劉浩 馬世杰 周哲敏 崔文璟

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122）

β-丙氨酸，又稱3-氨基丙酸，是生物體內(nèi)合成泛酸的重要前體物質(zhì)，也是自然界中唯一存在的β型氨基酸。β-丙氨酸及其衍生物廣泛應(yīng)用于制藥，如合成帕米磷酸鈉［1］、肌肽［2］等，以及食品、飼料和化工等領(lǐng)域［3-4］，被認(rèn)為是12種最具發(fā)展?jié)摿Φ娜蓟衔镏唬?］，市場(chǎng)需求量日益上升。通過PanD催化L-天冬氨酸制備β-丙氨酸是主要途徑之一，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，相較于化學(xué)合成法，生物轉(zhuǎn)化法更加綠色、可持續(xù)。

L-天冬氨酸-α-脫羧酶（L-aspartate-αdecarboxylase, EC 4.1.1.11, PanD, ADC）能夠?qū)Ｒ坏卮呋疞-天冬氨酸脫去α羧基生成β-丙氨酸。ADC酶最早是由Williamson等［6］從Escherichia coli中分離得到。隨后Chopra等［7］異源表達(dá)了結(jié)核分歧桿菌來源的PanD，并首次進(jìn)行了結(jié)晶。PanD主要存在于細(xì)菌、古細(xì)菌、放線菌等低等生物中，目前對(duì)PanD的報(bào)道主要集中在大腸桿菌［8］、谷氨酸棒狀桿菌［9］（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢桿菌［10］（Bacillus subtilis）、結(jié)核分枝桿菌［11］（Mycobacterium tuberculosis）、幽門螺旋桿菌［12］（Helicobacter pylori）等。PanD可分為磷酸吡哆醛（PLP）依賴型和丙酮?；鶊F(tuán)依賴型兩類，磷酸吡哆醛依賴型PanD催化過程中依賴于輔因子PLP，主要來源于Tribolium castaneum、果蠅（Drosophila melanogaster）等真核生物，蛋白結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理尚無明確報(bào)道［13］，而丙酮酰基團(tuán)依賴型PanD的催化能力依賴自加工形成的丙酮?；鶊F(tuán)，無需外源輔助因子，且催化特異性高，相較于磷酸吡哆醛依賴型更具工業(yè)應(yīng)用前景。丙酮?；鶊F(tuán)依賴型PanD 合成時(shí)，首先轉(zhuǎn)錄翻譯成無活性的原酶（約15 kD），隨后在Gly24-Ser25處發(fā)生斷裂，自剪切形成1個(gè)C端含有羥基的β-亞基（約3 kD）和1個(gè)N端含有丙酮酰基的α-亞基（約12 kD）［14-16］。

目前關(guān)于PanD的克隆表達(dá)、分子改造及應(yīng)用等方面的研究逐漸升溫，張瀟瀟［17］成功在E.coli BL21（DE3）菌株中異源表達(dá)了頓齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum）來源的PanD 基因，催化生產(chǎn)β-丙氨酸，最終濃度達(dá)到76.47 mg/L。范雪萍等［18］將特基拉芽孢桿菌（B.tequilensis）來源的PanD 在E.coli BL21（DE3）中重組表達(dá)，以200 g/L L-天冬氨酸作為底物，β-丙氨酸的最終產(chǎn)量達(dá)66.4 g/L。Li等［19］構(gòu)建了過量表達(dá)谷氨酸棒桿菌ADC的大腸桿菌重組菌，全細(xì)胞催化生產(chǎn)β-丙氨酸，產(chǎn)量達(dá)到24.8 g/L。Zhang等［20］基于酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，將B.subtilis來源PanD的56號(hào)位點(diǎn)突變?yōu)榻z氨酸，最終比酶活達(dá)到7.8 U/mg。Pei等［21］通過易錯(cuò) PCR對(duì)B.subtilis來源PanD進(jìn)行改造，成功篩選到V68I以及I88M兩個(gè)突變體，其酶活相比野生型提高了18%-22%；陳虹［22］對(duì)T.castaneum來源的PanD進(jìn)行建庫篩選，篩選到兩個(gè)酶活明顯提高的突變體，最終267 g/L的底物L(fēng)-天冬氨酸可生成170.53 g/L的β-丙氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到95.45%?，F(xiàn)有對(duì)L-天冬氨酸α脫羧酶的改造普遍存在酶活力低［23-28］的問題，這是限制其工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵性因素。因此，尋找初始活性較高的L-天冬氨酸α脫羧酶，并定向進(jìn)化改造PanD基因進(jìn)一步提高催化效率，對(duì)酶法合成β-丙氨酸具有重要的研究意義和工業(yè)價(jià)值。

