基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)的作用機(jī)制

祝佳佳,許海柱

(1.上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200082;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院,上海 200040)

肺小結(jié)節(jié)是臨床常見病,也是嚴(yán)重困擾患者的慢性疾病。醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的快速發(fā)展使得許多肺結(jié)節(jié)患者在檢查時被發(fā)現(xiàn),而結(jié)節(jié)直徑多在8mm以內(nèi),其中大多數(shù)結(jié)節(jié)仍處于良性階段[1],無明顯的手術(shù)指征。目前對于這類肺小結(jié)節(jié)患者,定期隨訪是主要的治療策略[2]。然而中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用等優(yōu)勢在控制肺小結(jié)節(jié)病灶、改善機(jī)體免疫力,緩解患者焦慮緊張情緒等方面都發(fā)揮重要作用,臨床中亦有許多報道[3-4]。

本研究團(tuán)隊(duì)長期從事肺小結(jié)節(jié)的中醫(yī)藥防治工作,對肺小結(jié)節(jié)的病因病機(jī)特點(diǎn)等方面做了較多的研究[5-7],認(rèn)為肺小結(jié)節(jié)的發(fā)生以氣陰不足為始動因素,痰凝血瘀是結(jié)節(jié)的主要表現(xiàn)形式。并根據(jù)肺小結(jié)節(jié)的臨床特點(diǎn)創(chuàng)立理金安肺湯,方中藥物主要為黃芪、北沙參、石見穿、黃芩、天葵子、紅豆杉、瓜蔞皮,地龍、桔梗等,以補(bǔ)肺養(yǎng)陰、化痰祛瘀、通絡(luò)散結(jié)為主要功效,在臨床取得較好的療效?，F(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)方中的較多藥物有提高機(jī)體免疫力、消炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[8-12]。但目前理金安肺湯的具體作用機(jī)制尚不明確。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,篩選理金安肺湯的主要主要成分,預(yù)測藥物作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和相關(guān)通路,并利用分子對接技術(shù)驗(yàn)證主要成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合性能,初步闡釋理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)的分子作用機(jī)制,為后續(xù)深入基礎(chǔ)研究以及該方的現(xiàn)代化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 有效成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

理金安肺湯主要由黃芪、北沙參、黃芩、石見穿、瓜蔞皮、海浮石、天葵子、地龍、桔梗、紅豆杉組成。分別檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫[13](https://tcmspw.com/index.php)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫[14](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/),選擇口服生物利用度OB≥30%,類藥性DL≥0.18作為納入標(biāo)準(zhǔn),以此得到北沙參、黃芪、黃芩、石見穿、天葵子、桔梗的全部活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)。在SymMap數(shù)據(jù)庫[15](http://www.symmap.org)、ETCM數(shù)據(jù)庫[16](http://www.tcmip.cn/ETCM/)檢索地龍、瓜蔞皮、海浮石的活性成分和相應(yīng)靶點(diǎn)信息。通過查找文獻(xiàn)找到海浮石、紅豆杉中的主要化學(xué)成分,并利用PubChem數(shù)據(jù)庫[17](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)核對成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)名稱的規(guī)范,并獲取化合物的SMILES號。導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫[18](http://www.swisstargetprediction.ch/),選擇預(yù)測值大于0的靶標(biāo)作為靶點(diǎn)。經(jīng)過整理去重,得到理金安肺湯活性化合物相關(guān)的靶蛋白信息,然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫[19](https://www.uniprot.org/)將上述靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,以物種為人類作為篩選條件,獲得理金安肺湯化合物的成分靶點(diǎn)。

