錢沈安，胡 政，于伊楠，孟佳佳，張志岐，黃晴雯，趙志輝，聶冬霞，韓 錚,,，范 楷,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403；3.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是鐮刀菌屬的重要真菌，可侵染小麥、大麥等禾谷類作物，引起赤霉病等嚴(yán)重的真菌病害[1]。禾谷鐮刀菌不僅影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等真菌毒素，具有急性毒性（腹瀉、嘔吐、直腸出血等）和慢性毒性（厭食、體重減輕、發(fā)育不良等），嚴(yán)重威脅食品安全和人畜健康[2]。目前，我國(guó)常采用多菌靈、戊唑醇等化學(xué)殺菌劑來控制禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)和DON產(chǎn)生，但這些人工合成殺菌劑的長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致環(huán)境污染、菌株耐藥性增強(qiáng)、引入新的食品安全風(fēng)險(xiǎn)等一系列問題。因此，尋求和開發(fā)高效、安全、環(huán)保的新型抑菌劑迫在眉睫。

近年來，天然植物成分因其具有抑制效率高、效果穩(wěn)定、可降解、毒性低、不改變食品口味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為當(dāng)前真菌毒素防控研究的新趨勢(shì)[3]。1-辛烯-3-醇，又名蘑菇醇，是主要存在于植物和菌類中的一種脂肪族不飽和醇。1-辛烯-3-醇毒性低、對(duì)環(huán)境無污染，已被列入我國(guó)食品添加劑目錄[4]，在食品及香精中均有廣泛使用。作為信號(hào)分子，1-辛烯-3-醇主要參與植物細(xì)胞防御反應(yīng)，在植物-草食動(dòng)物相互作用和植物-植物相互作用中發(fā)揮作用[5]。此外，研究表明1-辛烯-3-醇對(duì)多種細(xì)菌及真菌均表現(xiàn)一定的抑菌活性，如Xiong Chuan等[6]發(fā)現(xiàn)1-辛烯-3-醇對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等細(xì)菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為1 mg/mL和2 mg/mL；Berendsen等[7]研究表明1-辛烯-3-醇可以抑制菌生輪枝孢（Lecanicillium fungicola）的孢子萌發(fā)，而有效控制該真菌所引起的蘑菇干泡??；Yin Guohua[8]和Chitarra[9]等則分別證實(shí)1-辛烯-3-醇可以抑制產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）和酒青霉（Penicillium paneum）等青霉菌的孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢。然而，目前對(duì)1-辛烯-3-醇的研究?jī)H集中在抑制真菌生長(zhǎng)上，而對(duì)真菌毒素產(chǎn)生情況的影響還不清楚，其抑菌機(jī)制也有待深入；此外，1-辛烯-3-醇對(duì)鐮刀菌的抑制作用也尚鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究1-辛烯-3-醇對(duì)禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)以及DON生物合成的抑制作用，在此基礎(chǔ)上通過測(cè)定細(xì)胞膜完整性/通透性、細(xì)胞內(nèi)容物釋放量、麥角甾醇含量、氧化應(yīng)激狀態(tài)和關(guān)鍵基因表達(dá)量等探討可能的作用機(jī)理，以期為將1-辛烯-3-醇開發(fā)為新型天然抑菌劑提供理論依據(jù)，為農(nóng)產(chǎn)品和食品中禾谷鐮刀菌和DON的污染防控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

禾谷鐮刀菌PH-1 美國(guó)典型菌種保藏中心。

1-辛烯-3-醇 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DON標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%） 美國(guó)Romer公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、瓊脂 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸銨（均為色譜純） 美國(guó)Merck公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L；馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L；羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose，CMC）培養(yǎng)基：羧甲基纖維素15 g/L，NH4NO310 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，酵母提取物1 g/L；Trichothecene biosynthesis induction（TBI）產(chǎn)毒培養(yǎng)基：KCl 0.5 g/L，精氨酸0.871 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，蔗糖30 g/L，微量元素溶液（檸檬酸50 g/L，ZnSO4·6H2O 50 g/L，NaMoO4·2H2O 0.5 g/L，CuSO4·5H2O 2.5 g/L，MnSO40.5 g/L，H3BO30.5 g/L）200 μL/L。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC XEVO TQ-S超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀 美國(guó)Waters公司；TRIPLE QUADTM 5500三重四極桿質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀 美國(guó)AB SCIEX公司；HSC-24B氮吹儀 上海楚定分析儀器有限公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；AL104分析天平瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SK8210LHC超聲波清洗機(jī) 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；SX-500高壓滅菌鍋 日本TOMY公司；MGC-300H人工氣候箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GZX-CF101-2-BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Heraeus Multifuge X3高速離心機(jī)、Applied Biosystems 2720 Thermal cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；LightCycler 96熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司；Ni-E熒光顯微鏡日本尼康公司；UV-3300B紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 禾谷鐮刀菌孢子懸浮液、菌絲的制備

