黃靜,李烜楨,范國強

(河南農(nóng)業(yè)大學林學院,河南 鄭州 450002)

植物內(nèi)生真菌(fungal endophytes)是指存在于健康植物組織中,其生活史的某一階段或全部階段都在植物的各組織、器官內(nèi)度過,而不使其宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的一類真菌[1]。幾乎所有植物組織中都存在內(nèi)生真菌,這些真菌在植物養(yǎng)分獲取、生長發(fā)育、調(diào)節(jié)抗逆性等方面具有重要作用[2]。植物內(nèi)生真菌被認為是植物病害的調(diào)節(jié)器。一方面,某些內(nèi)生真菌可抑制病原菌對植物的侵染,從而減輕植物病害;另一方面,一些內(nèi)生真菌可能對病原菌的種群發(fā)展有著促進作用[3]。因此,深入認識和挖掘內(nèi)生真菌資源對于植物保護具有重要意義[1]。

叢枝病是泡桐(Paulownia)常見的病害,也是影響泡桐種植業(yè)健康發(fā)展的重要障礙因素[4]。叢枝病由植原體引起,癥狀主要表現(xiàn)為局部枝條呈叢生狀,嚴重者可導(dǎo)致泡桐整株枯死[4]。植原體是一種無細胞壁的細菌,目前尚不能人工培養(yǎng)[5],這給叢枝病的防治帶來很大的困難。隨著分子生物學尤其是高通量測序技術(shù)的發(fā)展,人們可在不進行人工培養(yǎng)的情況下探明內(nèi)生微生物的存活狀況,進而為了解叢枝病與內(nèi)生真菌群落關(guān)系提供了有力的工具。基于高通量測序的微生物組研究可產(chǎn)生海量的測序數(shù)據(jù),選擇正確的數(shù)據(jù)分析方法十分重要,而傳統(tǒng)的統(tǒng)計學方法已經(jīng)無法滿足大樣本量的分析[6]。機器學習能夠?qū)ξ锓N水平的操作性分類單元進行有效且準確分類,并且可以找出能夠區(qū)分組間差異的關(guān)鍵物種,因此在微生物組研究中日益受到重視[7]。

白花泡桐植株中含有豐富的內(nèi)生真菌。有學者通過純培養(yǎng)手段從白花泡桐根、莖、葉中分離出19株內(nèi)生真菌[8]。然而,這些研究都是基于傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法進行的。在叢枝病脅迫下,泡桐內(nèi)生真菌群落組成有何變化,目前尚不清楚。本研究選取健康和患叢枝病的泡桐植株,分別采集葉、枝和根樣品,分析不同樣品中植原體和內(nèi)生真菌群落組成狀況,旨在深入了解叢枝病與內(nèi)生真菌群落組成的關(guān)系,從而為開發(fā)泡桐叢枝病微生物防治技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

樣品采自河南省禹州市泡桐基地。該基地建立時間為2017年,面積為1 hm2,品種為白花泡桐,株距和行距分別為4和5 m。樹高約為5～6 m,其中10%的泡桐樹表現(xiàn)出叢枝病癥狀。

1.2 樣品采集

2021年10月,隨機選取6棵健康和6棵患有叢枝病的泡桐植株進行采樣(表1)。對于健康植株(HL、HB、HR),每棵樹剪下1枝完整枝條;對于發(fā)病植株(SL、SB、DR),每棵樹剪下1枝發(fā)病枝條。每個枝條的最大直徑約為1 cm,用無菌刀將枝條切下10 cm的小段作為枝樣品。在每個枝條上用無菌刀片隨機切下10個葉片作為葉樣品。在泡桐根部5～10 cm土層中隨機采集直徑為1 cm的根作為根樣品。所有樣品均保存于-80 ℃冰箱中。

表1 樣品代號和采集器官Table 1 Sample name and collection organ

1.3 巢氏PCR

采用巢氏PCR分析不同樣品中植原體的存活狀況[9]。使用植物基因組DNA試劑盒(TIANGEN,China)對枝和根提取總DNA。利用NanoDrop2000和1%瓊脂凝膠電泳檢測總DNA樣品濃度和純度。以提取的DNA為模板,采用引物R16mF1/R16mR1進行第1輪擴增;再以第1輪擴增產(chǎn)物(第一輪擴增產(chǎn)物用無菌水按照1∶19稀釋)作為模板,采用引物R16F2/R16R2進行第2輪PCR擴增。PCR擴增程序:94 ℃ 3 min,5個循環(huán)(94 ℃ 1 min,52 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min),25個循環(huán)(94 ℃ 30 s,52 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min),最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 DNA提取、擴增和Illumina Miseq測序

