王子穎 龍晨潔 范兆宇 張蕾

（武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072）

水稻（Oryza sativa L.）是世界三大糧食作物之一，全球約有40%的人口以稻米作為主要糧食并廣泛種植［1］，因此水稻的產(chǎn)量和糧食安全極為重要。在生長發(fā)育過程中，水稻會(huì)受到高溫、干旱、鹽脅迫等各種環(huán)境因素的影響。其中，干旱脅迫是影響水稻生長最終導(dǎo)致減產(chǎn)的重要環(huán)境因素之一［2］。

鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPKs）是植物中主要的鈣離子結(jié)合蛋白，對于鈣離子信號的感知和解碼具有重要意義［3］。CDPKs在植物中廣泛存在，其中水稻有31個(gè)CDPKs家族成員，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有34個(gè)，小麥（Triticum aestivum）中存在23個(gè)，玉米（Zea mays）中存在40個(gè)［4-8］。研究發(fā)現(xiàn)，CDPKs參與了植物發(fā)育的多個(gè)方面，如花粉管和根毛的生長、莖和根的發(fā)育、葉片衰老以及代謝等過程。同時(shí)，CDPKs還廣泛參與植物生物和非生物脅迫反應(yīng)［9-12］。

CRK（CDPK-related kinase）是一類在蛋白序列和結(jié)構(gòu)上與CDPKs高度同源的蛋白激酶，廣泛存在于植物中，如水稻、擬南芥、甜瓜（Cucumis melon L.）、毛果楊（Populus trichocarpa）、辣椒（Capsicum annuum）、油菜（Brassica rapa.）以及番茄（Lycopersicon esculentum）等［13-17］。其中，擬南芥中CRK 功能的研究取得了一定的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，AtCRK1能夠顯著提高植株對鹽脅迫和高溫的抵抗能力［18］。Baba等［19］對crk1突變體進(jìn)行連續(xù)光照發(fā)現(xiàn)，突變體表現(xiàn)出侏儒癥及萎黃病特征，表明AtCRK1還參與了光調(diào)控的植物生長發(fā)育過程。AtCRK2通過影響赤霉素受體蛋白（GID1）的穩(wěn)定性參與調(diào)控GA信號［20］。AtCRK3的互作蛋白AtGLN1;1在葉片衰老過程中發(fā)揮作用［21］。AtCRK5可以通過磷酸化PIN2調(diào)節(jié)生長素的運(yùn)輸，進(jìn)而參與調(diào)控根的向重力性生長［22］。水稻中CRKs的研究相對較少。Yadav 等［23］利用定量PCR和RNA原位雜交技術(shù)檢測了水稻CRK基因在不同組織和器官中的表達(dá)情況，結(jié)果表明CRK家族成員的表達(dá)具有組織特異性。

酵母雙雜交系統(tǒng)于1989年首次開發(fā)，距今已有30年多的時(shí)間，但它依然是鑒定和驗(yàn)證蛋白質(zhì)互作的最常見和最直接的方法［24］。該系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)是待測蛋白在實(shí)驗(yàn)過程中能夠保持天然構(gòu)象，從而提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度［25］。這項(xiàng)技術(shù)的基本原理是，兩種待測蛋白分別與DNA結(jié)合域或轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)，當(dāng)兩個(gè)融合蛋白之間發(fā)生相互作用時(shí)，轉(zhuǎn)錄激活因子能夠激活報(bào)告基因的表達(dá)，使酵母可以在缺陷型培養(yǎng)基上繼續(xù)生長。通過酵母菌斑的生長狀態(tài)可以判斷兩種待測蛋白是否存在相互作用［26］。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)OsCRK5參與了水稻干旱脅迫反應(yīng)，但是具體的分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選OsCRK5的互作蛋白，并通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白互作的可靠性，為闡明OsCRK5調(diào)控水稻抗旱的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：酵母菌Y2H Gold、AH109；大腸桿菌DH5α；農(nóng)桿菌GV3101。

