聚苯乙烯微塑料和納米氧化鋅對(duì)錦鯽的復(fù)合生物效應(yīng)

周海玲,王靜,艾弗遜,王曉琳,尹穎

（污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京，210023）

顆粒態(tài)污染物由于獨(dú)特的性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活，但在生產(chǎn)運(yùn)輸及使用中難以避免進(jìn)入環(huán)境并產(chǎn)生生態(tài)效應(yīng)，在環(huán)境中常常通過(guò)吸附、絡(luò)合等途徑與其他污染物相互作用，最終毒性表現(xiàn)出協(xié)同或拮抗作用.例如微塑料（MPs）可通過(guò)吸附作用減少納米銅及Cu2+的毒害作用，降低對(duì)中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的毒性［1］，但同時(shí)也可與納米金表現(xiàn)出協(xié)同作用，增強(qiáng)對(duì)大型蚤（Daphnia magna）的生殖毒性并誘導(dǎo)子代死亡［2］.

納米氧化鋅（ZnO NPs）作為一種常見(jiàn)的顆粒態(tài)污染物，憑借其優(yōu)良性質(zhì)被廣泛應(yīng)用，同時(shí)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及其中的生物產(chǎn)生作用［3］.研究表明，ZnO NPs 可對(duì)生物造成氧化損傷［4］，還具有胚胎毒性和神經(jīng)毒性［5］等.Kaya et al［6］報(bào)道了ZnO NPs 對(duì)尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）的不同器官都造成了一定程度的氧化損傷，且粒徑為10～30 nm 的ZnO NPs 毒性強(qiáng)于粒徑為100 nm 的ZnO NPs.劉倩等［7］研究ZnO NPs 對(duì)D.magna的效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)ZnO NPs 可以黏附在D.magna腸道和體表，從而對(duì)其產(chǎn)生個(gè)體及行為毒性.

MPs 因其粒徑小，比表面積大，所以具有較強(qiáng)的吸附能力，可以吸附環(huán)境中的重金屬［8］及各種污染物［9］，并作為載體改變它們?cè)谏矬w內(nèi)的積累情況和生物毒性，最終產(chǎn)生的毒性表現(xiàn)為協(xié)同、相加和拮抗作用［10-11］.MPs 可改變貽貝（Perna viridis）對(duì)全氟辛烷磺酸類(lèi)物質(zhì)的氧化應(yīng)激響應(yīng)，使內(nèi)臟中MDA 含量升高［12］.粒徑為50 nm 的聚苯乙烯MPs（Polystyrene Microplastic，PS MPs）和菲共暴露對(duì)D.magna的毒性具有相加效應(yīng)［11］，在14 d 的培養(yǎng)過(guò)程中PS MPs 顯著增加了生物體內(nèi)的菲累積.目前對(duì)于MPs 與其他污染物的復(fù)合效應(yīng)，研究對(duì)象多為有機(jī)污染物和重金屬，而與納米金屬氧化物的復(fù)合影響研究較少，兩種典型的顆粒態(tài)污染物是否會(huì)在水生態(tài)系統(tǒng)中不穩(wěn)定或易沉降，從而改變污染物的生態(tài)效應(yīng)，現(xiàn)階段鮮見(jiàn)報(bào)道.

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度PS MPs 與ZnO NPs 的共暴露實(shí)驗(yàn)，研究?jī)烧咴谒h(huán)境中的賦存狀態(tài)及其對(duì)錦鯽的生物效應(yīng)，為MPs 和納米金屬氧化物對(duì)水生態(tài)環(huán)境的影響及機(jī)制研究提供更多的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑ZnO NPs（上海麥克林生化科技有限公司，中國(guó)）粒徑為（30±10）nm，純度99.9%.苯乙烯（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）使用前先經(jīng)減壓蒸餾純化處理去除所含阻燃劑.錦鯽（Carassius auratus）購(gòu)于南京市夫子廟花鳥(niǎo)市場(chǎng).

