范世成,朱元全,李勝斌,儲永波,崔慶鵬

(云南省第三人民醫(yī)院泌尿外科,云南昆明 650032)

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征(chornic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome,CP/CPPS),占所有前列腺炎中的90%[1],然而其病因尚不清楚,目前被證實CP/CPPS可能與自身免疫和炎癥相關[2]。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)已被證明在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,白介素-17(interleukin-17,IL-17)和神經生長因子(nerve growth factor,NGF)也被發(fā)現(xiàn)在CP/CPPS中扮演重要角色,但我們對三者在CP/CPPS中如何相互作用知之甚少。實驗性自身免疫性前列腺炎(experimental autoimmune prostatitis,EAP)大鼠模型被認為是CP/CPPS動物模型的最佳選擇[3]。本研究通過檢測EAP大鼠前列腺組織中GM-CSF、NGF、IL-17的表達水平,以便探討三者在CP/CPPS發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠來源及其喂養(yǎng)環(huán)境選用無特定病原體(specefic pathogen free,SPF)級雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠：2月齡體質量(220±18)g,4月齡體質量(350±20)g,購于昆明醫(yī)科大學動物實驗中心;獨立籠盒系統(tǒng)飼養(yǎng),室溫18～22 ℃,濕度控制在50%左右,光照和黑暗每12 h改變1次,標準飼料,自由飲水、攝食。

1.2 EAP建模及分組

1.2.1EAP建模誘導前制備前列腺抗原(prostate antigen,PAG) 取4個月齡SD大鼠20只,體質量(350±20)g,使用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉后脫頸處死大鼠,取完整前列腺組織并稱重,切碎前列腺組織后放入玻璃勻漿器,加入同等質量0.5%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)作為均漿介質,在冰浴中(0 ℃,15 min)碾碎組織,取勻漿液離心[10 000 r/min離心30 min,溫度4 ℃,相對離心力(relative centrifugal force,RCF)約5 738 g]后提取上清液為PAG,將PAG用二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度后使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)配制成60 mg/mL。

1.2.2EAP組和阻斷EAP組 取2個月齡SD大鼠20只,體質量(220±18)g在第1天,皮下多點(下腹部骨盆區(qū)及雙側肩部)注射PAG與完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant,CFA)1∶1混合乳化液約1 mL,同時腹腔注射百白破疫苗0.5 mL;在第7、14、28天,皮下多點(下腹部骨盆區(qū)及雙側肩部)注射PAG與不完全弗氏佐劑(incomplete freund’s adjuvant,IFA)1∶1混合乳化液約1 mL,同時腹腔注射百白破疫苗0.5 mL,完成建模前誘導。首次注射第42天后制成自身免疫性大鼠模型,隨機分為2組,EAP組(10只)和阻斷EAP組(10只)。

1.2.3對照組和阻斷對照組 取2個月齡SD大鼠20只,體質量(220±18)g在第1天,皮下多點(下腹部骨盆區(qū)及雙側肩部)注射生理鹽水與完全弗氏佐劑(CFA)1∶1混合乳化液約1 mL,同時腹腔注射百白破疫苗0.5 mL;在第7、14、28天,皮下多點(下腹部骨盆區(qū)及雙側肩部)注射生理鹽水與不完全弗氏佐劑(IFA)1∶1混合乳化液約1 mL,同時腹腔注射百白破疫苗0.5 mL,隨機分為2組,對照組(10只)和阻斷對照組(10只)。

1.3 阻斷GM-CSF將阻斷對照組和阻斷EAP組分別于EAP誘導前一天及誘導后的第1、7、14、28天腹腔注射大鼠抗GM-CSF 抗體0.25 mg。

1.4 痛覺測試予Von-Frey測痛纖維于EAP誘導的第1、10、20、30、40、50日于對照組、EAP組、阻斷對照組、阻斷EAP組進行痛覺測試,具體方法為：將大鼠分別置于透明塑料箱中(15 cm×15 cm×15 cm),其底板為不銹鋼絲格柵,讓其適應0.5 h后,予Von-Frey纖維絲1、2、4、8、15、26 g依次垂直刺激其骨盆區(qū)域,每次刺激時間持續(xù)2 s,間隔5 s后重復刺激,共刺激100次。以下3種類型的行為認為是von Frey纖維絲刺激陽性反應：①腹部急劇收縮;②立即舔或刮擦細絲刺激的區(qū)域;③跳躍。建立EAP大鼠模型后,對各組進行痛覺測試。

1.5 免疫組化檢測大鼠前列腺組織GM-CSF蛋白的表達常規(guī)取出前列腺組織,予體積分數為4%的中性甲醛固定、石蠟包埋,切片、脫蠟、入水、抗原修復,切片上滴加正常山羊血清封閉液,滴加一抗、二抗,滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,最后予DAB顯色,封片,顯微鏡下觀察。