本研究以杰氏棒桿菌（Corynebacterium jeikeium）來源的PanD基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過半理性設(shè)計(jì)手段對(duì)其定向進(jìn)化，獲得了酶學(xué)性質(zhì)顯著提升的突變體酶，并利用全細(xì)胞催化技術(shù)實(shí)現(xiàn)了β-丙氨酸的高效合成，對(duì)酶法生產(chǎn)β-丙氨酸以及微生物發(fā)酵法合成β-丙氨酸下游產(chǎn)物（泛酸、肌肽等）具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3）、克隆宿主菌E.coli JM109、重組質(zhì)粒pET-28a（+）為本實(shí)驗(yàn)室保存。種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。Corynebacterium jeikeium來源的PanD基因由安升達(dá)公司合成。L-天冬氨酸鈉、IPTG、卡那霉素購于上海生工生物工程有限公司。β-丙氨酸（購于Sigma公司）。酵母提取物、蛋白胨購于Oxford公司。異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate, PITC）購于阿拉丁公司。

蛋白純化儀和純化柱，GE Healthcare UK Ltd；Bio-Rad PCR儀器；日立高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 同源建模和分子對(duì)接 將杰氏棒桿菌來源L-天冬氨酸α脫羧酶的氨基酸序列（GenBank登錄號(hào)：CR931997.1）上傳至AlaphFold2在線服務(wù)器進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。L-天冬氨酸α脫羧酶分子與配體L-天冬氨酸分子對(duì)接通過Maestro半柔性對(duì)接實(shí)現(xiàn)。

1.2.2 計(jì)算機(jī)模擬突變及虛擬突變位點(diǎn)的選擇 通過Rosetta軟件進(jìn)行虛擬突變，對(duì)各位點(diǎn)解折疊自由能變化（ΔΔG）結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，篩選突變后折疊自由能（ΔG）下降顯著的位點(diǎn)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中通過BLAST尋找篩選PanD的高同源性蛋白，ClustalX2軟件對(duì)這些蛋白進(jìn)行多序列同源比對(duì)分析［21］，剔除高保守位點(diǎn)。

1.2.3 突變體文庫構(gòu)建方法 以野生型CJPanD基因的重組質(zhì)粒pET28a（+）-PanD為模板，設(shè)計(jì)NNK簡并密碼子引物，通過高保真聚合酶Prime STAR Max DNA Polymerase進(jìn)行全質(zhì)粒PCR。采用Dpn I酶于37℃對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切以消化野生型模板，隨后轉(zhuǎn)化克隆宿主菌E.coli JM109，涂布于平板上，待平板上長出菌落后，悉數(shù)洗下平板上的菌落，提取混合質(zhì)粒，即為突變體文庫，再將混合質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3），涂布于平板上。挑取平板上的單菌落，接種于96孔板中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)接至另一96孔板中，約2-3 h后，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h取出，作為突變體庫備用。