取活化后的鐮刀菌菌絲，接種于CMC培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)5 d后，無菌紗布過濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將分生孢子的濃度調(diào)為107個(gè)/mL左右，現(xiàn)用現(xiàn)制。

將1 mL孢子懸浮液接種至PDB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min搖培48 h后，8 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清液，無菌水洗滌3 次獲得禾谷鐮刀菌新鮮菌絲，備用。

1.3.2 1-辛烯-3-醇對(duì)禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)和DON合成的影響

1.3.2.1 對(duì)菌落生長(zhǎng)的抑制

分別采用接觸法和熏蒸法考察1-辛烯-3-醇對(duì)禾谷鐮刀菌菌落生長(zhǎng)的影響。

接觸法：量取適量1-辛烯-3-醇溶于含0.1%（V/V）Tween-20的超純水，過濾除菌后加入PDA培養(yǎng)基，使得終含量為80、160、320、640、960、1 280、1 600 μL/L，以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照。在預(yù)先活化的禾谷鐮刀菌菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅，接種于含1-辛烯-3-醇的PDA培養(yǎng)基中心，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，十字交叉法測(cè)定菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

熏蒸法：將直徑5 mm的禾谷鐮刀菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基平板中央，把3 片直徑5 mm吸附有1-辛烯-3-醇的滅菌濾紙均勻放置于平皿邊緣，使培養(yǎng)皿中1-辛烯-3-醇含量為20、40、60、80、100 μL/L（空氣計(jì)，下同），以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照。培養(yǎng)皿用封口膜密封，放入自封袋，置于密封盒中，在28 ℃下培養(yǎng)7 d，十字交叉法測(cè)定菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3 次。1-辛烯-3-醇含量按下式計(jì)算：

1.3.2.2 對(duì)孢子萌發(fā)的影響

通過凹玻片法測(cè)定1-辛烯-3-醇對(duì)禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響。在培養(yǎng)皿中加入7 mL無菌水，向凹玻片的凹孔中加入50 μL的孢子懸浮液和50 μL的1%葡萄糖溶液，把3 片直徑5 mm、吸附有1-辛烯-3-醇的滅菌濾紙均勻放置于玻片邊緣，使培養(yǎng)皿中含量為0.1、1、5、20、40 μL/L，以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)8 h后，光學(xué)顯微鏡（×10）下觀察孢子萌發(fā)情況，當(dāng)孢子芽管長(zhǎng)度超過孢子細(xì)端直徑的一半時(shí)判定為已萌發(fā)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。孢子萌發(fā)率的計(jì)算公式如下：

1.3.2.3 對(duì)DON生物合成的抑制作用

將1-辛烯-3-醇熏蒸處理后的PDA培養(yǎng)基于50 ℃烘箱干燥，粉碎混勻后，準(zhǔn)確稱取2 g樣品于50 mL離心管，加入10 mL乙腈-水（84∶16，V/V），旋渦振蕩1 min，浸泡5 min后，超聲提取1 h，4 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液，在40 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL的5 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇（80∶20，V/V）溶解殘?jiān)?，渦旋30 s后，適量稀釋，過0.22 μm濾膜，UPLC-MS/MS測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)5 次。

將500 μL孢子懸浮液添加到50 mL TBI產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，置于250 mL錐形瓶，將1-辛烯-3-醇均勻滴在濾紙并貼于錐形瓶?jī)?nèi)壁，使瓶中1-辛烯-3-醇含量為20、40、60、80、100 μL/L，以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照。錐形瓶用封口膜密封，放入自封袋，于25 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d后，取培養(yǎng)適量稀釋，過0.22 μm濾膜，UPLC-MS/MS測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)5 次。