采用E.Z.N.A.? soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA)提取泡桐內(nèi)生真菌總DNA,然后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量,使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度。經(jīng)檢測合格后,于-80 ℃條件下低溫保存。

采用ITS1F/ITS2R對白花泡桐內(nèi)生真菌的ITS區(qū)域進行 PCR 擴增,擴增程序如下:95 ℃預(yù)變性3 min,27個循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s),然后72 ℃ 穩(wěn)定延伸10 min,最后在4 ℃進行保存(PCR儀:ABI GeneAmp?9700型),每個樣本3次重復(fù)。

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進行回收產(chǎn)物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用QuantusTMFluorometer(Promega,USA)對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific,USA)進行建庫:(1)接頭鏈接;(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段;(3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集;(4)磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫,利用Miseq PE300平臺進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

先使用fastp和FLASH軟件對原始測序序列進行質(zhì)控和拼接,再利用UPARSE軟件按照97%的相似性對非重復(fù)序列進行OTU聚類并去除嵌合體,得到OTU的代表序列。最后對每條序列進行物種分類注釋,并與Unite(Release 8.0 http://unite.ut.ee/index.php)真菌數(shù)據(jù)庫對比,默認置信度閾值為0.7。為了比較白花泡桐葉、枝和根樣品間的內(nèi)生真菌群落多樣性,采用mothur(https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur)軟件計算內(nèi)生真菌α多樣性指數(shù),包括香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù),分別反映內(nèi)生真菌群落的多樣性和豐富度,并采用Studentt檢驗(Student’sttest)進行組間差異檢驗?；贐ray-Curtis距離矩陣,利用R語言(version 3.3.1)進行主坐標分析(PCoA),用于內(nèi)生真菌β多樣性分析。使用R語言中randomFo-rest包(version 4.7-1.1),建立隨機森林分類模型,將內(nèi)生真菌群落與叢枝病相關(guān)聯(lián),以評估不同類型樣品中的真菌群落狀況并對生物標志物進行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡桐叢枝病與植原體豐度的關(guān)系

通過巢氏PCR發(fā)現(xiàn)(圖1),SB和SR樣品在1 200 bp處有較亮的條帶出現(xiàn),而HB和HR樣品無條帶出現(xiàn)。由于植原體DNA長度約為1 200 bp[10],可見SB和SR樣品中含有較多的植原體,而HB和HR樣品中不含植原體(或含量極低)。這表明在泡桐枝中,叢枝病癥狀與植原體豐度存在密切的聯(lián)系,而在泡桐根中,雖然植原體豐度較高,但并未并表現(xiàn)出發(fā)病情況。

A:M為2 000 bp Marker;1為ddH2O;2～7為HB;8～13為SB。B:M為2 000 bp Marker;1為ddH2O;2～7為HR;8～13為SR。A: M present 2 000 bp Marker;1 present ddH2O;2-7 present HB;8-13 present SB. B: M present 2 000 bp Marker;1 present ddH2O;2-7 present HR;8-13為SR.

2.2 泡桐叢枝病對內(nèi)生真菌群落α多樣性的影響

通過分析泡桐內(nèi)生真菌群落α多樣性發(fā)現(xiàn)(圖2),SB樣品的香農(nóng)指數(shù)顯著高于HB(p<0.05),SL樣品香農(nóng)指數(shù)較HL樣品有所上升,但是未達到顯著水平(p>0.05),HR和DR樣品之間的香農(nóng)指數(shù)無顯著差異(p>0.05)(圖2),表明叢枝病提高了泡桐枝中的內(nèi)生真菌群落多樣性,但未改變?nèi)~和根中內(nèi)生真菌群落的多樣性。發(fā)病樣品(SB、SL和SR)的Chao1指數(shù)較相應(yīng)的健康樣品(HB、HL和HR)有所提高,但均未達到顯著水平(p>0.05)(圖2),表明叢枝病未改變枝、葉和根中內(nèi)生真菌群落豐富度。

A和D:葉樣品;B和E:枝樣品;C和F:根樣品。A and D: Leaf samples; B and E: Branch samples; C and F: Root samples.

