禹金龍，董 晨，王嫻靜，姬賽賽，付文靜，胡 潔，江 蕓,*

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）是埃希氏菌屬的成員，屬于革蘭氏陰性菌兼性厭氧桿菌，從嬰幼兒出生幾個(gè)小時(shí)，便通過吞咽寄居在體內(nèi)，與人類生活息息相關(guān)，一般情況下不會(huì)引起致病，是正常的腸道菌群[1]。但在機(jī)體抵抗力下降等情況下，大腸桿菌則通過腸道外途徑進(jìn)入其他部位，造成相應(yīng)部位的感染，所以又稱之為條件致病菌[2]。自從1885年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，大腸桿菌在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)一直被認(rèn)為是人與動(dòng)物胃腸道中的正常菌群，并無(wú)致病性，直到20世紀(jì)中期，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)有些特殊的血清型對(duì)人、動(dòng)物產(chǎn)生疾病[3-5]，根據(jù)它們所引起的疾病類型，致病性大腸桿菌可以分為兩大類：腹瀉性大腸桿菌和腸道外致病性大腸桿菌。腹瀉性大腸桿菌又可分為腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸黏附性大腸桿菌、擴(kuò)散附著大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌/產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing E. coli，STEC）[6]。

在致病性大腸桿菌中，大腸埃希氏菌O157:H7感染劑量低、致病力強(qiáng)、危險(xiǎn)性大、臨床癥狀嚴(yán)重，其污染和危害已成為全球性廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[7-8]。然而，由于長(zhǎng)期以來(lái)缺乏相應(yīng)有效的檢測(cè)方法，人們更多關(guān)注O157，而非O157（non-O157）的危害性被低估甚至忽視。近年來(lái)國(guó)際上已越來(lái)越重視非O157的安全性，一些非O157對(duì)公眾健康的威脅甚至高于O157，美國(guó)于2001年開始對(duì)non-O157 STEC施行主動(dòng)監(jiān)測(cè)[9]。據(jù)報(bào)道，美國(guó)1983—2002年發(fā)生的非O157的STEC感染者中，70%是由O26、O45、O103、O121、O111和O145血清型所致[10]，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心已經(jīng)將這6 種血清型命名為“big six”non-O157 STEC[11]。2012年3月，美國(guó)農(nóng)業(yè)部USDA宣布強(qiáng)制執(zhí)行在初加工的牛肉制品中不得檢出這6 大類“big six”非O157 STEC[12]。目前我國(guó)對(duì)非O157尚未引起廣泛重視[13-16]，對(duì)非O157的研究亦少見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)參考美國(guó)農(nóng)業(yè)部[17]及Svoboda等[18]的方法，調(diào)查牛糞和牛肉樣本中非O157大腸桿菌的污染情況，并對(duì)大腸桿菌O157及非O157（O26、O103、O111、O121）進(jìn)行分離鑒定，對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)一步進(jìn)行毒力基因（stx1、stx2、eae、hly）檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)鮮有關(guān)于非O157大腸桿菌污染情況的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將為非O157大腸桿菌的食品安全和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

153 份牛糞樣品采自安徽省旌德縣兩家生態(tài)養(yǎng)牛場(chǎng)，49 份牛肉采自南京小型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，一共202 份樣品。

本實(shí)驗(yàn)所用陽(yáng)性對(duì)照菌大腸桿菌O157:H7一株（編號(hào)CICC 21530），非O157（O26、O103、O111、O121）DNA全基因組由江蘇省疾病預(yù)防控制中心提供。

緩沖蛋白胨水、改良胰蛋白胨大豆肉湯（modified tryptic soy broth，mTSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、酵母浸粉（yeast extract，YE）、半固體動(dòng)力培養(yǎng)基、亞碲酸鉀、頭孢克肟、P-10A新生霉素、P-10B新生霉素 北京陸橋技術(shù)有限公司；TaqTM（with Mg2＋free buffer）、100 bp DNA Marker、H抗原所用酶 大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司；瓊脂糖 北京天根生化科技有限公司；multiplex PCR kit 德國(guó)Qiagen公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、4S Red染料 上海生工生物科技有限公司；rainbow agar培養(yǎng)基 美國(guó)Biolog公司；O26抗原、H11抗原等血清 日本生研公司。所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler personal聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)Eppendorf公司；GelDoc 2000 system凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；TCL-16G高速離心機(jī) 上海安亭儀器廠；DYY-2C瓊脂糖凝膠電泳儀 上海天能科技有限公司；SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國(guó)Baker公司；生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；拍打式均質(zhì)器 青島眾瑞智能儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 增菌培養(yǎng)