1.2.4 突變體的初篩和復(fù)篩

1.2.4.1 突變體的初篩 將培養(yǎng)12 h的96孔板取出，離心去上清后，加入500 μL，濃度為100 mmol/L的L-天冬氨酸鈉溶液，放入37℃搖床反應(yīng)30 min后取出，再次離心，上清即為全細(xì)胞反應(yīng)液。突變體的初篩采用薄層層析，薄層層析是在薄板上進(jìn)行的一種層析分離方法，其原理是溶液中各組分在固定相和流動(dòng)相中的溶解度不同，在薄板上的遷移也不同，從而達(dá)到分離的目的，篩選突變體時(shí)用來定性非常方便。在距離薄板下端邊緣1.5 cm處劃線，樣品間隔1 cm，點(diǎn)樣1 μL，先點(diǎn)上底物L(fēng)-天冬氨酸和產(chǎn)物β丙氨酸，再依次點(diǎn)上全細(xì)胞反應(yīng)液，置于層析杠中，加入展開劑，展開劑沒過薄板下端邊緣1 cm左右，層析約3 h，停止層析。取出薄板，用吹風(fēng)機(jī)吹干表面的展開劑后均勻地噴上茚三酮-乙醇溶液，再使用吹風(fēng)機(jī)吹至出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)，即可進(jìn)行觀察定性。

1.2.4.2 突變體的復(fù)篩 對(duì)初篩有效果的突變體進(jìn)行純化，測(cè)定純酶酶活。

1.2.5 酶的表達(dá)與純化 將重組大腸桿菌pET28a-CJPanD-BL21、pET28a-CJPanD-L39A-BL21的單克隆接種于5 mL LB培養(yǎng)基（含有50 μg/mL卡那霉素）中，置于37℃、200 r/min的搖床中，過夜振蕩培養(yǎng)，作為種子液。按1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于含有50 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8。加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，在25℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)16-18 h左右。利用AKTA蛋白純化儀和His Trap HP純化柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集沉淀。用Binding緩沖液（20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑）重新懸浮細(xì)胞，置于冰上進(jìn)行超聲波破碎，待溶液澄清之后，于4℃、12 000 r/min離心30 min，收集細(xì)胞破碎上清液。上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后作為粗酶液上樣，用Binding緩沖液洗去非結(jié)合蛋白，用15個(gè)柱體積的Elution緩沖液（20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑）進(jìn)行線性洗脫，收集洗脫峰。將收集到的蛋白放入50 mmol/L磷酸鹽（pH 7.0）緩沖液中，4℃過夜透析除去咪唑。利用濃度為15%的SDS-PAGE對(duì)分離純化后的蛋白進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用Brandford法測(cè)定目的蛋白濃度。

1.2.6 L-天冬氨酸和β-丙氨酸檢測(cè) L-天冬氨酸和β-丙氨酸采用異硫氰酸苯酯（PITC）進(jìn)行衍生。L-天冬氨酸和β-丙氨酸經(jīng)衍后采用HPLC測(cè)定，色譜柱為DiKMA Diamonsil C18（2）（5 μm × 4.6 mm ×250 mm）；流動(dòng)相A溶液為80%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈水溶液，流動(dòng)相B為97∶3（體積分?jǐn)?shù)，pH 7.0）的0.1 mol/L醋酸鈉-乙腈溶液；梯度洗脫：0-30 min，B溶液由95%下降至70%；35-40 min，B溶液由70%上升至95%；40-42 min，B溶液梯度保持不變，檢測(cè)波長為254 nm，柱溫為40℃。

1.2.7 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.2.7.1 最適溫度測(cè)定 將0.1 mg重組酶分別置于30、37、40、45、55、60、65、70、80℃金屬浴中預(yù)熱5 min，然后與同樣預(yù)熱過5 min的pH 7.0的200 mmol/L底物L(fēng)-天冬氨酸鈉反應(yīng)10 min，測(cè)定酶活后分析酶的最適反應(yīng)溫度。

