉片POD、SOD、CAT、APX、GR、DHAR 活性升高，這與CNTs 處理蘋果無(wú)菌苗、蠶豆和鼠尾草等植物中的結(jié)果相一致[35-37]。 此外，10、20 mg/L SWCNTs 處理提高平邑甜茶幼苗葉片AsA、GSH 含量，一定程度上降低DHA、GSSG 含量，從而顯著提高AsA/DHA、GSH/GSSG 比值。 較高的AsA/DHA 和GSH/GSSG 比值使抗氧化物質(zhì)維持在較高的還原態(tài)，能夠直接猝滅ROS[38-39]。 本研究中，10、20 mg/L SWCNTs 處理下平邑甜茶幼苗葉片H2O2、MDA 含量比對(duì)照略高，但差異不顯著，表明抗氧化系統(tǒng)能正常清除ROS。

綜上所述，葉面噴施SWCNTs 能提高葉片葉綠素含量和光合作用，促進(jìn)平邑甜茶地上部生長(zhǎng)，上調(diào)抗氧化酶活性，加快ASA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)的高效運(yùn)轉(zhuǎn)，使植物細(xì)胞保持較高的抗氧化能力。