植物材料：水稻品種為粳稻Hejiang19。

載體：酵母雙雜交系統(tǒng)為美國Clontech公司的Yeast Two-Hybrid System，文庫載體為pGADT7，誘餌載體為pGBKT7，陽性對照載體為pGBKT7-53和pGADT7-T，陰性對照載體為pGBKT7-53和pGADT7-Lam。

水稻cDNA酵母文庫：由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊紅春實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

培養(yǎng)基：酵母缺陷培養(yǎng)基購于北京酷來搏科技有限公司。酵母全培養(yǎng)基YPDA和細(xì)菌LB培養(yǎng)基所使用的蛋白胨及酵母提取物購于英國OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 干旱處理水稻幼苗 將野生型Hejiang 19和OsCRK5-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的種子滅菌后放置在MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)，在30℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周。將一周大的水稻幼苗從MS固體培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到水培液中繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待植株生長至20 DAG后，向水培液中加入20% PEG4000模擬干旱環(huán)境。對干旱處理后植株表型進(jìn)行觀察，并在固定時(shí)間點(diǎn)取材，提取RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行定量PCR分析。

1.2.2 pGBKT7-OsCRK51-444誘餌載體構(gòu)建和自激活檢測 以cDNA為模板，用引物OsCRK51-444-pGBKT7 FP:5′-CATGGAGGCCGAATTCATGGGGCA GTGTTACGC-3′和OsCRK51-444-pGBKT7 RP:5′-GCA GGTCGACGGATCCGCACTCATCTCGCAACC-3′擴(kuò)增OsCRK5基因的1-1 332 bp片段，該片段編碼OsCRK5蛋白的1-444氨基酸序列。擴(kuò)增的片段5′和3′端均與線性化載體pGBKT7的末端同源。利用重組的方法，將擴(kuò)增的OsCRK5基因片段構(gòu)建到誘餌載體pGBKT7。

將pGBKT7空載體與pGBKT7-OsCRK51-444誘餌載體分別轉(zhuǎn)化酵母Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞，酵母感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化的步驟參考Yeastmaker Yeast Transformation System 2操作手冊。將部分轉(zhuǎn)化菌液涂布于SD/-Trp+X-α-gal+AbA固體培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)2-3 d，觀察菌斑顏色。另取部分轉(zhuǎn)化菌液，稀釋后滴加在SD/-Trp和SD/-Trp/-Leu/-His固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2-3 d，觀察菌斑生長狀態(tài)。從菌斑顏色和生長狀態(tài)判斷誘餌載體蛋白是否具有自激活能力。