PS MPs 的制備：采用分散聚合的方式制備實(shí)驗(yàn)所用PS MPs［13］，向140 mL 純水中充入N210 min 后，保持180 r·min-1滴加苯乙烯，在室溫下攪拌分散10 min.再加入10 mL 已通N25 min 的過(guò)硫酸鉀溶液（23 g·L-1），調(diào)節(jié)N2流速至平衡系統(tǒng)勻速冒泡.之后使用油浴鍋（98-3 型，予華儀器有限公司，中國(guó)）在78 ℃條件下加熱1～2 h，繼續(xù)反應(yīng)24 h.反應(yīng)過(guò)程中持續(xù)通入N2防止產(chǎn)物發(fā)生氧化，連續(xù)合成24 h 后取出產(chǎn)物洗滌純化.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的健康錦鯽分別暴露于設(shè)置的濃度條件下（表1），每組八條魚(yú)，每缸中共30 L 暴露液.經(jīng)10 d 適應(yīng)階段及馴養(yǎng)階段，前3 d 為適應(yīng)階段，不喂食不換水，后續(xù)7 d 為馴養(yǎng)階段，間隔一天換水喂食，之后開(kāi)始暴露實(shí)驗(yàn).本研究采取靜態(tài)暴露，按照對(duì)應(yīng)濃度分別稱取PS MPs 和ZnO NPs 粉末加入到100 mL 超純水中，超聲分散10 min 后轉(zhuǎn)移到魚(yú)缸中.暴露實(shí)驗(yàn)持續(xù)兩周，其間采用半換水法.

表1 各處理組污染物濃度Table 1 The materials and contents of each group

1.3 樣品采集暴露結(jié)束后撈出錦鯽，用超純水沖洗干凈皮膚，稱重后迅速解剖，剪下左側(cè)魚(yú)肉，取出肝臟稱重后制成肝臟勻漿，經(jīng)低速離心后取上清液用于測(cè)定.之后依次取出性腺、腸道、鰓、眼、腦并稱重，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?

1.4 分析方法PS MPs 與ZnO NPs 的形貌表征：分別取少量?jī)煞N固體粉末在透射電子顯微鏡（TEM，JEM-2100，JEOL Ltd.，日本）下采集圖像，使用Nano Measure 1.2 軟件統(tǒng)計(jì)兩種顆粒污染物粒徑.

水體粒徑及Zeta 電位的測(cè)量：準(zhǔn)確稱量適量PS MPs 與ZnO NPs 粉末，加入100 mL 超純水中，超聲分散10 min 后，再稀釋至所需濃度（表1），并使用納米粒度及Zeta 電位分析儀（Zetasizer NaNo ZS，英國(guó)馬爾文公司，英國(guó)）測(cè)定兩種污染物水合粒徑及體系Zeta 電位［14］.

水中Zn2+釋放量的測(cè)定：取水樣加入硝酸酸化，在4 ℃條件下3500 r·min-1離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，利用ICP-MS（Nex-ION 300X，Perkinelmer，USA）測(cè)定水體中溶解鋅的濃度［15］.

組織中Zn 富集量的檢測(cè)：組織對(duì)Zn 的富集量按照劉林［16］的方法進(jìn)行測(cè)定.樣品經(jīng)解凍、干燥、稱重后，加入5 mL 濃硝酸預(yù)消解12 h，控制溫度為90 ℃消解1 h，在120 ℃條件下繼續(xù)消解至溶液剩余1 mL.加入5 mL 濃硝酸和1 mL 高氯酸，消解至無(wú)白煙，再加入10 mL 硝酸（2%），轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，用硝酸（2%）定容.混勻后過(guò)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，取5 mL 消解液用ICPMS 測(cè)定Zn 含量（dw，mg·kg-1）.

肝臟組織氧化損傷指標(biāo)的測(cè)定：蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，以小牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，加入考馬斯亮藍(lán)顯色劑混勻，反應(yīng)2 min 后使用紫外-分光光度計(jì)在595 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算蛋白含量.超氧化物酶活性（SOD）、丙二醛含量（MDA）及活性氧水平（ROS）分析試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，將制備的勻漿液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行測(cè)定.

