鄒東方,陳滎,李佳俊,李志謙,葉霞,何暢,馮建燦

(河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院,河南 鄭州 450002)

葡萄果實形狀、硬度和著色等外觀品質,可溶性固形物和總酸等內在品質是葡萄果實品質的重要組成部分,也是影響葡萄商品價值的因素之一,其中果皮色澤是決定鮮食葡萄和葡萄酒顏色的主要因素之一[1]。隨著消費水平的提高,消費者對葡萄品質的要求逐漸升高,安全有效的促進果實著色,提升果實品質逐漸成為研究的熱點。

近年來,許多研究表明,使用植物生長調節(jié)劑、氨基酸和抗氧化劑等[2-4]可能是顯著提高水果品質的可行策略。脫落酸(abscisic acid,ABA)作為一種重要的植物激素和信號分子,在植物發(fā)育、逆境反應和果實成熟過程中起著重要作用[5-6],其生物合成和信號轉導機制已經(jīng)在模式植物中得到了廣泛研究?；ㄇ嗨厥峭ㄟ^類黃酮生物合成途徑合成的,葡萄色澤的積累主要與果實的成熟有關,ABA通過激活花色苷生物合成基因VvCHS、VvDFR、VvUFTG等和相關轉錄因子VvMYBPA1/2、VvMYBPA1/2、VvMYB5a/5b和VvMYBA1/2的表達促進葡萄花色苷的積累[7]。一些研究表明,在干旱脅迫條件下,克瑞森無核葡萄果實中較高的花青素含量可能是由于ABA水平的增加造成的[8-9]。葉綠素是綠色植物葉綠體內參與光合作用的重要色素,葉綠素的積累是果實早期成熟階段呈現(xiàn)綠色的重要原因[10]。HU等[11]研究表明,ABA處理后,加速了果皮中葉綠素的降解。在柑橘、葡萄、黃瓜中,ABA處理促進花青素和糖的積累,降低有機酸含量和果皮中葉綠素含量,促進果實成熟[12-14]。

本研究以‘紫甜無核’葡萄品種為材料,在轉色前10 d用質量濃度300 mg·L-1的ABA溶液對果穗進行蘸穗處理,觀察果實顏色的變化,檢測果實成熟相關指標的含量及相關通路基因的表達,分析ABA對果實轉色和成熟的影響,為進一步促進葡萄果實著色、提高果實品質奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為定植于河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)的紫甜無核葡萄,南北行向,單干雙臂整形。在轉色前10 d對果穗進行蘸穗處理,選取穗型、大小、成熟度一致的葡萄植株,掛牌標記。處理方法:用300 mg·L-1的ABA(solarbio,北京)溶液浸泡果穗,以清水作為對照處理(CK)。分別在處理后0、7、14和21 d采集樣品,每個處理采集5穗葡萄。將葡萄樣品立即放置于液氮中,帶回實驗室,凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 果實內源激素ABA含量測定

以異丙醇-水-鹽酸提取植物樣品內源性激素,利用ESI-HPLC-MS/MS 方法對植物激素進行定量分析,以安捷倫(Agilent)1290 高效液相色譜儀串聯(lián) AB Sciex QTRAP 6500+質譜儀測定植物內源性激素ABA含量,所有樣品各重復3次。

1.3 單粒質量、縱橫徑、可溶性固形物、總酸、硬度指標測定

葡萄樣品于實驗室中剪成單獨果?；靹?每組樣品隨機選取20粒,采用電子天平(最小量度為0.01 g)進行果粒質量測量;與葡萄果實赤道線垂直的最大長度為縱徑,與果實赤道線平行的最大寬度為橫徑,每組樣品隨機選取20粒,采用游標卡尺(最小量度為0.01 cm)進行果?？v橫徑的測量;每組樣品隨機選取20粒,擠出汁液混勻,采用手持式折光儀測定果實可溶性固形物(TSS)含量,參考曹健康等[15]方法測量總酸(TA)含量;每組樣品隨機選取20～30粒,使用質構儀進行硬度測量,記錄峰值,結果用平均值表示。

1.4 果肉果膠含量、纖維素及半纖維素含量、果皮葉綠素含量和花青素含量的測定

參考曹健康等[15]方法,測定原果膠和可溶性果膠含量;細胞壁纖維素和半纖維素含量均使用試劑盒測定(CLL-1-Y,BXW-1-G,科銘生物,江蘇蘇州),測定方法均參考試劑盒說明書;將每組樣品的果皮于液氮中研磨成粉末,取0.1 g置入1.5 mL離心管中,避光加入1 mL 體積分數(shù)95%乙醇浸提,待組織變?yōu)榘咨?取200 μL浸提液于酶標板中,在酶標儀中分別測定波長649、665 nm下的吸光度,3次重復。按照公式(1)～(5)計算葉綠素含量:

葉綠素a質量濃度=
13.95×A665-6.88×A649

(1)

葉綠素b質量濃度=
24.96×A649-7.32×A665

(2)

葉綠素a含量=葉綠素a質量
分數(shù)×浸提液總量/質量×0.001

(3)

葉綠素b含量=葉綠素b質量
分數(shù)×浸提液總量/質量×0.001

(4)

葉綠素質量分數(shù)=葉綠素a
質量分數(shù)+葉綠素b質量分數(shù)

(5)

參考曹健康等[15]方法,測定花青素含量,利用甲醇溶液提取果皮中的花青素,利用紫外可見分光光度計測量波長530、600 nm處吸光度值,兩者差值表示花青素含量。

1.5 葉綠素降解途徑相關基因、花色苷途徑相關基因、ABA途徑相關基因的定量表達分析

總RNA提取使用諾唯贊公司FastPure Plant Total RNA Isolation Kit試劑盒(RC401-01,江蘇南京)。使用諾唯贊公司HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒(R323-01,江蘇南京)合成cDNA第一鏈。利用Primer 5.0軟件設計特異性定量引物,以GAPDH作為內參基因。qRT-PCR引物序列如表1所示,于Applied Biosystems 7500 FAST熒光定量儀進行實時熒光定量分析。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT方法[16]。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primer information for qRT-PCR

1.6 數(shù)據(jù)分析

每個試驗設置3個生物學重復,利用SPSS 24.0軟件進行獨立樣本t檢驗(p<0.5),利用GraphPad Prism 8軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 ABA處理后葡萄果實的著色情況

觀察發(fā)現(xiàn),處理后7 d,ABA處理的果皮開始著色,而對照處理的果皮仍保持綠色;處理后14 d,對照處理的果皮開始著色,ABA處理的果皮大部分呈現(xiàn)紫紅色;處理后21 d,對照處理的果皮仍有部分果粒未著色,ABA處理的果皮呈現(xiàn)出均勻的紫紅色(圖1)。由此說明,ABA處理能夠顯著促進‘紫甜無核’果實著色。

圖1 ABA處理對‘紫甜無核’葡萄著色的影響Fig.1 The effects of ABA on the berry coloring in ‘Zitian seedless’ grape

2.2 ABA處理對葡萄果實ABA質量分數(shù)的影響

為研究處理后果實中ABA質量分數(shù)的變化,本研究對處理后果實中的ABA質量分數(shù)進行了測定。結果顯示,ABA處理后果實中,ABA質量分數(shù)明顯升高,在處理后7 d,果實中ABA質量分數(shù)達到最大值,隨著處理后時間的延長,果實中ABA含量逐漸降低,但均顯著高于對照處理(圖2)。說明ABA處理后果實中ABA質量分數(shù)升高。

注:“*”表示與對照相比在0.05水平上差異顯著,“**”表示與對照相比在0.01水平上差異顯著。下同。Note:“*”indicates the significant difference at 0.05 level compared with the control; “**”indicates the significant difference at 0.01 level compared with the control. The same as below．

2.3 ABA處理對葡萄果實生長和品質指標的影響

‘紫甜無核’經(jīng)ABA處理后,果實的單粒質量、縱徑、橫徑、TSS、TA、硬度、花青苷含量、葉綠素含量均發(fā)生不同程度的變化(表2)。ABA處理后,各時期果實的單粒質量、縱徑、橫徑,均顯著高于對照處理,硬度顯著低于對照處理。ABA處理中,0～7 d果實硬度下降趨勢最大,隨后7、14和21 d硬度變化并不大,但均顯著低于對照處理;對照處理中,7～14 d果實硬度下降趨勢最大。結果表明,ABA處理促進‘紫甜無核’果實的生長。

表2 ABA處理后生長和成熟相關指標變化Table 2 Changes of growth and ripening parameters in response to ABA treatment

ABA處理后,各時期果實的可溶性固形物和花青苷含量均顯著高于對照處理,總酸(TA)和葉綠素含量均顯著低于對照處理。其中花色苷含量,對照處理從14 d開始升高,ABA處理從7 d開始升高,與葡萄果實轉色時期一致。結果表明,ABA處理可以促進葡萄果實的成熟。