1.2.3 酵母總蛋白的提取和誘餌蛋白表達(dá)的檢測 挑取多個(gè)含有誘餌載體的單克隆菌斑進(jìn)行培養(yǎng)，然后分別提取酵母總蛋白，使用Western blot方法檢測誘餌蛋白的表達(dá)。用Myc抗體（小鼠單克隆抗體）作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，使用HRP-DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.2.4 酵母cDNA文庫篩選互作蛋白 根據(jù)Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇誘餌蛋白表達(dá)量最高的酵母菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手冊，將1 mL水稻cDNA酵母文庫與含有誘餌載體pGBKT7-OsCRK51-444的酵母感受態(tài)細(xì)胞混合，培養(yǎng)16 h，將菌液均勻涂布到SD/-Trp/-Leu/-His三缺固體培養(yǎng)基上。30℃倒置培養(yǎng)5 d。挑取陽性菌斑，接種到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade+X-α-gal+AbA四缺固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d。長出陽性菌斑的固體培養(yǎng)基在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 酵母質(zhì)粒提取和鑒定 將四缺固體培養(yǎng)基上的陽性菌斑接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒。以質(zhì)粒為模板，用pGADT7載體上的特異鑒定引物（FP：5′-CGATGATGAAGATACCCCAC-3′；RP：5′-GAAATTGAGATGGTGCACG-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送擎科生物公司測序。利用NCBI網(wǎng)站上的Blastn功能對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.2.6 酵母雙雜交驗(yàn)證蛋白互作 以水稻cDNA為模板，分別用特異引物pGADT7-OsDi19-1 FP：5′-CG GGATCCATCGAGTGATGGACTCGGAGCACTGGAT-3′和pGADT7-OsDi19-1 RP：5′-ACGATTCATCTGCAG ATCTCCAAATAAAGTAGTGAGCAGC-3′、pGADT7-OsWR1 FP：5′-ACGGGATCCATCGAGTGATGGTACA GCCAAAGAAGAA-3′和pGADT7-OsWR1 RP：5′-AC GATTCATCTGCAGTCAGATGACAAAGCTACCCT-3′進(jìn)行片段擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的OsDi19-1和OsWR1 CDS全長序列分別構(gòu)建到pGADT7載體中。將pGADT7-OsDi19-1和pGBKT7-OsCRK5、pGADT7-OsWR1和pGBKT7-OsCRK5轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的菌液稀釋不同倍數(shù)后滴加到二缺、三缺和四缺固體培養(yǎng)基上，觀察菌斑生長狀況。pGADT7-T和pGBKT7-53質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化的酵母菌作為陽性對照，pGADT7-T和pGBKT7-Lam質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化的酵母菌作為陰性對照。

1.2.7 熒光雙分子互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（BiFC）驗(yàn)證蛋白互作 利用同源重組的方法，將OsDi19-1的CDS全長構(gòu)建到pSPYNE-35S載體中。擴(kuò)增OsDi19-1 CDS序列使用的引物序列為：pSPYCE-35S-OsDi19-1 FP：5′-ACTGTCGACCTCGAGATGGACTCGGAGCACTGG AT-3′和pSPYCE-35S-OsDi19-1 RP：5′-CATCCCGG GAGCATCTCCAAATAAAGTAGTGAGCAGC-3′。使用同樣的方法將OsWR1的CDS全長構(gòu)建到pSPYNE-35S載體中。擴(kuò)增OsWR1 CDS目的片段使用的引物序列為：pSPYCE-35S-OsWR1 FP：5′-AACACGGG GGACATGGTACAGCCAAAGAAGAA-3′和pSPYCE-35S-OsWR1 RP：5′-AGCCCGGTTAACGATGACA AAGCTACCCT-3′。同時(shí)將CRK51-626片段構(gòu)建到pSPYCE-35S載體中。使用的引物序列為pSPYNE-35S-OsCRK51-626FP：5′-ACTGTCGACCTCGAGGG TACCATGGGGCAGTGTTACGC-3′和pSPYNE-35SOsCRK51-626RP：5′-CATCCCGGGAGCGGTACCCCGC CTCGCGTTGCTA-3′。

pSPYNE-35S-OsCRK51-626、pSPYCE-35S-OsWR1和pSPYCE-35S-OsDi19-1分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。將攜帶pSPYNE-35S-OsCRK51-626和pSPYCE-35S-OsWR1（或者pSPYNE-35S-OsCRK51-626和pSPYCE-35S-OsDi19-1）的農(nóng)桿菌菌液混合后注射到小葉煙草葉片中，避光培養(yǎng)12-16 h，然后在光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)1-2 d。激光共聚焦顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 OsCRK5-RNAi轉(zhuǎn)基因植株具有干旱敏感表型

20% PEG處理水稻幼苗30 min后，OsCRK5基因在野生型水稻葉片中的表達(dá)水平明顯上升（圖1-A）。相比于野生型水稻，此時(shí)OsCRK5-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的葉片失水明顯，卷曲嚴(yán)重（圖1-B, C）。同時(shí)，干旱誘導(dǎo)表達(dá)的基因OsLEA3和OsDREB2A在OsCRK5-RNAi轉(zhuǎn)基因植株中上升程度明顯低于野生型（圖1-D）。上述結(jié)果表明OsCRK5在水稻的干旱脅迫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