色譜條件：色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.7 mm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% A、90% B；0.5～4 min，10%～90% A、90%～10% B；4～4.5 min，90% A、10% B；4.5～4.7 min，90%～10% A、10%～90% B；4.7～6 min，10% A、90% B；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量3 μL；柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源（electron spray ionization，ESI）正離子模式；霧化氣、輔助氣均為高純空氣，碰撞氣為高純氮?dú)?；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi；霧化溫度500.0 ℃；噴霧電壓5 500 V；噴霧電壓氣簾氣壓力35 psi；碰撞氣壓力8 psi；通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)DON進(jìn)行定量：母離子m/z297.3；定量子離子m/z203.0，碰撞能量38 eV；定性子離子m/z175.1，碰撞能量28 eV。

1.3.3 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察超微結(jié)構(gòu)

分別取20、60、100 μL/L 1-辛烯-3-醇熏蒸處理后的禾谷鐮刀菌菌絲，2.5%戊二醛的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）室溫避光固定2 h。梯度乙醇溶液脫水后，分別用乙醇和叔丁醇混合液和叔丁醇處理。菌絲-80 ℃預(yù)凍、干燥、噴金處理后，SEM觀察。

1.3.4 麥角甾醇含量測(cè)定

分別取20、60、100 μL/L 1-辛烯-3-醇熏蒸處理后的禾谷鐮刀菌菌絲，加入5 mL 25% KOH-乙醇溶液，渦旋2 min，85 ℃孵育4 h。加入2 mL無菌水和5 mL正庚烷，渦旋2 min。靜置收集正庚烷層，用紫外分光光度計(jì)在230～300 nm波長(zhǎng)處掃描，以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照。麥角甾醇含量計(jì)算公式如下：

1.3.5 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色

分別取20、60、100 μL/L 1-辛烯-3-醇熏蒸處理后的禾谷鐮刀菌菌絲，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，加入10 μg/mL PI染色，30 ℃黑暗環(huán)境下孵育20 min。PBS漂洗后，熒光顯微鏡（535 nm激發(fā)波長(zhǎng)和615 nm發(fā)射波長(zhǎng)）觀察樣品，每次隨機(jī)觀察3 個(gè)視野，以未處理組為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.6 蛋白質(zhì)核酸泄漏

參照J(rèn)iao Wenxiao等[10]的方法檢測(cè)蛋白質(zhì)和核酸泄漏情況。取2 g禾谷鐮刀菌菌絲懸浮于20 mL PBS中，將1-辛烯-3-醇均勻滴在濾紙，貼在50 mL離心管管口處，封口膜密封后放入自封袋，管中1-辛烯-3-醇含量為20、60、100 μL/L，以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照。28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，8 000 r/min、4 ℃離心10 min后，分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)上清液的吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.7 氧化應(yīng)激的測(cè)定

1.3.7.1 MDA含量的測(cè)定

按1.3.6節(jié)獲得1-辛烯-3-醇熏蒸處理后的菌絲，PBS洗滌后在冰水浴中超聲破碎（功率35%，超聲6 s，間隔5 s，20 min）后，9 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清液。參照MDA含量檢測(cè)試劑盒的處理方法，測(cè)定532 nm與600 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算MDA含量，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.7.2 CAT和GR活性的測(cè)定

按1.3.6節(jié)獲得1-辛烯-3-醇熏蒸處理后的菌絲，PBS洗滌后，稱取0.1 g菌絲體，加入1 mL提取液，冰上研磨后，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液。參照CAT活性檢測(cè)試劑盒的處理方法，測(cè)定240 nm波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算CAT活性；參照GR活性檢測(cè)試劑盒的處理方法，測(cè)定340 nm波長(zhǎng)處吸光度并利用10 s與190 s的差值計(jì)算GR活性。每個(gè)處理重復(fù)5 次。

1.3.8 基因表達(dá)分析

分別取20、40、60 μL/L 1-辛烯-3-醇熏蒸處理后的禾谷鐮刀菌菌絲，分別按照TransZol Up、cDNA Synthesis SuperMix和PerfectStart Green qPCR SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取RNA，合成cDNA并檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況，所用引物見表1。利用2-ΔΔCt方法計(jì)算各個(gè)基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)處理重復(fù)5 次。