1.2.7.2 溫度穩(wěn)定性測(cè)定 將0.1 mg重組酶液置于30、37、40、50、55、60、70、80℃孵育30 min后，置于冰上冷卻5 min。加入終濃度 200 mmol /L L-天冬氨酸鈉，于37℃，pH 7.0條件下反應(yīng)10 min 測(cè)定殘余酶活。將初始酶活定義為100%，分析溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.7.3 最適pH測(cè)定 將0.1 mg重組酶置于37℃金屬浴預(yù)熱5 min，預(yù)熱后分別加至pH 3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0的緩沖液中，緩沖液中含有200 mmol/L底物L(fēng)-天冬氨酸鈉，反應(yīng)10 min，測(cè)定酶活性，分析酶的最適反應(yīng)pH。

1.2.7.4 pH穩(wěn)定性測(cè)定 將0.1 mg重組酶液置于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液中，孵育60 min后，加入終濃度 200 mmol /L L-天冬氨酸鈉，于37℃，pH 7.0條件下反應(yīng)10 min測(cè)定殘余酶活。將初始酶活定義為100%，分析pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.7.5 動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定 在終濃度100 μg/mL純酶液中，分別加入終濃度（1、2、5、10、20、50、80、100、200、400 mmol/L）L-天冬氨酸鈉，于37℃，pH 7.0條件下，反應(yīng)5 min，100℃、15 min終止反應(yīng)，檢測(cè)β-丙氨酸產(chǎn)量，測(cè)定初始反應(yīng)速率。采用GraphPad Prism9軟件擬合曲線，測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km，Kcat。將在37℃，pH 7.0的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸鈉生成1 μmol β-丙氨酸所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。

1.2.8 突變體結(jié)構(gòu)分析 通過Pymol軟件分析正向突變酶的空間結(jié)構(gòu)變化，推測(cè)分析PanD酶學(xué)性質(zhì)的變化與蛋白分子結(jié)構(gòu)改變的聯(lián)系。

1.2.9 全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸的體系優(yōu)化 重組菌細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)后，離心收集，濃縮到OD600=40。在37℃，5 mL反應(yīng)液（pH 7.0）中，加入L-天冬氨酸鈉固體粉末至終濃度1.5 mol/L，持續(xù)振蕩。每隔一段時(shí)間取樣測(cè)定L-天冬氨酸剩余量和β-丙氨酸的生成量，并由此計(jì)算轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 杰氏棒桿菌L-天冬氨酸α脫羧酶在大腸桿菌中的表達(dá)與純化

將合成的目的基因連接到pET28a（+）T7啟動(dòng)子下游后，獲得重組質(zhì)粒pET28a（+）-CJPanD，將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）-CJPanD。將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)宿主E.coli BL21（DE3），重組菌在大腸桿菌中表達(dá)純化結(jié)果見圖1，CjPanD重組表達(dá)后自剪切形成1個(gè)C端含有羥基的β-亞基（約3 kD）和1個(gè)N端含有丙酮?；摩?亞基（約12 kD）。

圖1 重組酶CJpanD及突變體蛋白電泳Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme CJpanD and mutants

2.2 計(jì)算機(jī)模擬突變

蛋白質(zhì)的解折疊自由能ΔG是蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要參數(shù)。若突變后的ΔG較野生型下降，則表明該突變有利于提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；若突變后ΔG增加，則說明該突變不利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。排除高保守位點(diǎn)H11后，確定C26、L39、I49、N72、L55和T56共6個(gè)突變熱點(diǎn)，相關(guān)位點(diǎn)的折疊自由能變化如表1。

表1 擬突變氨基酸的選取Table 1 Selection of pseudo-mutant amino acids

2.3 突變體文庫的初篩和復(fù)篩

根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬突變結(jié)果，設(shè)計(jì)飽和突變引物，簡并密碼子為NNK，構(gòu)建含有上述突變位點(diǎn)的質(zhì)粒，在96孔板中的反應(yīng)后點(diǎn)于薄板上，部分薄層層析初篩結(jié)果如圖2所示，對(duì)初篩的正向突變體進(jìn)行測(cè)序，篩選到C26L、C26F、L39A、I49L、L55F、T56W、N72。