2.3 泡桐叢枝病對內(nèi)生真菌群落β多樣性的影響

根據(jù)不同樣品的真菌物種組成數(shù)據(jù)(OTUs)計算布雷柯蒂斯(Bray-Curtis)距離,并基于Bray-Curtis 距離矩陣進行了主坐標分析(PCoA)(圖3)。對于枝樣品,PCoA1解釋了總方差的46.94%,PCoA2解釋了17.55%,HB和SB在PCoA1上出現(xiàn)了明顯的分異(r=0.772 2,p=0.003 000)。對于葉樣品,PCoA1解釋了總方差的37.52%,PCoA2解釋了23.70%,SL與HL在PCoA1出現(xiàn)了明顯的分異(r=0.537 0,p=0.009 000)。對于根樣品,PCoA1解釋了總方差的60.81%,PCoA2解釋了24.22%,HR和DR分異較小(r=-0.033 3,p=0.704 000)。這些結(jié)果表明,叢枝病顯著改變了枝和葉中真菌群落結(jié)構(gòu),但未顯著改變根中真菌群落結(jié)構(gòu)。

A:葉樣品;B:枝樣品;C:根樣品。A: Leaf samples; B: Branch samples; C: Root samples.

2.4 叢枝病對內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

通過分析門水平上內(nèi)生真菌群落組成發(fā)現(xiàn)(圖4),在泡桐的枝、葉和根中,子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)是豐度最大的兩個門,豐度之和高達97.22%～99.80%。子囊菌門是豐度最高的門,豐度達到82.21%～98.07%,其次為擔子菌門,豐度為1.72%～15.01%。叢枝病提高了枝和葉中擔子菌門的豐度,而降低了子囊菌門的豐度;在根中,叢枝病降低了擔子菌門的豐度,而提高了子囊菌門的豐度,此外叢枝病還降低了unclassified_k__Fungi的豐度。這些結(jié)果表明,叢枝病對泡桐門水平上的內(nèi)生真菌群落組成有一定的影響。

圖4 叢枝病對泡桐內(nèi)生真菌群落門水平組成的影響Fig.4 Effects of witches’ broom on fungal endophytes community composition in the phylum level in Paulownia

2.5 叢枝病對關(guān)鍵內(nèi)生真菌物種的影響

為了研究影響泡桐健康狀況對關(guān)鍵真菌物種豐度(即生物標志物)的影響,本研究使用隨機森林機器學習法對數(shù)據(jù)進行了分析(圖5)。結(jié)果表明在屬和種水平,內(nèi)生真菌對植物健康狀況具有最高的預(yù)測準確率(67.57%)(圖5A)。隨后使用5次重復(fù)10次交叉驗證,評估了隨機森林模型隨物種數(shù)量變化對泡桐健康狀況預(yù)測的準確率變化。結(jié)果表明,當屬的數(shù)量增加到10時,模型具有最優(yōu)的預(yù)測準確率(65%)(圖5B)。10個屬被鑒定為關(guān)鍵真菌物種分別是枝孢屬(Cladosporium)、Uncla-ssified_o__Pleosporales、離蠕孢屬(Bipolaris)、柱隔孢屬(Ramularia)、棒孢屬(Corynespora)、Unclassified_c__Sordariomycetes、漢納酵母屬(Hannaella)、Nigrospora、盾殼霉屬(Coniothyrium)、Titaea(圖5C)。

A:不同分類等級的內(nèi)生真菌對泡桐健康狀況預(yù)測的準確性;B:在隨機森林模型中屬水平內(nèi)生真菌數(shù)量變化對模型預(yù)測準確性的影響;C:對隨機森林模型預(yù)測準確性影響最大的十個內(nèi)生真菌生物標志物。A: The accuracy of endophytic fungi of different taxonomic grades in predicting the health status of Paulownia; B: The effect of genus level endophytic fungus numbers changes on the prediction accuracy of random forest model; C:Ten endophytic fungal biomarkers that had the greatest influence on the prediction accuracy of random forest model.