1.6 逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測RT-PCR根據制造商的規(guī)格,用Trizol(Invitrogen)從前列腺組織中提取總RNA。用試劑盒(TOYOBO)將細胞總RNA合成為cDNA。定量PCR采用SYBR綠色I檢測系統(tǒng)(SYBR綠色實時PCRMasterMixPlus,TOYOBO)進行。根據出版物使用的引物如下：①GM-CSF：F-GCAATTTCACCAAACTCAAGG,R-CTCATTACGCAGGCACAAAAG;②IL-17：F-C-ACTGAGGCCAAGGACTT,R-CGTGGAACGGTTGAGGTA;③神經生長因子(NGF)：F-ACTGGACTAAACTTCAGCATTCC,R-GGGCAGCTA-TTGGTGCAGTA。所有樣品均進行了重復的檢測。用熒光定量PCR儀,采用2-ΔΔCt法進行數據的相對定量分析。

1.7 Western blot檢測常規(guī)提取前列腺組織,于冰浴中10 min,室溫平衡。經100 g/LSDS-PAGF膜轉印2 h,以5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗4 ℃反應過夜。加入二抗室溫孵育2 h,ECL化學發(fā)光法顯色、曝光、顯影、定影。掃描儀掃描實驗結果,GEL-Pro4圖像分析軟件分析灰度值,以目的條帶與內參GAPDH灰度值的比值為目的蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠前列腺組織病理學變化EAP組大鼠前列腺組織表現(xiàn)為間質內淋巴細胞和中性粒細胞浸潤,腺體周圍充血明顯,未見明顯組織損傷;阻斷EAP組大鼠前列腺組織炎癥反應較少;EAP組炎癥情況比阻斷EAP組重(圖1)。

A：對照組;B：EAP組;C：阻斷EAP組。

2.2 各組大鼠前列腺組織GM-CSF表達水平比較大鼠前列腺組織免疫組化檢測顯示,GM-CSF在細胞質中呈陽性表達,EAP組大鼠前列腺組織GM-CSF表達較阻斷EAP組升高(P<0.01,圖2)。

2.3 各組大鼠前列腺組織中GM-CSF、NGF、IL-17的表達水平比較RT-PCR檢測結果顯示,GM-CSF的阻斷降低了下游傷害性感受和炎癥介質的表達。為了確定GM-CSF是否能調節(jié)EAP誘導過程中下游介質的表達,我們在EAP后50 d用RT-PCR檢測NGF和IL-17的mRNA表達水平。阻斷GM-CSF后顯著降低了EAP誘導的前列腺組織中NGF和IL-17mRNA的表達(圖3)。

A：粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);B：神經生長因子(NGF);C：白介素-17(IL-17);n=10,***P<0.001。

2.4 大鼠前列腺組織中GM-CSF、NGF、IL-17蛋白質的表達量Western blot結果顯示,阻斷GM-CSF后EAP誘導的前列腺組織中NGF和IL-17蛋白的表達下降,其中以NGF更為顯著(圖4)。

A：粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF); B：神經生長因子(NGF); C：白介素-17(IL-17);D：1對照組,2 EAP組,3阻斷對照組,4阻斷EAP組;n=10,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.5 各組大鼠骨盆區(qū)域疼痛結果各組大鼠骨盆區(qū)域Von-Frey測痛顯示：從開始建立EAP大鼠模型至50 d過程中,EAP組骨盆疼痛表現(xiàn)較對照組明顯升高,在阻斷GM-CSF后EAP大鼠相比較EAP大鼠顯示出反應頻率降低(圖5),說明慢性盆腔疼痛得到緩解。這些結果表明,GM-CSF對EAP中慢性盆腔疼痛的維持至關重要。

3 討 論

CP/CPPS以慢性盆腔疼痛和前列腺炎性癥狀為特征,在35～45歲男性人口中占15%[4]。先前的研究表明CP/CPPS有炎癥性或自身免疫性的基礎病變[2-3,5],用EAP動物模型進行免疫學分析已經證明,先天和適應性免疫反應都參與了慢性盆腔疼痛的發(fā)展[6]。我們認為升高的炎癥因子可觸發(fā)自身免疫,增加神經敏化。然而,關于炎癥因子在CP/CPPS發(fā)病機制中的具體作用,我們知之甚少,導致CP/CPPS的治療效果還遠遠不能令人滿意。