圖2 薄層層析結(jié)果Fig.2 Results by thin layer chromatography

對(duì)初篩有效果的正向突變體進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證，在37℃，底物L(fēng)-天冬氨酸濃度200 mmol/L的條件下測(cè)定重組酶的比酶活（圖3），經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，L39A突變體的比酶活是野生型的1.4倍。

圖3 不同突變體比酶活Fig.3 Specific enzyme activity in different mutants

2.4 突變體的酶學(xué)性質(zhì)表征

2.4.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性、最適pH及pH穩(wěn)定性的表征 為了考查野生型酶和L39A突變體的最適溫度和溫度穩(wěn)定性，將底物L(fēng)-天冬氨酸鈉和重組酶分別在對(duì)應(yīng)溫度下孵育5 min后再混合到一起反應(yīng)，以未經(jīng)處理的酶作為對(duì)照，測(cè)定酶活。數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，由圖4-A可知，野生型和突變體的最適溫度為55℃，70℃下突變體L39A的活性仍然高于最適溫度下野生型活性。由圖4-B可知，在50℃孵育30 min后，野生型的活性保持在90%，而在70℃孵育情況下，野生型僅剩余20%的酶活；而突變體L39A穩(wěn)定性有所提高，70℃處理后仍剩余50%的酶活。

圖4 最適溫度及溫度穩(wěn)定性、最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.4 Optimal temperature and temperature stability, optimal pH and pH stability of recombinant enzymes

為了考查L39A突變體的最適pH以及pH穩(wěn)定性，將不同pH的含底物L(fēng)-天冬氨酸鈉的緩沖液與重組酶在37℃孵育5 min后混合到一起反應(yīng)，測(cè)定酶活。數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，由圖4-C可知，野生型與突變體L39A的最適pH為6.0-6.5，最適pH下，突變體酶活較野生型提升1.3倍。由圖4-D可知，在pH 6.0-7.0之間酶活保持穩(wěn)定，當(dāng)pH低于5.5或高于7.5時(shí)，殘余酶活低于60%。

2.4.2 突變體動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定 測(cè)定突變體L39A的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（圖5）并與野生型進(jìn)行比較，具體結(jié)果如表2所示，野生型的Km為（3.63±0.12）mmol/L，Kcat為（102.10±0.37）s-1。突變體L39A的Km值較WT低，表明其底物親和力優(yōu)于野生型；Kcat/Km較野生型更高，催化效率有顯著提升，是野生型的1.4倍。

表2 動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定Table 2 Kinetic parameters of WT and L39A

2.5 突變體的結(jié)構(gòu)模擬與分析

對(duì)突變位點(diǎn)L39A進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)（圖6），L39A與底物之間并沒有直接的相互作用，但是39位的丙氨酸與42位的谷氨酸的羥基氧原子和氮原子之間形成兩個(gè)氫鍵，其羥基氧和羰基氧與7位賴氨酸形成兩個(gè)氫鍵，穩(wěn)定了42位谷氨酸空間取向；42位谷氨酸與59位丙氨酸之間形成氫鍵，57位蘇氨酸、58位酪氨酸位參與底物的結(jié)合，39位取代為側(cè)鏈基團(tuán)更小的丙氨酸，親水性增強(qiáng)，增加了關(guān)鍵催化氨基酸58位酪氨酸與其他氨基酸的相互作用，使活性中心周圍的區(qū)域穩(wěn)定性提高，從而提高了催化活性。此外39位亮氨酸突變?yōu)楸彼岷螅Y(jié)合自由能降低，PanD酶分子與底物結(jié)合更加容易。