2.2 pGBKT7-CRK51-444誘餌載體的自激活測試

攜帶pGBKT7-CRK51-444質(zhì)粒的酵母菌斑在SD/-Trp+X-α-gal培養(yǎng)基上正常生長且不變藍(lán)（圖2-A）。同時(shí)，含有pGBKT7-CRK51-444誘餌載體的酵母菌斑與含有pGBKT7空載體的陰性對照在三缺固體培養(yǎng)基上均不能正常生長（圖2-B）。上述結(jié)果說明pGBKT7-CRK51-444在Y2H Gold菌株中不存在自激活活性，可以作為誘餌載體進(jìn)行后續(xù)的文庫篩選。

圖2 pGBKT7-OsCRK51-444質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的自激活檢測Fig.2 Detection of self-activation of plasmid pGBKT7-OsCRK51-444 in yeast cells

2.3 酵母全蛋白提取和誘餌蛋白的表達(dá)檢測

Western blot方法檢測帶有Myc標(biāo)簽的誘餌蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，2號菌斑中OsCRK5蛋白的表達(dá)量最高，因此選擇2號菌落進(jìn)行后續(xù)文庫篩選實(shí)驗(yàn)。

2.4 CRK5互作蛋白的初步篩選

將誘餌蛋白表達(dá)量最高的酵母菌株（2號菌）與酵母文庫菌株混合交配完成后在顯微鏡下進(jìn)行檢查。40×視野下出現(xiàn)約10個(gè)酵母合子，表明酵母交配已大部分完成（圖4-A）。交配完成后的酵母菌液在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade+X-α-gal+AbA培養(yǎng)基上生長，其中的陽性菌斑呈現(xiàn)藍(lán)色（圖4-B）。本次篩選共得到77個(gè)陽性結(jié)果。

圖4 篩選獲得的部分陽性克隆Fig.4 Partial positive clones from screened

提取陽性菌株中的質(zhì)粒，送擎科生物公司完成測序。經(jīng)過序列分析和比對，篩選得到的部分基因和注釋結(jié)果如表1所示。依照蛋白功能對這些基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類，分類結(jié)果展示如圖5。其中有5%的蛋白質(zhì)參與能量代謝過程，5%參與細(xì)胞代謝過程，5%與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)，21%與轉(zhuǎn)錄相關(guān)，21%參與蛋白質(zhì)的降解和貯存，11%參與細(xì)胞生長和分裂，32%參與蛋白質(zhì)的合成過程。

表1 酵母文庫篩選部分互作蛋白信息Table 1 Information of part interacting proteins screened by yeast library

圖5 篩選基因的功能分類Fig.5 Functional classification of screening genes

2.5 酵母雙雜交驗(yàn)證OsCRK5與OsWR1和OsDi19-1的相互作用

利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了OsWR1和OsDi19-1與OsCRK5之間的相互作用。結(jié)果如圖6所示，pGADT7-OsDi19-1和 pGBKT7-CRK51-444以及pGADT7-OsWR1和pGBKT7-CRK51-444共轉(zhuǎn)化的酵母菌株均能在四缺固體培養(yǎng)基上正常生長，說明OsDi19-1和OsWR1與OsCRK5在酵母中相互作用。

圖6 酵母雙雜交驗(yàn)證OsCRK5與OsDi19-1和OsWR1的互作Fig.6 Yeast two-hybrid confirmed the interaction between OsCRK5 and OsDi19-1 or OsWR1

2.6 熒光雙分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白互作

同時(shí)利用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)在小葉煙草的葉片表皮細(xì)胞中驗(yàn)證了OsCRK5與OsWR1和OsDi19-1之間的相互作用。激光共聚焦觀察結(jié)果顯示，OsCRK5與OsDi19-1和OsWR1在植物細(xì)胞中存在相互作用（圖7）。