1.2 肺小結(jié)節(jié)的靶點(diǎn)和交集靶點(diǎn)篩選

以“Pulmonary Nodule”為關(guān)鍵詞從DrugBank[20](https://go.drugbank.com/)、GeneCards[21](https://www.genecards.org/)及OMIM[22](https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索,刪除重復(fù)靶點(diǎn)后獲得肺小結(jié)節(jié)的疾病靶點(diǎn)。將理金安肺湯和肺小結(jié)節(jié)的靶點(diǎn)上傳至Venny 2.1在線作圖工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),繪制韋恩圖,將得到兩者的交集靶點(diǎn)作為理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將獲取的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫[23](https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白互作分析(PPI),物種選擇“人類”,選擇隱藏游離靶點(diǎn),設(shè)置最低互作分值為0.4,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將獲得的PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中,以節(jié)點(diǎn)連接度(Degree)、緊密中心度(CC)和間距中心度(BC)作為參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)選擇關(guān)鍵靶點(diǎn),并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.Org/gp/index.html)對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析。GO富集分析包括生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)[24]三個方面。KEGG通路富集分析能夠表明理金安肺湯治療PN的潛在作用機(jī)制。本研究選擇排名前15位的GO條目及排名前20的KEGG通路,以P<0.01為標(biāo)準(zhǔn),利用微生信網(wǎng)站作圖處理。

1.5 構(gòu)建理金安肺湯治療PN“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

利用GO和KEGG富集數(shù)據(jù)信息,通過 Cytoscape 3.7.2 軟件(https://cytoscape.org/)繪制理金安肺湯治療PN 的活性成分-核心靶點(diǎn)-通路圖[25]。

1.6 分子對接

分子對接是2個或多個分子之間通過幾何匹配和能量匹配而相互識別并構(gòu)成穩(wěn)定復(fù)合結(jié)構(gòu)的過程[26]。將主要活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值最大的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接,以對接分?jǐn)?shù)值(Affinity)對主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性進(jìn)行評價[27]。利用PubChem數(shù)據(jù)庫下載主要化合物:槲皮素(Quercetin)、紫杉醇(Taxol)、花生四烯酸(Arachidonic acid)的SDF格式文件。從RCSB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載蛋白GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、JUN、EGF的PDB格式結(jié)構(gòu)。利用MOE2019[28]進(jìn)行分子對接操作,Affinity<-4.25kcal·mol-1說明成分與靶點(diǎn)之間具有結(jié)合活性,Affinity<-5.0kcal·mol-1說明兩者結(jié)合活性較佳,Affinity<-7.0kcal·mol-1說明兩者對接活性強(qiáng)烈[29]。

2 結(jié)果

2.1 理金安肺湯活性成分及作用靶點(diǎn)信息收集

通過檢索發(fā)現(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)的理金安肺湯活性成分共102個,其中黃芪20個、北沙參8個、黃芩36個、石見穿2個、瓜蔞皮11個、海浮石1個、天葵子7個、地龍4個、桔梗7個、紅豆杉6個。其中β-谷甾醇是北沙參、黃芩和石見穿共有成分,豆甾醇是北沙參和黃芩共有成分,槲皮素是北沙參、黃芪和石見穿共有成分,菠甾醇是瓜蔞皮和桔梗共有成分,金合歡素是黃芩和桔梗共有成分。利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫將活性成分的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)一步規(guī)范化并去重,最終得到作用靶點(diǎn)基因621個。藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖1,其中節(jié)點(diǎn)的Degree值越大,節(jié)點(diǎn)形狀越大。

注:圖中圓形表示中藥:北沙參(BSS)、地龍(DL)、瓜蔞皮(GLP)、海浮石(HFS)、黃芪(HQ)、黃芩(HQI)、桔梗(JGen)、石見穿(SJC)、天葵子(TKZ)、紅豆杉(HDS);菱形表示作用靶點(diǎn);六邊形表示各中藥的活性成分;A1～C3表示中藥之間相同的活性成分。圖1 藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)

2.2 疾病靶點(diǎn)的篩選和交集靶點(diǎn)篩選

通過檢索發(fā)現(xiàn)DrugBank數(shù)據(jù)庫中有疾病靶點(diǎn)73個,GeneCards數(shù)據(jù)庫中有2 863個,OMIM數(shù)據(jù)庫中有165個,去重后共得到疾病靶點(diǎn)3 048個。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Venny 2.1繪制韋恩圖,得到理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)的潛在作用靶點(diǎn)共316個,見圖2。