1.5 數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并采用單變量方差分析和協(xié)方差分析（One Way ANOVA）確定處理組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以p＜0.05 來(lái)表示顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 TEM 表征圖1 為透射電鏡（Transmission Electron microscope，TEM）下PS MPs 與ZnO NPs 的形貌圖，可以看出，PS MPs 呈規(guī)則球狀，外表光滑，粒徑約為430 nm；ZnO NPs 多為不規(guī)則的塊狀和顆粒狀，粒徑分布為23.17±14.72 nm（n=400），顆粒大小差異較大，有明顯團(tuán)聚.

圖1 PS MPs (A)與ZnO NPs (B)的TEM 圖像Fig.1 TEM images of PS MPs (A) and ZnO NPs (B)

2.2 水合粒徑顆粒態(tài)污染物在水體中通常表現(xiàn)出較強(qiáng)的團(tuán)聚性，影響其生物可利用性.實(shí)驗(yàn)中ZnO NPs 的水合粒徑為（425.8±32.08）nm，在水中發(fā)生明顯聚集，在與PS MPs 復(fù)合后，粒徑分別增大至（568.0±62.99）nm 和（581.8±24.42）nm（p＜0.05），PS MPs 的濃度對(duì)ZnO NPs 的水合粒徑無(wú)影響.PS MPs 在水中同樣也發(fā)生聚集，但濃度與復(fù)合對(duì)其粒徑無(wú)顯著影響.加入ZnO NPs 后，1 mg·L-1與10 mg·L-1的PS MPs 粒徑分別為（572.7±24.39）nm 與（594.8±13.28）nm，組間不存在顯著差異.如圖2 所示.

圖2 PS MPs 與ZnO NPs 水體粒徑Fig.2 Particle size of PS MPs and ZnO NPs in water

2.3 Zeta 電位Zeta 電位可反映膠體分散體系的穩(wěn)定性，影響顆粒物的聚集與離子釋放.一般認(rèn)為Zeta 電位在-30～30 mV 時(shí)物質(zhì)處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，小于-30 mV 或者大于30 mV 時(shí)，體系具有良好的穩(wěn)定性和分散性［17］.單一ZnO NPs 的Zeta 電位約為-14 mV，而單一PS MPs 的Zeta 電位接近-30 mV（圖3），PS MPs 在水中介穩(wěn)性高于ZnO NPs.與ZnO NPs 相比，ZnO NPs 與PS MPs 復(fù)合后Zeta 電位絕對(duì)值顯著增大（p＜0.05），在水體中穩(wěn)定性增強(qiáng).1 mg·L-1PS MPs 復(fù)合組的Zeta 電位絕對(duì)值低于10 mg·L-1PS MPs復(fù)合組，表明濃度會(huì)影響復(fù)合體系的穩(wěn)定性.

圖3 不同組別水體的Zeta 電位Fig.3 Zeta potential of different groups

2.4 水體中Zn2+的含量金屬離子的釋放是納米金屬顆粒造成水生生物毒性的主要原因［18］.實(shí)驗(yàn)中未添加ZnO NPs 的三組水體中鋅含量極低，單一ZnO NPs 組、1 mg·L-1PS MPs 復(fù)合組以及10 mg·L-1PS MPs 復(fù)合組的Zn2+溶出率分別為64.6 %，62.9 %，58.5%（圖4），10 mg·L-1PS MPs 復(fù)合組水體中Zn2+含量顯著低于前兩組（p＜0.05），表明10 mg·L-1PS MPs 復(fù)合可減少ZnO NPs 中Zn2+的釋放，從而可能降低其帶來(lái)的毒性效應(yīng).