表1 本實(shí)驗(yàn)考察基因及引物Table 1 Primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 19.0軟件完成，差異顯著性通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和ANOVA方差分析獲得，P＜0.05，差異顯著。繪圖采用Origin 8軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-辛烯-3-醇對(duì)禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)的影響

2.1.1 對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

分別通過接觸法和熏蒸法評(píng)估1-辛烯-3-醇對(duì)禾谷鐮刀菌菌落生長(zhǎng)的影響。由圖1可見，在28 ℃培養(yǎng)7 d后，對(duì)照組菌落長(zhǎng)滿平皿，形態(tài)完整，呈磚紅色，表面覆蓋白色絨毛狀菌絲。接觸法中，Tween對(duì)菌絲的生長(zhǎng)基本無影響，而加入1-辛烯-3-醇后，隨含量增加，菌株生長(zhǎng)逐漸受到抑制，菌落逐漸變小，顏色漸轉(zhuǎn)黃（圖1A）。培養(yǎng)過程中，1-辛烯-3-醇處理組菌落的生長(zhǎng)速度也明顯慢于對(duì)照（圖2A），培養(yǎng)7 d，80、320、960、1 600 μL/L條件下菌落抑制率分別為6.86%、13.95%、17.44%、27.67%。與直接接觸相比，1-辛烯-3-醇熏蒸對(duì)禾谷鐮刀菌菌落生長(zhǎng)的抑制效果更為明顯。20～40 μL/L 1-辛烯-3-醇作用下，鐮刀菌菌絲逐漸稀疏，在60 μL/L時(shí)菌落呈現(xiàn)淺黃色，直徑明顯變小，200 μL/L以上禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)完全被抑制（圖1B）。培養(yǎng)7 d，20、60、100、200 μL/L條件下，菌落抑制率分別為13.60%、34.30%、60.70%和100%（圖2B）。對(duì)比兩種抑制方法所需1-辛烯-3-醇的用量，200 μL/L 1-辛烯-3-醇（每培養(yǎng)皿約15 μL）熏蒸可以完全抑制鐮刀菌菌落的生長(zhǎng)，而接觸法中1 600 μL/L 1-辛烯-3-醇（每培養(yǎng)皿約32 μL）作用下抑制率僅為27.67%。因此，熏蒸處理抑菌效果更好、用量更低，可能是由于1-辛烯-3-醇自身?yè)]發(fā)性較強(qiáng)，熏蒸更利于發(fā)揮其活性。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用熏蒸法進(jìn)行處理。

圖1 1-辛烯-3-醇對(duì)禾谷鐮刀菌菌落形態(tài)的影響Fig.1 Effect of 1-octen-3-ol on colony morphology of F. graminearum

圖2 1-辛烯-3-醇對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲直徑的影響Fig.2 Effect of 1-octen-3-ol on colony diameter of F. graminearum

2.1.2 對(duì)孢子萌發(fā)的影響

如圖3所示，培養(yǎng)8 h后，對(duì)照組禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)率為96.75%；1-辛烯-3-醇處理后，孢子萌發(fā)率不斷降低，5 μL/L 1-辛烯-3-醇熏蒸下，孢子萌發(fā)抑制率為43.08%，而40 μL/L 1-辛烯-3-醇處理下，孢子萌發(fā)基本完全抑制。該結(jié)果與之前多個(gè)研究類似，如5 μL/L和10 μL/L的1-辛烯-3-醇處理下，黃曲霉（Aspergillus flavus）產(chǎn)孢抑制率分別為84.50%和99.75%[11]；而74.00 μg/mL的1-辛烯-3-醇能使匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）孢子萌發(fā)率從99.74%降低至66.51%，同時(shí)芽管平均長(zhǎng)度減少為原來的24.77%[12]；此外，1-辛烯-3-醇也被證實(shí)可明顯降低酒青霉（Penicillium paneum）分生孢子的呼吸作用[9]。因此，1-辛烯-3-醇在較低含量時(shí)即可對(duì)真菌孢子的產(chǎn)生、萌發(fā)和呼吸造成顯著抑制作用。

圖3 1-辛烯-3-醇對(duì)禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響Fig.3 Effect of 1-octen-3-ol on spore germination of F. graminearum