圖2 中藥與疾病交集靶點(diǎn)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫,分析后得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中,在網(wǎng)絡(luò)中有315個節(jié)點(diǎn)和7 040條邊。利用拓?fù)鋵W(xué)分析方法,設(shè)置Degree≥45,CC≥0.504 8,BC≥0.000 3三個卡值條件,共篩選得到甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、血管內(nèi)皮生長因子 A(VEGFA)、絲氨酸/蘇氨酸激酶 1(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)、細(xì)胞腫瘤抗原p53(TP53)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、表皮生長因子(EGF)、絲裂原激活的蛋白激酶3(MAPK3)、半胱天冬酶3(CASP3)等關(guān)鍵靶點(diǎn)120個,提示這些靶點(diǎn)可能是理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。靶點(diǎn)信息見表1。將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。利用 Cytoscape 3.7.2軟件繪制關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖,在網(wǎng)絡(luò)中有120個節(jié)點(diǎn)和3 424條邊,見圖4。其中Degree越大,顏色越深、形狀越大。120個關(guān)鍵靶點(diǎn)對應(yīng)的核心化合物共有19種,其中槲皮素(Quercetin)、紫杉醇(Taxol)、花生四烯酸(Arachidonic acid)是Degree值最高的3個。

表1 核心靶點(diǎn)信息

圖3 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集分析

利用Metascape在線數(shù)據(jù)庫對篩選到的120個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,前15個條目具體見圖5。作用靶點(diǎn)的生物過程(BP)富集條目為對細(xì)胞因子的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、對激素的反應(yīng)、對無機(jī)物的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、酶聯(lián)受體蛋白信號通路、造血或淋巴器官發(fā)育、對輻射的反應(yīng)、細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡的正調(diào)控、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、防御反應(yīng)的監(jiān)管、衰老、凋亡信號通路。作用靶點(diǎn)在細(xì)胞組成(CC)中的富集條目主要分布于膜筏、膜的側(cè)面、受體復(fù)合體、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物,轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、囊腔、早期內(nèi)體、黏著斑、磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物,IA類、蛋白酶抑制劑復(fù)合物、內(nèi)吞囊泡、核膜、蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔。作用靶點(diǎn)在分子功能(MF)中的主要富集條目為激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性、磷酸酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、細(xì)胞因子受體活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、核心啟動子序列特異性DNA結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合。

注:BP:生物過程;CC:細(xì)胞組分;MF:分子功能。圖5 核心靶點(diǎn)的GO富集分析

2.5 KEGG通路富集分析

本研究對120個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,分析對前20條富集通路具體見表2,并繪制KEGG富集柱狀氣泡圖,見圖6。由圖6可知,關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于癌癥通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、膀胱癌、病毒致癌、JAK-STAT信號通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、糖尿病心肌病、阿米巴病、NF-κB信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等?；贙EGG富集分析結(jié)果,運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 軟件建立“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò),并將主要活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和相應(yīng)通路連接起來。包括159個節(jié)點(diǎn)(19個活性成分節(jié)點(diǎn)、120個核心靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和 20個通路節(jié)點(diǎn))和716個邊,見圖7。

圖6 KEGG通路富集分析

注:倒三角表示通絡(luò);圓形表示作用靶點(diǎn);菱形表示藥物的活性成分。節(jié)點(diǎn)越大,表示Degree值越大。圖7 理金安肺湯活性成分核心靶點(diǎn)通路

2.6 分子對接驗(yàn)證

選擇PPI網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名前7的核心靶點(diǎn):GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、JUN、EGF與理金安肺湯三種主要活性化合物槲皮素、紫杉醇、花生四烯酸進(jìn)行對接。在結(jié)合模式中,“A1-C3”顯示活性化合物在相對應(yīng)蛋白質(zhì)上的整體結(jié)合位置;“a1-c3”顯示化合物和蛋白質(zhì)氨基酸殘基之間氫鍵和疏水相互作用的二維平面圖。活性化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)最低結(jié)合能熱圖見圖8,在能熱圖中有組合21個,平均值為-5.868 3kcal·mol-1,其中對接得分最低的為TP53-槲皮素,分值為-4.938 6kcal·mol-1,對接得分最高的為TNF-紫杉醇,分值為-10.482 3kcal·mol-1,說明主要化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。部分分子對接結(jié)果見圖9。結(jié)果提示理金安肺湯對肺小結(jié)節(jié)有較好的治療作用。