圖4 養(yǎng)殖水體中Zn2+的釋放量Fig.4 Release of Zn2+ in aquaculture water of different groups

2.5 Zn 在錦鯽各組織中的分布金屬氧化物顆粒及其溶解釋放出的金屬離子可通過(guò)多種途徑蓄積在靶器官中，并對(duì)生物產(chǎn)生毒性.Zn 在錦鯽各器官中含量排序?yàn)椋耗c＞眼＞鰓＞肉＞性腺＞腦（表2）.相較于ZnO NPs 單一脅迫，復(fù)合脅迫對(duì)腸道、魚(yú)肉、鰓和性腺中Zn 含量并無(wú)顯著作用；在眼部，PS MPs 的添加與濃度均可影響Zn 的富集，ZnO NPs 單一脅迫下Zn 含量為（426.1±95.4）mg·kg-1，10 mg·kg-1PS MPs 復(fù)合后Zn 含量顯著增大（（555.8±154.2）mg·kg-1），高濃度PS MPs（10 mg·kg-1）可促進(jìn)眼中Zn 的富集；與眼部不同的是，在富集量最低的腦中，低濃度 PS MPs（1 mg·L-1）復(fù)合后可抑制腦中Zn 的轉(zhuǎn)運(yùn)與富集（p＜0.05），而高濃度則無(wú)顯著影響.

表2 錦鯽各器官Zn 的富集量(單位：mg·kg-1)Tab.2 Zn accumulation in different organs of Carassius auratus (unit: mg·kg-1)

2.6 肝臟組織的氧化損傷指標(biāo)污染物對(duì)生物的毒性通常包括氧化損傷作用，具體表現(xiàn)為相關(guān)生物標(biāo)志物含量產(chǎn)生變化.由圖5 可知，相較空白組，各組SOD 活性和ROS 均未產(chǎn)生顯著差異；ZnO NPs 和PS MPs 單一脅迫都未影響肝臟細(xì)胞MDA 含量，但1 mg·L-1PS MPs 復(fù)合后MDA 含量顯著升高（p＜0.05），而10 mg·L-1PS MPs 復(fù)合并無(wú)顯著作用，說(shuō)明兩種污染物復(fù)合暴露可造成錦鯽膜脂過(guò)氧化損傷，PS MPs 濃度的差異會(huì)影響該作用.

圖5 肝臟組織中的氧化應(yīng)激：(a) SOD;(b) ROS;(c) MDAFig.5 Oxidative stress indicators in liver: (a) SOD,(b) ROS,(c) MDA

3 討論

ZnO NPs 粒徑為（30±10）nm，水溶液中粒徑可增大至439.8 nm，在水體中具有很強(qiáng)的團(tuán)聚性，之前也有報(bào)道［19］.而當(dāng)其與PS MPs 復(fù)合后，粒徑進(jìn)一步增大，這可能與PS MPs 較強(qiáng)的吸附性有關(guān).由于PS MPs 具有較強(qiáng)吸附顆粒態(tài)金屬污染物的特性［8］，它與ZnO NPs 復(fù)合后可在表面吸附更多的ZnO NPs，使得ZnO NPs 水合粒徑由于被吸附聚集而增大.Tong et al［20］在0.1 μm PS MPs 對(duì)ZnO NPs 在水中溶解釋放的影響研究中也出現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象，PS MPs 與ZnO NPs 在光照條件下發(fā)生明顯團(tuán)聚現(xiàn)象，表現(xiàn)為更容易發(fā)生聚集沉淀.Li et al［21］的研究也報(bào)道PS MPs 可作為納米銀的載體，吸附水體中的納米銀顆粒.

納米金屬氧化物的離子釋放被認(rèn)為是致毒的重要原因［22］，而MPs 的作用可影響Zn2+的溶解與釋放.相較于ZnO NPs 單一脅迫和1 mg·L-1PS MPs 復(fù)合組，與10 mg·L-1PS MPs 復(fù)合后養(yǎng)殖水中Zn2+的含量顯著下降.研究報(bào)道MPs 可通過(guò)物理吸附等作用吸附金屬離子，從而降低它們?cè)谌芤褐械呢S度［23］.同時(shí)隨著與PS MPs 的復(fù)合與濃度增大，體系的穩(wěn)定性增強(qiáng)，可能減少ZnO NPs的溶解與釋放.