進一步分析發(fā)現(xiàn)5個關(guān)鍵真菌物種在SL和HL中存在顯著差異(圖6),分別為Unclassified_o__Pleosporales、Coniothyrium、Hannaella、Cladosporium、Corynespora,其在SL樣品中的豐度分別為12.70%、8.63%、5.84%、5.26%和0.13%,分別高于在HL樣品中的豐度(0.16%、0.05%、0.01%、0.81%和0.00%)(p<0.05)。4種真菌在HB和SB樣品存在顯著差異,其中Corynespora、Cladosporium和Nigrospora在SB中的豐度分別為10.33%、8.14%和1.12%,均顯著大于在HB樣品中的豐度(0.52%、0.79%和0.08%)(p<0.05),而Ramularia在SB樣品中的豐度(0.07%)小于HB樣品(3.51%)。在SR和HR樣品中,所有真菌豐度均無顯著差異(p>0.05)。

A:葉樣品;B:枝樣品;C:根樣品。A: Leaf samples; B: Branch samples; C: Root samples.

3 結(jié)論與討論

泡桐叢枝病主要表現(xiàn)在地上部(枝和葉),關(guān)于根部的發(fā)病狀況未見報道[11]。本研究結(jié)果表明,在叢枝病的枝中含有植原體,而在健康枝中未檢測到植原體,表明植原體是導(dǎo)致叢枝病的主要原因。但在發(fā)病樹的根中盡管也檢測到了植原體,但是根部并不表現(xiàn)出發(fā)病癥狀,表明叢枝病不會導(dǎo)致地下部明顯的病變[11]。

植物發(fā)生病害時可導(dǎo)致植物內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[12-13],而植物內(nèi)生微生物群落也會因生境的不同而異[14]。本研究發(fā)現(xiàn),生境和健康狀況均是影響內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的重要影響因素。叢枝病僅提高了枝中真菌群落的香農(nóng)指數(shù),但未改變?nèi)~和根中真菌群落的香農(nóng)指數(shù);此外,叢枝病未顯著改變枝、葉和根中真菌群落的Chao1指數(shù)?？傮w來說,叢枝病對泡桐真菌α多樣性影響有限。在枝和葉樣品中,叢枝病顯著改變了真菌群落β多樣性,而未顯著影響根樣品中真菌群落β多樣性。綜合以上結(jié)果,叢枝病對地上部真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大,而對根部真菌群落結(jié)構(gòu)影響不大,這可能是泡桐地上部表現(xiàn)出叢枝病而根部未表現(xiàn)出發(fā)病癥狀的重要原因之一。

隨機森林機器學習法分析結(jié)果表明,泡桐叢枝病發(fā)病過程中存在10個關(guān)鍵的真菌物種。在患病枝和健康枝中有5種關(guān)鍵真菌物種(Unclassified_o__Pleosporales、Coniothyrium、Hannaella、Cladosporium和Corynespora)豐度存在顯著差異,且在發(fā)病樣品中的豐度均顯著高于健康樣品。在患病葉和健康葉有4種關(guān)鍵真菌物種存在顯著差異,其中Corynespora、Cladosporium、Nigrospora的豐度在患病葉中的豐度顯著高于健康葉,而Ramularia在患病葉中的豐度顯著低于健康葉。所有關(guān)鍵真菌物種豐度在患病和健康泡桐的根中無顯著差異。也就是說叢枝病提高了多數(shù)關(guān)鍵真菌物種在地上部的豐度,在這些真菌中,某些已經(jīng)證明具有致病能力。例如,棒孢屬中的多主棒孢 (Corynesporacassiicola)是一種重要的植物病原真菌,寄主范圍廣泛,能夠侵染530余種植物[15]。棒孢屬的另一種真菌Corynesporacassiicola可引起獼猴桃的葉斑病[16]。枝孢菌廣泛分布于空氣、土壤、食品、水體中,可作為病原菌侵染多種作物,葡萄的枝孢果腐病病原菌就是由枝孢菌中的枝狀枝孢(Cladosporiumcladosporioides)和檸檬形枝孢(Cladosporiumlimoniforme)引起的[17]。Nigrospora屬中的Nigrosporasphaerica可引起芒果枝枯病和葉斑病[18],Nigrosporaosmanthi可以引起桂花葉枯病[19]。這些結(jié)果表明,泡桐爆發(fā)叢枝病后,枝和葉中某些致病真菌也隨之大量增殖,進而加劇了叢枝病對泡桐的危害程度。這種現(xiàn)象在其他林木中也有發(fā)現(xiàn),例如桃樹爆發(fā)流膠病時也有致病真菌增加的現(xiàn)象[12]。這些結(jié)果有助于加深對泡桐叢枝病爆發(fā)機制的認識,并為叢枝病的防治奠定理論基礎(chǔ)。