注:A:槲皮素;B:紫杉醇;C:花生四烯酸。圖8 理金安肺湯中活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)合能熱圖

注:3D結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)骨架以管形呈現(xiàn),各配體呈棒狀并用紫色著色。2D圖中綠色為疏水性殘基;紫色為極性殘基。A1:槲皮素與AKT1;A2:槲皮素與EGF;B1:紫杉醇與GAPDH;B2:紫杉醇與VEGFA;B3:紫杉醇與TNF;C1:花生四烯酸與TNF;C2:花生四烯酸與TP53;C3:花生四烯酸與JUN。圖9 分子對接構(gòu)象

3 結(jié)論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以提供多靶點(diǎn)、多通路、多環(huán)節(jié)的新型模式,從系統(tǒng)生物網(wǎng)絡(luò)層次分析解析治療藥物主要成分與疾病的相關(guān)性,能夠?yàn)橹嗅t(yī)藥作用機(jī)制研究和藥物配伍規(guī)律等提供新的研究方法[30]。分子對接可以研究分子之間的相互作用,能夠有效評估兩者之間結(jié)合能力強(qiáng)弱[31-32]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對理金安肺湯中主要成分進(jìn)行分析,結(jié)果可以為肺小結(jié)節(jié)深入作用機(jī)制探討提供參考依據(jù)。

3.1 理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)主要成分分析

理金安肺湯種中10味藥共獲得102個成分,通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選最后取19個核心成分,其中槲皮素、紫杉醇、花生四烯酸的度值最高,與疾病靶點(diǎn)聯(lián)系密切。槲皮素主要來自于黃芪、北沙參、石見穿;紫杉醇來自紅豆杉;花生四烯酸來自地龍,可以推測這三種化合物可能為理金安肺湯發(fā)揮治療作用的主要成分。研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)槲皮素屬于黃酮類化合物,具有很強(qiáng)的生物活性,能夠起到抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[33]。紫杉醇除具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用以外,還具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗纖維化等多種作用[34]?；ㄉ南┧崾且环N長鏈不飽和脂肪酸,具有抑制血小板聚集、抗炎、抗腫瘤、抗脂質(zhì)氧化等獨(dú)特的生物活性[35]。肺小結(jié)節(jié)的發(fā)生多由慢性肺部炎癥引起,之后有發(fā)展成為肺部惡性病變的可能性。通過主要化合物成分的分析,提示理金安肺湯可能通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抑制血小板聚集等作用來治療肺小結(jié)節(jié)。