GM-CSF最初被報道為一種能夠誘導髓系前體細胞中的粒細胞和巨噬細胞集落的蛋白[7];是免疫細胞的重要激活和分化因子,對先天免疫和適應性免疫都至關重要[8]。近年來,越來越多的證據表明,GM-CSF在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用[9-10]。除了作為促炎細胞因子的作用,GM-CSF被發(fā)現(xiàn)通過影響感覺神經調節(jié)疼痛通路[11-12],神經元上也發(fā)現(xiàn)GM-CSF受體。GM-CSF可由各種類型的細胞產生,包括髓系細胞、免疫細胞、內皮細胞、上皮細胞和腫瘤細胞[13]。有研究表明GM-CSF可由尿路上皮細胞響應細菌內毒素而釋放,并可能介導先天免疫應答和膀胱傳入信號通路[14]。GM-CSF在自身免疫性疾病和炎癥性疾病發(fā)展中的作用及其介導疼痛的作用提示GM-CSF可能是CP/CPPS的發(fā)病機制中的重要一環(huán)。目前還沒有關于GM-CSF是否進行了調控CP/CPPS的信息。本研究發(fā)現(xiàn)多種細胞因子,包括GM-CSF、IL-17和NGF,在EAP大鼠前列腺中過表達;我們進一步利用EAP模型和注射抗GM-CSF抗體大鼠模型,證明GM-CSF在CP/CPPS的過表達,表明GM-CSF在介導前列腺炎癥中發(fā)揮了重要作用。

CP/CPPS的病理生理過程包括自身免疫和神經敏化。由于GM-CSF在自身免疫和神經敏化中都起著重要作用,因此GM-CSF通路可能參與了CP/CPPS的病理生理過程。本研究顯示,在EAP大鼠的前列腺組織中也觀察到更高水平的GM-CSF。為了進一步研究GM-CSF 在CP/CPPS中的作用,我們使用EAP誘導時中和GM-CSF抗體老鼠的前列腺組織發(fā)現(xiàn)顯著減少了EAP誘導的淋巴細胞浸潤和疼痛。進一步研究表明,抗GM-CSF降低了前列腺組織中IL-17和NGF的表達,提示在EAP誘導過程中,GM-CSF可能通過IL-17和NGF調節(jié)炎癥和疼痛信號通路。

從動物模型中獲得的大量證據表明,前列腺自身免疫和盆腔疼痛是通過自身反應性T細胞、肥大細胞和各種炎癥因子所介導[15-19]。我們認為,局部免疫系統(tǒng)的紊亂破壞了對正常前列腺抗原的耐受性,進一步誘導了前列腺自身免疫[17]。然而,導致前列腺免疫性疾病的最初因素仍不清楚。先前的研究結果表明,活化的巨噬細胞和樹突狀細胞產生促炎細胞因子,促T細胞的分化,GM-CSF水平的增加上調了來自巨噬細胞/樹突狀細胞的促炎細胞因子,形成了一個正反饋回路?；罨木奘杉毎?樹突狀細胞也產生促炎細胞因子,刺激駐留組織細胞產生GM-CSF,包括內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞或軟骨細胞[10]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組大鼠EAP誘導時相比,抗GM-CSF降低了前列腺炎的嚴重程度,提示GM-CSF的失調可能是驅動炎癥的主要激活因子,并作為前列腺自身免疫的起始因子。疼痛是CP/CPPS患者的一種特征性表現(xiàn),越來越多的證據表明,局部炎癥介質可能誘導神經敏化,導致慢性疼痛的發(fā)展。GM-CSF已被證明是炎癥性和關節(jié)炎疼痛發(fā)展的關鍵因素[11]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)功能性GM-CSFRs存在于感覺神經上,炎癥或腫瘤部位局部產生的GM-CSF可以使痛覺感受器敏感[20]。另外,敲除GM-CSF基因(GM-CSF-/-)的小鼠可減弱炎癥反應中對機械性疼痛感的反應[21]。在目前的研究中,抗GM-CSF 的EAP大鼠表現(xiàn)出較少的疼痛行為,提示GM-CSF可能對CP/CPPS的疼痛發(fā)展至關重要。我們還發(fā)現(xiàn)GM-CSF可以影響炎癥介質IL-17和NGF的表達,這些介質與盆腔疼痛的發(fā)生發(fā)展有關。本研究結果表明,GM-CSF在EAP模型中為神經敏化所必需,提示GM-CSF可能是CP/CPPS疼痛發(fā)展的主要介質。GM-CSF可直接激活感覺神經或通過其他疼痛介質如IL-17和NGF發(fā)揮其作用。

總之,我們證明了GM-CSF在CP/CPPS的發(fā)展中的重要作用,抗GM-CSF不僅降低了炎癥和傷害性感受介質的mRNA表達,而且顯著減少了EAP誘導的炎癥和疼痛。GM-CSF可能是CP/CPPS和前列腺傳入信號通路疾病進展中的重要炎癥介質。在未來,找出GM-CSF調節(jié)宿主免疫、疼痛傳導和炎癥反應的特定下游分子、細胞和生化通路將對改善CP/CPPS癥狀至關重要的。我們認為GM-CSF可能是CP/CPPS和其他前列腺疾病的潛在治療靶點。