圖7 BiFC驗(yàn)證OsCRK5與OsDi19-1和OsWR1的互作Fig.7 BiFC confirmed the interaction between OsCRK5 and OsDi19-1 or OsWR1

3 討論

OsCRK5在水稻生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制尚未研究清楚。本研究發(fā)現(xiàn)OsCRK5-RNAi植株具有干旱敏感的表型。利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選獲得了與OsCRK5互作的部分蛋白，并利用酵母雙雜交和BiFC實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了OsDi19-1和OsWR1與OsCRK5的互作。其中鋅指蛋白Di19-1是水稻中的干旱誘導(dǎo)蛋白，在調(diào)節(jié)多種應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［46］。Su等［47］使用RT-qPCR在高溫條件下驗(yàn)證了OsDi19-1基因的表達(dá)量發(fā)生了變化。擬南芥Di19可以調(diào)節(jié)PR1、PR2和PR5基因的表達(dá)參與干旱脅迫反應(yīng)［48］。AtDi19-3促進(jìn)植株抗旱和抗鹽，其缺失突變體植株的根長相比于野生型較長，葉綠素和脯氨酸的含量降低［49］。另有文獻(xiàn)報(bào)道，棉花中Di19-1/-2（GhDi19-1/-2）蛋白可以在體外被CDPK磷酸化，并且GhDi19-1/-2可能作為ABA信號通路中CDPK的下游靶蛋白發(fā)揮作用［50］。氣相色譜結(jié)果表明，OsWR1可以通過調(diào)控下游基因改變長鏈脂肪酸和烷烴來調(diào)節(jié)蠟質(zhì)合成［45］。Wang等［45］研究表明OsWR1可受ABA、干旱脅迫和鹽脅迫的誘導(dǎo)，且過量表達(dá)OsWR1可增強(qiáng)蠟/角質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，使蠟質(zhì)合成增加，增強(qiáng)植物的耐旱性。有研究報(bào)道OsWR1的同家族蛋白OsWR2可以招募組蛋白脫乙酰酶OsHDA704，并共同參與ABA信號以及蠟質(zhì)的生物合成等途徑［51］。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了CRK5的酵母雙雜交誘餌載體，并將其轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母菌。由于某些蛋白自身能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子從而直接激活報(bào)告基因的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了誘餌蛋白OsCRK5的不存在自激活活性，且誘餌蛋白對酵母菌Y2H Gold無毒性作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pGBKT7-OsCRK5誘餌載體滿足檢測蛋白質(zhì)相互作用的前提條件，可利用水稻cDNA文庫進(jìn)行酵母雙雜交篩庫實(shí)驗(yàn)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)是篩選和鑒定互作蛋白的常用方法，但是其缺點(diǎn)是具有較高的假陽性［52］。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過兩次篩選降低了假陽性，并且通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了OsCRK5與OsDi9-1和OsWR1存在相互作用。接下來需要進(jìn)一步研究OsCRK5是如何通過互作蛋白Di19-1和WR1參與調(diào)節(jié)水稻干旱脅迫反應(yīng)，進(jìn)而揭示OsCRK5在水稻逆境脅迫中的分子調(diào)控機(jī)制。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究OsCRK5的生物學(xué)功能提供了研究思路，同時(shí)為水稻抗旱的遺傳改良奠定分子基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用水稻cDNA文庫，篩選獲得了OsCRK5的77個(gè)互作候選蛋白。從篩選得到的互作候選蛋白中選取與水稻抗旱相關(guān)的兩個(gè)蛋白OsWR1和OsDi19-1，通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證OsWR1和OsDi19-1與OsCRK5在酵母細(xì)胞和植物細(xì)胞中均存在互作關(guān)系。