3.2 理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

本研究中共有316個主要成分與疾病的交集靶點(diǎn),這些交集靶點(diǎn)中包括酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子、信號分子等物質(zhì)成分。從PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)120個關(guān)鍵靶點(diǎn),其中GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、JUN、EGF等具有較高的度值,推測其可能為理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)的高相關(guān)性靶點(diǎn)。GAPDH是糖酵解過程中的一個酶,參與DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等過程,幾乎在所有組織中呈高水平恒定表達(dá),在肺癌、腎癌、胃癌、肝癌等大部分腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。它通過促進(jìn)磷酸甘油酸脫氫酶、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)和促進(jìn)組蛋白甲基化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,最終導(dǎo)致腫瘤的惡化[36]。AKT1是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶的一個亞型,通過磷酸化作用激活或抑制其下游的靶蛋白,在炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生發(fā)展等發(fā)揮著重要作用[37]。研究也發(fā)現(xiàn)編碼的VEGFA蛋白容易在缺氧狀態(tài)下被表達(dá),能夠促進(jìn)新生血管和癌細(xì)胞等的形成,使腫瘤出現(xiàn)生長、轉(zhuǎn)移和存活等情況[38]。還有研究發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體廣泛分布于肺部,其表達(dá)水平與呼吸系統(tǒng)疾病病變密切相關(guān),且在肺炎、肺癌以及肺纖維化等組織中高表達(dá),也與疾病預(yù)后相關(guān),具有較高的臨床價值[39]。TNF主要由激活的巨噬細(xì)胞、免疫B細(xì)胞和T細(xì)胞等產(chǎn)生,在炎癥環(huán)境中含量豐富,被視為促炎因子。能參與腫瘤細(xì)胞凋亡、機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等,在關(guān)節(jié)炎、免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤方面都有較好的治療意義[40]。TP53是癌癥中最常見的突變基因,能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的代謝能力,在肺癌、胃癌、卵巢癌等多種癌癥出現(xiàn)明顯突變,尤其在小細(xì)胞肺腺癌方面突變率高達(dá)90%[41]。JUN是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[42],作為基因轉(zhuǎn)錄啟動的分子開關(guān),受到氧化應(yīng)激、感染等刺激后促進(jìn)TNF-α、IL-2、IL-8等多種炎癥因子的表達(dá),與腫瘤、哮喘、肺部炎癥、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[43]。EGF是一種保護(hù)性生長因子,其缺乏或過度表達(dá)都會破壞細(xì)胞增殖凋亡的平衡而產(chǎn)生疾病。研究發(fā)現(xiàn)長期炎癥狀態(tài)可使其受體EGFR過表達(dá),容易導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生,在肺癌中有40%～80%患者會出現(xiàn),同時也和疾病進(jìn)展、預(yù)后以及耐藥性等有關(guān)[44]。關(guān)鍵靶點(diǎn)與疾病的炎癥狀態(tài)、免疫應(yīng)答以及腫瘤侵襲等方面都有相關(guān)性,而且多數(shù)與肺部疾病直接相關(guān),可以認(rèn)為調(diào)控這些靶點(diǎn)功能是理金安肺湯發(fā)揮治療肺小結(jié)節(jié)作用的關(guān)鍵。

3.3 理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)生物富集分析

本研究GO富集分析理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)的120個關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)、生物合成調(diào)控等生物學(xué)過程。這些過程與促進(jìn)炎癥修復(fù)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、防止癌變等有關(guān)。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)理金安肺湯治療肺小結(jié)節(jié)主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等多個復(fù)雜的生物學(xué)過程。途徑主要為炎癥和癌癥相關(guān)通路,例如炎癥相關(guān)通路包括IL-17信號通路、NF-κB信號通路、JAK-STAT信號通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等;癌癥相關(guān)通路有癌癥通路、膀胱癌、病毒致癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、細(xì)胞程序性壞死、多物種凋亡等。其中IL-17是一種重要的促炎癥細(xì)胞因子,可以誘導(dǎo)炎癥因子和趨化因子的釋放,刺激中性粒細(xì)胞增殖活化,參與肺炎、COPD、胰腺炎等多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[45-46]。NF-κB可通過促進(jìn)TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄而介導(dǎo)肺部炎癥和肺纖維化[47]。細(xì)胞程序性壞死是由基因控制的細(xì)胞自主的有序性死亡方式,在肺部疾病的發(fā)病過程中起重要作用,參與調(diào)控肺癌、肺部炎癥等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展[48]。這些信號通路提示理金安肺湯通過作用于潛在靶點(diǎn),主要通過調(diào)節(jié)炎癥、腫瘤、免疫等多種信號通路,調(diào)節(jié)肺部炎癥因子的表達(dá),控制炎癥反應(yīng),抑制炎癌轉(zhuǎn)變,從而控制肺小結(jié)節(jié)發(fā)展。

綜上,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探索了理金安肺湯的主要活性成分槲皮素、紫杉醇、花生四烯酸等,可能通過GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF等靶點(diǎn),作用于癌癥、IL-17、NF-κB等信號通路治療肺小結(jié)節(jié)。并利用分子對接技術(shù),驗(yàn)證本方中主要活性成分能較好與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合,為后續(xù)深入分子機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)僅通過對數(shù)據(jù)庫中已知的中藥有效成分進(jìn)行歸納總結(jié),未考慮中藥配伍關(guān)系、中藥劑型差異等諸多影響因素,故下一步仍需通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行再驗(yàn)證,以便完善相關(guān)作用機(jī)制,推動中藥復(fù)方研發(fā)和應(yīng)用進(jìn)程。