圖6 突變體L39A和野生型結(jié)構(gòu)信息Fig.6 Structural information of L39A and WT

2.6 全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸

在含有重組大腸桿菌細(xì)胞OD600=40的反應(yīng)液中，一次性添加L-天冬氨酸鈉進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，定時(shí)取樣監(jiān)測(cè)底物與產(chǎn)物的含量。由圖7可知，轉(zhuǎn)化初期速度較慢，轉(zhuǎn)化中期速度加快，可能是細(xì)胞發(fā)生裂解，胞內(nèi)的酶釋放出來，轉(zhuǎn)化后期轉(zhuǎn)化效率降低，可能是酶出現(xiàn)了不可逆的失活。當(dāng)一次性添加1 mol/L的L-天冬氨酸鈉進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)時(shí)，如圖7-A,B所示，L39A在4 h基本上能夠轉(zhuǎn)化70%的L-天冬氨酸，而野生型4 h僅能轉(zhuǎn)化約50%，L39A在10 h能夠轉(zhuǎn)化90% L-天冬氨酸，在12 h能夠完全轉(zhuǎn)化1 mol/L的L-天冬氨酸，野生型在15 h能完全轉(zhuǎn)化1 mol/L的L-天冬氨酸，兩者在轉(zhuǎn)化性能方面的差距較明顯。

圖7 全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸Fig.7 Whole cell catalytic synthesis of β-alanine

而當(dāng)一次性添加1.5 mol /L的L-天冬氨酸鈉作為底物進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)時(shí)，L39A在26 h摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)52%，而野生型摩爾轉(zhuǎn)化率僅為28%，L39A在26 h的最終產(chǎn)量為71.22 g/L，野生型為37.55 g/L（圖7-C, D，表3）。此種體系中酶的轉(zhuǎn)化效率變慢，可能是由于該類酶普遍存在不同程度的底物抑制。但這種體系下，突變體L39A在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面顯現(xiàn)出優(yōu)于野生型的催化和轉(zhuǎn)化性能。

表3 一批次26 h轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)量Table 3 Conversion and yield at 26 h per batch

3 討論

目前，生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-丙氨酸是主要的研究熱點(diǎn)，該方法反應(yīng)條件溫和、綠色安全；該法主要有兩類：一類是通過微生物代謝生產(chǎn)β-丙氨酸，但是經(jīng)過微生物代謝后，副產(chǎn)物較多，難以分離純化且微生物代謝轉(zhuǎn)化效率低［29］；另一類是通過酶專一性催化生產(chǎn)β-丙氨酸，該方法僅需一步轉(zhuǎn)化即可得到產(chǎn)物，易于產(chǎn)物的分離純化，但存在酶活低、機(jī)理性失活、底物抑制等問題。針對(duì)酶生物轉(zhuǎn)化存在的問題，本文通過挖掘新酶尋找初始活性高的酶；通過定向進(jìn)化提高酶的催化效率及穩(wěn)定性。本文利用已報(bào)道的谷氨酸棒狀桿菌［8］（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢桿菌［9］（Bacillus subtilis）來源的PanD基因?yàn)樘结槪赨niprot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST，分析活性中心位點(diǎn)周圍氨基酸序列的保守性，選擇自裂解后形成丙酮酰結(jié)構(gòu)的基因序列，以起始活性為標(biāo)準(zhǔn)，篩選到來源于杰氏棒桿菌（Corynebacterium jeikeium）的PanD。