2.2 對(duì)DON生物合成的影響

DON能夠抑制蛋白質(zhì)合成和核酸的復(fù)制，抑制線粒體功能，具有腸道毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性、遺傳毒性等多種毒性[13]，已被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織確定為最危險(xiǎn)的食品污染物之一。不同含量1-辛烯-3-醇熏蒸處理后，禾谷鐮刀菌產(chǎn)生DON毒素的結(jié)果見圖4。PDA培養(yǎng)基中，與對(duì)照組相比，20、40、60、80、100 μL/L的1-辛烯-3-醇熏蒸作用下，DON合成量顯著下降，分別為165.38、53.62、17.96、11.14 μg/kg和5.82 μg/kg，抑制率分別為29.00%、76.98%、92.29%、95.22%和97.50%；而TBI培養(yǎng)基上1-辛烯-3-醇的抑制效果更為明顯，20 μL/L作用下DON產(chǎn)生降低了84.58%，40 μL/L及以上含量作用時(shí)DON合成幾乎完全被抑制。之前研究表明，30 mg檸檬醛和丁香酚熏蒸處理能有效抑制20 g含水量21%的玉米碴中禾谷鐮刀菌DON產(chǎn)量，抑制率分別為95.64%和98.33%，而玉米碴含水量為13%時(shí)，抑制率僅為67.42%和75.70%[14]；94 μg/mL的98%環(huán)阿屯醇和97% 24-亞甲基環(huán)阿屯醇均對(duì)禾谷鐮刀菌生物合成DON有明顯抑制效果，抑制率分別為81.01%和74.68%[15]。對(duì)比可見，與其他天然產(chǎn)物相比，1-辛烯-3-醇抑制DON合成的用量更低，效果更為顯著。目前，1-辛烯-3-醇已被作為食品添加劑廣泛使用，其制備方式成熟，安全性更高，因此具有更好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

圖4 1-辛烯-3-醇對(duì)DON合成的影響Fig.4 Effect of 1-octen-3-ol on DON production

2.3 對(duì)菌絲微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖5A所示，對(duì)照組菌絲表面光滑，結(jié)構(gòu)規(guī)則，飽滿粗壯，具備正常的生理結(jié)構(gòu)；而50 μL/L 1-辛烯-3-醇熏蒸后，菌絲表面逐漸粗糙，出現(xiàn)褶皺、干癟，并伴隨孔洞出現(xiàn)（圖5B）；當(dāng)1-辛烯-3-醇增至100 μL/L，孔洞直徑增大，菌絲變細(xì)，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜膜通透性的增加和細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏（圖5C）。與此類似，1-辛烯-3-醇處理枯草芽孢桿菌和表皮芽孢桿菌后，細(xì)胞形態(tài)受到嚴(yán)重破壞，外表面不規(guī)則褶皺且粗糙[6]。以上結(jié)果表明，1-辛烯-3-醇可對(duì)真菌菌絲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成不同程度的變化和損壞，從而影響細(xì)胞的正常生理功能，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖5 不同含量1-辛烯-3-醇處理后禾谷鐮刀菌菌絲微觀形態(tài)的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM images of F. graminearum mycelia treated with 1-octen-3-ol at different concentrations

2.4 對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響

PI是一種常見的細(xì)胞染色劑，正常情況下，PI不能穿過細(xì)胞膜，而當(dāng)細(xì)胞膜受損而喪失選擇性時(shí)，PI可進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色熒光。本研究通過PI染色研究1-辛烯-3-醇熏蒸對(duì)禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜完整性的影響。由圖6A可見，對(duì)照組菌絲基本檢測(cè)不到熒光；50 μL/L 1-辛烯-3-醇熏蒸處理后，少數(shù)菌絲發(fā)出零星紅色熒光，表明部分細(xì)胞膜被破壞，通透性增加（圖6B）；當(dāng)含量增加至100 μL/L時(shí)，發(fā)出紅色熒光的菌絲增多，信號(hào)明顯增強(qiáng)，說明菌絲細(xì)胞膜被進(jìn)一步破壞，細(xì)胞死亡的數(shù)量增加（圖6C）。以上結(jié)果與SEM結(jié)果一致，表明較高濃度的1-辛烯-3-醇熏蒸可導(dǎo)致禾谷鐮刀菌菌絲細(xì)胞膜被破壞，菌體死亡。