2.4 ABA處理對葡萄果實細胞壁物質含量的影響

細胞壁物質的變化是果肉硬度下降的主要因素,ABA處理后,果實硬度明顯降低,為進一步分析ABA對細胞壁物質的影響,本研究測定了ABA處理后果實中細胞壁相關物質的變化。在葡萄果實成熟過程中,原果膠含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(表3),ABA處理后3個時期的原果膠含量與對照處理相比,分別降低了25.27%、36.59%、31.11%,均顯著低于對照處理;可溶性果膠含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(表3),3個時期的可溶性果膠含量與對照處理相比,分別升高了的13.56%、28.02%、5.2%,均顯著高于對照處理。原果膠和可溶性果膠含量變化與葡萄果實硬度的變化呈正相關關系,果實越軟,原果膠含量越低,可溶性果膠含量越高。

表3 ABA處理后葡萄果實可溶性果膠、原果膠、纖維素和半纖維素含量的變化Table 3 Changes of WSP,propectin,cellulose,hemicelluloses content in grape fruit in response to ABA treatment

纖維素和半纖維素含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(表3),ABA處理后3個時期的纖維素含量分別是對照處理的89.39%、75.24%、72.38%,半纖維素含量分別是73.5%、48.34%、49.11%。半纖維素含量的前期變化較為顯著,后期與對照相比無顯著差異;纖維素含量的后期變化較為顯著,前期與對照相比無顯著差異。

2.5 葡萄花青苷途徑相關基因在果實成熟過程中的表達分析

為了進一步闡明ABA介導的花青苷在葡萄果實中的生物合成與積累的分子機制,本研究分析了花青素合成相關的轉錄調控基因和生物合成基因的表達水平。ABA處理后7 d,花青素生物合成基因VvCHS2、VvCHS3、VvF3H1、VvF3′5′H、VvLDOX、VvUFGT、VvOMT表現(xiàn)出一致的表達模式,總體呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(圖3),這些基因的表達量在14 d最高,除VvCHS3表達量在21 d最高,均顯著高于對照處理;轉錄調控基因VvMYBA1的表達量差異最為顯著,在處理后14 d達到最高。結果表明花青苷途徑基因表達的變化與花青苷含量變化的趨勢一致,在葡萄果實開始著色時基因的表達量顯著升高,著色后期逐漸下降。

圖3 ABA處理后花青素途徑相關基因表達量的變化Fig.3 Changes of anthocyanin related genes expression in response to ABA treatment

2.6 葡萄葉綠素降解途徑相關基因在果實成熟過程中的表達分析

ABA處理后,果皮中葉綠素含量明顯降低,本研究進一步分析了葉綠素降解途徑基因的表達。在葡萄果實的成熟過程中,VvNYC、VvPAO、VvPAO1的表達量總體呈現(xiàn)上升趨勢,VvNOL、VvCLH2、VvPPH、VvRCCR的表達量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,VvCLH1的表達量呈現(xiàn)下降趨勢(圖4);ABA處理后,VvNYC、VvPAO的表達量總體呈現(xiàn)上升趨勢,VvNOL的表達量呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢,VvCLH2的表達量在處理后21 d時顯著高于對照,VvPPH、VvPAO1、VvRCCR的表達量在處理后7 d達到最高。結果表明,ABA可能通過調節(jié)葉綠素降解途徑相關基因的表達進而調控葉綠素的降解。

圖4 ABA處理后葉綠素降解途徑相關基因表達的變化Fig.4 Expression changes of chlorophyll degradation related genes in response to ABA treatment

2.7 葡萄ABA途徑相關基因在果實成熟過程中的表達分析

為了了解葡萄果實發(fā)育和成熟過程中ABA含量變化的原因,檢測了ABA生物合成、轉錄和代謝相關基因的表達變化。VvNCED的表達在ABA處理后無明顯變化,在對照中呈現(xiàn)上升趨勢,且在21 d表達最高;VvBG1的表達在ABA處理后7 d最高,VvHYD1、VvUBI的表達量在處理后14 d最高,VvGT1的表達在處理后被抑制,VvHYD2的表達呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢;VvABCG25、VvABCG40的表達在ABA處理后被抑制(圖5)。

圖5 ABA處理后ABA途徑相關基因表達量的變化Fig.5 Changes of ABA related genes expression in response to ABA treatment

3 結論與討論

ABA作為一種重要的植物激素和信號分子,在植物器官發(fā)育、逆境反應和果實成熟過程中發(fā)揮著關鍵作用[5-6]。已有研究表明,ABA處理顯著促進了桃果實糖的積累[17]。張林山等[18]研究表明,葡萄轉色期使用ABA溶液浸泡果穗,能夠顯著提高果實的單粒質量和縱橫徑,本研究與其研究結果一致,推測ABA能夠加速葡萄果實的生長,從而提高果實單粒質量和縱橫徑。在葡萄上噴施ABA有助于花青素、類黃酮、白藜蘆醇和其他酚類物質的積累[19-20]。本試驗在葡萄轉色前10 d通過ABA處理葡萄果實,提高果實單粒質量、縱橫徑,加速果實的生長,促進可溶性固形物的積累,降低果實總酸含量,提高葡萄果實品質,并且顯著增加了花青素含量,加速果實成熟過程。研究結果表明,ABA在葡萄生長成熟過程中起促進作用。