酶的實(shí)驗(yàn)室定向進(jìn)化是在實(shí)驗(yàn)室模擬自然環(huán)境加速酶進(jìn)化的技術(shù)［30］，主要有位點(diǎn)飽和突變［31］和易錯(cuò)PCR［32］，這兩種方法能夠產(chǎn)生非常大的突變體文庫，但是需要依賴于分辨率較高的高通量篩選手段［33］，若沒有合適的高通量篩選手段，定向進(jìn)化過程將非常棘手。半理性設(shè)計(jì)借助蛋白質(zhì)的保守性位點(diǎn)以及晶體結(jié)構(gòu)，選取若干氨基酸作為潛在位點(diǎn)，構(gòu)建“小而精”的突變體文庫［34］。確定了定向進(jìn)化模板后，由于杰氏棒桿菌來源PanD尚未有明確的結(jié)構(gòu)作為參考，AlphaFold2在蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)方面表現(xiàn)優(yōu)秀［35］，具有驚人的準(zhǔn)確度，本文通過AlphaFold2預(yù)測(cè)杰氏棒桿菌來源PanD結(jié)構(gòu)，并通過Rosetta進(jìn)行虛擬篩選，根據(jù)蛋白質(zhì)的解折疊自由能并結(jié)合保守性分析，進(jìn)一步縮小了突變位點(diǎn)的范圍，提高了定向進(jìn)化的效率。薄層層析能夠比較直觀地對(duì)氨基酸濃度進(jìn)行定性，濃度越高，斑點(diǎn)越大。對(duì)突變體文庫進(jìn)行初篩和復(fù)篩后，篩選到突變體L39A，突變體催化效率是野生型的1.4倍。研究中還發(fā)現(xiàn)，突變體酶活提高的同時(shí)，穩(wěn)定性也有所提高，在50℃孵育30 min后，野生型的活性保持在90%，而在70℃孵育情況下，野生型僅剩余20%的酶活；而突變體L39A 70℃處理后仍剩余50%的酶活，更加有利于工業(yè)生產(chǎn)。為了進(jìn)一步了解突變體在全細(xì)胞催化方面的優(yōu)勢(shì)，本文在含有重組大腸桿菌細(xì)胞OD600=40的反應(yīng)液中，一次性添加1 mol /L的L-天冬氨酸鈉鹽進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)驗(yàn)證，L39A在4 h基本上能夠轉(zhuǎn)化70%的L-天冬氨酸，而野生型4 h僅能轉(zhuǎn)化約50%，L39A在10 h能夠轉(zhuǎn)化90% L-天冬氨酸，在12 h能夠完全轉(zhuǎn)化1 mol/L的L-天冬氨酸，具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。結(jié)構(gòu)分析表明，39位的丙氨酸與42位的谷氨酸的氧原子和氮原子之間形成兩個(gè)氫鍵，其羥基氧和羰基氧與7位賴氨酸形成氫鍵，穩(wěn)定了42位谷氨酸空間取向，42位谷氨酸與59位丙氨酸之間形成氫鍵，57位蘇氨酸、58位酪氨酸參與底物的結(jié)合，39位取代為側(cè)鏈基團(tuán)更小的丙氨酸，親水性增強(qiáng)，增加了關(guān)鍵催化氨基酸58位酪氨酸與其他氨基酸的相互作用，使活性中心周圍的區(qū)域穩(wěn)定性提高，從而提高了催化活性。

半理性設(shè)計(jì)結(jié)合Rosetta虛擬篩選策略對(duì)比其他酶活性改造策略［36］，能夠減少實(shí)驗(yàn)復(fù)雜程度、時(shí)間。對(duì)于沒有確切晶體結(jié)構(gòu)的分子，也可以通過AlphaFold2預(yù)測(cè)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，以預(yù)測(cè)后的模型為參考進(jìn)行篩選也有一定的意義，但是若想對(duì)酶進(jìn)行更為深入的研究，精確的三維結(jié)構(gòu)是必須的，還需要對(duì)野生型以及突變體進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)杰氏棒桿菌來源L-天冬氨酸α脫羧酶進(jìn)行定向進(jìn)化，成功篩選到突變體L39A。L39A熱穩(wěn)定性較野生型有所提升，最適溫度、pH與野生型一致。其與底物的親和力提高，催化效率是野生型的1.4倍。經(jīng)過全細(xì)胞催化驗(yàn)證，L39A在4 h能夠轉(zhuǎn)化70%的L-天冬氨酸，12 h能夠完全轉(zhuǎn)化1 mol/L的L-天冬氨酸，且催化效率的提高在高濃度底物（1.5 mol/L L-天冬氨酸）時(shí)表現(xiàn)得更為明顯。后續(xù)可以以L39A為模板，進(jìn)一步迭代突變，提高其在工業(yè)應(yīng)用中的潛力。