Zn 作為體內(nèi)的微量元素，生物各組織Zn 富集量維持在一定水平.在本研究中ZnO NPs 和PS MPs 的單一與復(fù)合暴露并未造成腸道、鰓和魚(yú)肉中Zn 含量顯著增加，只有腦部例外.對(duì)于魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō)，口腔攝入是顆粒態(tài)污染物進(jìn)入體內(nèi)重要方式之一［24］，腸道則是納米顆粒在水生動(dòng)物體內(nèi)富集的主要器官［25］.而PS MPs 的復(fù)合與濃度對(duì)腸道中Zn 的富集無(wú)明顯影響，這或許與ZnO NPs強(qiáng)烈的聚集性相關(guān).ZnO NPs 在水中發(fā)生明顯聚集，而與微塑料復(fù)合后粒徑進(jìn)一步增大，從而影響腸道的吸收和富集.

在腦部，相較于單一脅迫組，ZnO NPs 與1 mg·L-1PS MPs 復(fù)合后Zn 含量下降，而與10 mg·L-1PS MPs 復(fù)合則無(wú)差異，較低濃度的PS MPs可減少Zn 在腦中的富集.由于血腦屏障的存在，較大的顆粒態(tài)納米金屬氧化物無(wú)法進(jìn)入腦中，離子態(tài)是金屬進(jìn)入腦中的主要形式［26］.1 mg·L-1PS MPs 復(fù)合組體系Zeta 電位絕對(duì)值更小，ZnO NPs穩(wěn)定性差，Zn2+溶出率更高，從而提高腦中Zn 的含量.但也有研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.76 mg·L-1的ZnO NPs 與PS MPs 復(fù)合后對(duì)腦中Zn 的富集并無(wú)顯著影響［27］，可能是由于顆粒物粒徑與濃度的差異使得復(fù)合后并未能改變水體Zn2+含量與腦對(duì)Zn 的吸收富集.

SOD 可通過(guò)清除生物體內(nèi)超氧陰離子而保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷［28］，是生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)重要酶系之一.實(shí)驗(yàn)中錦鯽暴露于污染物兩周后，各組肝臟中SOD 含量十分接近，污染物的濃度和復(fù)合對(duì)肝臟SOD 活性無(wú)明顯影響.同樣在Meng et al［29］的研究中，0.8 mg·L-1ZnO NPs 脅迫下，PS MPs 的粒徑大小與污染物的復(fù)合對(duì)SOD活性也未產(chǎn)生顯著影響.本實(shí)驗(yàn)ZnO NPs 濃度為1 mg·L-1，可能未達(dá)到產(chǎn)生顯著影響的閾值［30］.

MDA 是膜脂過(guò)氧化損傷的產(chǎn)物，機(jī)體遭受氧化脅迫時(shí)往往會(huì)大量累積.本研究中除了ZnO NPs 與1 mg·L-1PS MPs 復(fù)合后肝臟細(xì)胞氧化損傷加劇，其余各組均無(wú)顯著效應(yīng)，表明較低濃度的PS MPs 與ZnO NPs 復(fù)合暴露可造成氧化損傷.另外與通常認(rèn)知不同的是，低濃度復(fù)合組MDA含量增大，卻未觀察到生物體內(nèi)的強(qiáng)氧化劑ROS含量發(fā)生明顯變化，推測(cè)這可能是錦鯽體內(nèi)的抗氧化酶作用以消除ROS 產(chǎn)生的氧化損傷，使得產(chǎn)生的ROS 很快被生物體清除.

4 結(jié)論

ZnO NPs 在水體中與PS MPs 復(fù)合后，兩者的相互作用可增強(qiáng)ZnO NPs 團(tuán)聚性，使團(tuán)聚體粒徑增大，體系穩(wěn)定性提高，且高濃度（10 mg·L-1）PS MPs 復(fù)合可能通過(guò)吸附作用降低了水體中游離Zn2+的含量.在復(fù)合實(shí)驗(yàn)中，PS MPs 的濃度對(duì)不同組織的Zn 富集表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，高濃度復(fù)合促進(jìn)了Zn 在眼部的富集，而低濃度復(fù)合減少了腦部Zn 的富集，PS MPs 可通過(guò)影響ZnO NPs 在體系中的穩(wěn)定性及Zn2+溶出改變組織對(duì)Zn 的富集；兩者在低濃度下的復(fù)合增加了對(duì)肝臟的膜脂過(guò)氧化損傷，提高了生物毒性.