圖6 不同含量1-辛烯-3-醇處理對(duì)禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.6 Effect of 1-octen-3-ol at different concentrations on the cell membrane integrity of F. graminearum

2.5 對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

分別通過檢測(cè)上清液的OD280nm和OD260nm考察蛋白質(zhì)和核酸的胞外泄漏情況。結(jié)果顯示，1-辛烯-3-醇熏蒸處理后，鐮刀菌胞內(nèi)容物的釋放量顯著增加，且呈劑量依賴效應(yīng)（圖7）；與對(duì)照相比，20、60、100 μL/L的1-辛烯-3-醇熏蒸作用下，其OD260nm分別增加至原來的1.61、2.06 倍和2.34 倍，OD280nm分別增加至原來的1.67、2.06 倍和2.39 倍。因此，1-辛烯-3-醇熏蒸可以顯著影響禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。類似的，0.05 μL/mL丁香精油作用下黃曲霉菌（Aspergillus flavus）菌絲核酸和蛋白質(zhì)的外滲量顯著增加，胞外上清液的OD260nm和OD280nm分別為對(duì)照組的2.3 倍和2.7 倍[16]。此外，0.1 μg/mL丁香菌酯處理后稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）菌絲的相對(duì)電導(dǎo)率升高，細(xì)胞電解質(zhì)外滲[17]；披針葉紅千層精油[18]和茉莉精油[19]可引起黃曲霉菌細(xì)胞Ca2＋、K＋、Mg2＋等重要離子的大量泄漏，且呈劑量依賴關(guān)系。以上結(jié)果表明包括1-辛烯-3-醇在內(nèi)的多種植物天然產(chǎn)物可以增加真菌細(xì)胞膜通透性，引起蛋白質(zhì)、核酸和重要離子等細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終抑制真菌生長(zhǎng)。

圖7 1-辛烯-3-醇對(duì)蛋白質(zhì)核酸泄漏的影響Fig.7 Effect of 1-octen-3-ol on leakage of intracellular proteins and nucleic acid

2.6 對(duì)麥角甾醇的影響

麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的主要甾醇部分，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞的功能和完整性，麥角固醇的缺乏或減少會(huì)導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的喪失，導(dǎo)致細(xì)胞膜功能異常，進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)容物泄漏甚至細(xì)胞死亡[20]?？拐婢幬锍Ｍㄟ^破壞麥角甾醇的生物合成途徑，達(dá)到抑菌效果；植物天然成分導(dǎo)致真菌麥角甾醇含量的下降也在多項(xiàng)研究中證實(shí)[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，1-辛烯-3-醇熏蒸后麥角甾醇含量顯著降低，20、60、100 μL/L處理組麥角甾醇含量分別下降49.01%、65.34%、84.89%，不同含量之間存在顯著差異（P＜0.05）（圖8）。綜合SEM、PI和泄漏實(shí)驗(yàn)，可認(rèn)為1-辛烯-3-醇通過作用于禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜并影響麥角固醇合成的方式發(fā)揮抑菌作用。有研究表明真菌麥角甾醇含量的減少可能是由于其生物合成途徑中羊毛甾醇-14-α-去甲基化酶活性降低[24-25]，也可能是由于ERG11、ERG6和ERG4等合成關(guān)鍵基因表達(dá)的下調(diào)[26]，而1-辛烯-3-醇干擾禾谷鐮刀菌麥角甾醇合成的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖8 1-辛烯-3-醇對(duì)麥角甾醇合成的影響Fig.8 Effect of 1-octen-3-ol on the synthesis of ergosterol