葡萄果實的軟化是果實成熟的顯著特征之一。已有研究表明,非呼吸躍變型果實葡萄[21]、草莓[22]、櫻桃[23],ABA處理可降低這些果實的硬度。果實成熟軟化是由于在水解酶和擴展蛋白作用下,細胞壁物質(果膠、纖維素和半纖維素)的結構發(fā)生變化[24-25]。在巨峰葡萄果實軟化過程中,果膠、纖維素和半纖維素含量的降低是前期硬度下降的主要原因之一[24]。本研究結果表明, ABA處理通過促進原果膠、纖維素和半纖維素含量的降低,可溶性果膠含量的升高,從而加速果實軟化。

果實的顏色是影響消費購買水果的重要因素之一,其中果實的與ABA的含量密切相關[26]。植物激素在植物的生長、發(fā)育、成熟和衰老過程中并不獨立起作用,它們在植物激素相互作用的復雜網(wǎng)絡中共同調節(jié)一系列植物生命活動[27-28]?；ㄇ嗨氐暮亢徒M分決定了葡萄果皮的顏色,已有研究表明,基因型、溫度、光照和植物激素等內外因素影響其含量和組分[29-33]。在植物激素應用方面,ABA可以促進果實著色[34-36]。本研究結果表明, ABA處理可以加速葡萄果皮中花青素的積累,增加了花青素生物合成基因VvCHS2、VvCHS3、VvF3H1、VvF3′5′H、VvLDOX、VvUFGT、VvOMT以及關鍵調控基因VvMYBA1的表達,這一結果與前人研究結果相似[7]。本研究結果表明,上述基因的表達趨勢與ABA含量的變化趨勢一致,說明葡萄果實成熟過程中,ABA含量的增加是引起花色苷合成的重要信號,ABA處理促進了葡萄果皮花色苷含量的積累。

已有研究表明, ABA處理促進了果實成熟過程,包括花青素生物合成、果實大小的增加以及葉綠素的降解[37-38]。在葡萄‘紫甜無核’成熟過程中,果實顏色從綠-紅-紫紅的轉變,主要是由于經(jīng)歷了花色苷積累和葉綠素降解的過程。本研究結果顯示,花青素含量的變化趨勢與葉綠素含量的變化趨勢相反,且花青素含量上升時期與葉綠素含量下降時期一致, ABA處理后,葉綠素降解途徑基因VvNYC和VvPAO的表達量總體呈現(xiàn)上升趨勢;7 d時ABA處理的果實顏色處于從綠-紅的轉變時期,對照組果實顏色未發(fā)生變化(圖1),此時VvNOL的表達量顯著下調,VvNYC、VvCLH1、VvPPH、VvPAO1、VvPAO2、VvRCCR的表達量顯著上調;其中PPH酶是催化脫鎂葉綠a(Phein a)形成脫鎂葉綠酸a(Pheide a)的關鍵酶,PAO酶是Pheide a轉化成紅色葉綠素代謝產(chǎn)物(red chlorophyll carabolite)的關鍵酶[39-40],因此推測ABA促進紫甜無核葡萄果皮葉綠素降解主要是通過上調VvPPH和VvPAO的表達,從而加快果實褪綠過程[41]。

張培安等[42]研究表明,ABA可促進果實中ABA含量的增加,本研究中ABA處理顯著增加了果實中ABA含量的積累,顯著提高了VvHYD1、VvBG1的表達,果實中ABA含量在7～14 d時下降幅度較大,推測可能是受到這兩個代謝基因的高表達影響。ABA處理后,抑制了VvABCG25和VvABCG40的表達,推測ABA可能通過負反饋機制調控這兩個基因的表達,SUN等[43]研究表明,LeNCED2在未成熟階段表達較高,隨著成熟逐漸下降,推測是ABA處理后VvNCED的表達受到抑制的原因之一。

綜上所述,ABA處理能夠促進果實生長,原果膠、纖維素、半纖維素含量的降解和可溶性果膠含量的積累,加速果實軟化;誘導VvHYD1、VvBG1的表達導致ABA含量上升,提高VvMYBA1、VvCHS2、VvCHS3、VvF3′5′h和VvUFGT的表達,促進果皮中花青素的積累,同時伴隨著葉綠素含量的下降,推斷主要是通過上調葉綠素降解關鍵基因VvPPH和VvPAO的表達,從而促進葡萄果實成熟,提高果實品質。