2.7 對(duì)氧化應(yīng)激的影響

促進(jìn)真菌細(xì)胞活性氧生成、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、加重氧化損傷是許多天然植物成分發(fā)揮抑菌作用的重要機(jī)制之一[27-28]。本研究通過測(cè)定GR、CAT活性以及MDA含量考察1-辛烯-3-醇熏蒸對(duì)禾谷鐮刀菌氧化應(yīng)激的影響。由圖9A所示，1-辛烯-3-醇熏蒸對(duì)GR活性有明顯的抑制效果，效果隨含量的增加而上升；20、60、100 μL/L處理組中，抑制率分別為49.37%、68.53%和83.36%。GR活性的降低可能會(huì)使細(xì)胞更易受到氫過氧化物和自由基的傷害，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。不同于GR，CAT活性先升高后降低（圖9B），20、60、100 μL/L處理組CAT活性分別升高到2.08、2.82 倍和1.98 倍。CAT是最主要的H2O2清除酶，低濃度1-辛烯-3-醇作用下，鐮刀菌細(xì)胞通過CAT活性的升高抵御氧化損傷，而高含量1-辛烯-3-醇則可能打破細(xì)胞的氧化應(yīng)激平衡并誘發(fā)損傷凋亡，使得CAT活性下降。MDA是評(píng)判脂質(zhì)過氧化水平的關(guān)鍵指標(biāo)，20 μL/L的1-辛烯-3-醇熏蒸作用下MDA含量變化不大，但在60 μL/L和100 μL/L的條件下，MDA含量顯著上升（P＜0.05），說明高含量1-辛烯-3-醇熏蒸下，禾谷鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)活性氧積累并發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

圖9 1-辛烯-3-醇對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響Fig.9 Effect of 1-octen-3-ol on antioxidant defense system

2.8 對(duì)DON生物合成關(guān)鍵基因的影響

除了菌株生長(zhǎng)被抑制，禾谷鐮刀菌DON產(chǎn)生的下降也有可能是其生物合成途徑受到干擾，本研究通過實(shí)時(shí)PCR對(duì)DON合成關(guān)鍵基因簇（TRI基因簇）的表達(dá)情況進(jìn)行分析。如圖10A所示，20 μL/L 1-辛烯-3-醇作用下TRI5和TRI6的基因相對(duì)表達(dá)量無顯著差異，其余TRI基因相對(duì)表達(dá)量有所下降，相應(yīng)含量下DON產(chǎn)量降低29.00%（圖4A）；而在40 μL/L和60 μL/L處理組，除TRI6以外所有TRI基因（TRI4、TRI5、TRI8、TRI10、TRI12、TRI101）的相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)，此時(shí)DON的合成幾乎被完全抑制（圖4）。TRI5、TRI4、TRI8和TRI101均編碼直接參與DON生物合成的催化酶，TRI12編碼毒素輸出泵，負(fù)責(zé)將合成的DON毒素輸出轉(zhuǎn)運(yùn)出菌體外[29]；TRI6和TRI10則編碼兩種不同結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，正向調(diào)控DON等單端孢霉烯族毒素生物合成的相關(guān)基因[30]。一般認(rèn)為TRI6是DON生物合成的主要調(diào)控因子，而TRI10基因起次要作用，但本研究中發(fā)現(xiàn)1-辛烯-3-醇作用下，TRI6表達(dá)無顯著變化，而TRI10的表達(dá)顯著下調(diào)。目前，TRI10的具體功能還還尚不明了，有研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌TRI10敲除后TRI6表達(dá)無變化，而其他TRI基因表達(dá)顯著降低，DON合成被抑制[31]。因此，1-辛烯-3-醇主要是通過下調(diào)TRI10基因的表達(dá)，最終抑制禾谷鐮刀菌中DON的生物合成。

圖10 1-辛烯-3-醇對(duì)TRI基因表達(dá)量的影響Fig.10 Effect of 1-octen-3-ol on TRI gene expression

3 結(jié) 論

本研究通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1-辛烯-3-醇熏蒸能有效抑制禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，其作用效果存在含量依賴性。SEM觀察、PI染色和蛋白質(zhì)核酸泄漏實(shí)驗(yàn)表明1-辛烯-3-醇熏蒸對(duì)能夠損傷禾谷鐮刀菌菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)傷，嚴(yán)重破壞了細(xì)胞膜完整性，增加了細(xì)胞膜透性，使細(xì)胞內(nèi)容物外溢。此外，1-辛烯-3-醇熏蒸能夠顯著降低禾谷鐮刀菌麥角甾醇的合成量，干擾氧化應(yīng)激狀態(tài)等，從而達(dá)到抑菌效果。最后，1-辛烯-3-醇還可通過調(diào)控TRI10基因的表達(dá)，顯著抑制禾谷鐮刀菌中DON的生物合成。以上結(jié)果表明，1-辛烯-3-醇能高效抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，未來有望將其開發(fā)為新型綠色抑菌劑，在農(nóng)產(chǎn)品和食品DON污染防控中具有廣闊的應(yīng)用前景。