參考美國(guó)農(nóng)業(yè)部[17]及Svoboda等[18]的方法，稍作調(diào)整，進(jìn)行增菌培養(yǎng)：牛糞樣品10 g、牛肉樣25 g以料液比1∶9（g/mL）添加緩沖蛋白胨水于均質(zhì)袋中，均質(zhì)2～3 min，取10 mL均質(zhì)液加入到含有40 mL mTSB的均質(zhì)袋中，于42 ℃、220 r/min搖床中培養(yǎng)22 h。

1.3.2 增菌液DNA提取及多重PCR檢測(cè)O血清型

取1 mL樣品增菌液，按照說(shuō)明書提取細(xì)菌DNA。采用多重PCR進(jìn)行O抗原的鑒定[19]。PCR體系為25 μL，包括1 μL模板，PCR Master Mix 12.5 μL，O抗原引物（10 μmol/L）mix 2.62 μL，不足部分用水補(bǔ)齊。PCR條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像觀察結(jié)果。O血清型陽(yáng)性樣品進(jìn)行進(jìn)一步菌株分離純化。

1.3.3 菌株分離純化

上述O血清型陽(yáng)性樣品的增菌液，取一環(huán)劃線于mRBA（添加0.05 mg/L頭孢克肟，0.15 mg/L亞碲酸鉀，5.0 mg/L新生霉素）培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，按照mRBA說(shuō)明書及美國(guó)農(nóng)業(yè)部指導(dǎo)說(shuō)明，挑取特征顏色菌落，在mRBA培養(yǎng)基上繼續(xù)劃線，經(jīng)3 次分離純化，挑取單菌落劃線于非選擇性培養(yǎng)基TSA-YE上保存。

1.3.4 細(xì)菌基因組DNA提取及血清型鑒定

將可疑菌株挑1 環(huán)于150 μL滅菌雙蒸水中，渦旋，充分混勻。99 ℃水浴處理10 min，冰浴2 min，12 000×g離心2 min，吸取上清液即為細(xì)菌基因組DNA，－20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

菌株O血清型的鑒定采用多重P C R進(jìn)行，方法同上，對(duì)PCR陽(yáng)性的菌株進(jìn)一步采用血清凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。鞭毛抗原分型采用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法[20]。擴(kuò)增fliC基因所用的引物為：5’-CAAGTCATTAATACAAACAGCC-3’和5’-GACATATTAGAGACTTCGGT-3’。擴(kuò)增fliC基因并用HhaI酶切，根據(jù)酶切圖譜得出相應(yīng)的鞭毛抗原類型。PCR體系為20 μL，包括0.3 μL模板，0.8 μL各引物（10 μmol/L），2 μL 10×Buffer（Mg2＋free)，2 μL Mg2＋，2 μL dNTP，0.2 μLTaq酶，不足部分用水補(bǔ)齊。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增后取PCR產(chǎn)物5 μL，加入HhaI酶及緩沖液，37 ℃酶切10 min后，取酶切液，在2%瓊脂糖凝膠中，85 V電泳50 min。比對(duì)酶切產(chǎn)物圖譜對(duì)照表確定H抗原類型。同時(shí)在半固體培養(yǎng)基中多次誘導(dǎo)，用血清凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 多重PCR進(jìn)行毒力基因檢測(cè)

O血清型陽(yáng)性的菌株采用多重PCR進(jìn)行stx1、stx2、eae、hly4 種毒力基因攜帶情況檢測(cè)[21-22]。PCR體系為50 μL：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl25 μL，4 對(duì)引物（10 μmol/L）mix 9.4 μL，Taq酶0.25 μL，DNA模板1 μL，不足部分用水補(bǔ)齊。PCR程序：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃退火40 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度Table 1 PCR primer sequences and amplification length

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品O血清型檢測(cè)結(jié)果

如表2和圖1所示，202 份樣品多重PCR檢出一條或多條陽(yáng)性條帶的樣品共40 份（19.8%），牛糞陽(yáng)性檢出率為24.8%（38/153），牛肉陽(yáng)性檢出率為4.1%（2/49），牛糞檢出率高于牛肉。其中非O157檢出率為19.3%（牛糞37＋牛肉2，39/202），O157的檢出率為0.5%（牛糞1＋牛肉0，1/202）。153 份牛糞樣本中，總陽(yáng)性樣本38 份，O26有32 份，占20.9%，O121有7 份，占4.6%，O103有5 份，占3.2%，O157僅有1 份，占0.6%，49 份牛肉樣品中僅發(fā)現(xiàn)2 份O26樣本陽(yáng)性，占4.1%，結(jié)果表明牛糞和牛肉中非O157大腸桿菌的陽(yáng)性率均高于O157。

表2 牛肉及牛糞樣本中大腸桿菌O血清型檢出情況Table 2 Prevalence of E. coli O-groups in beef and fecal samples

圖1 部分牛糞樣本增菌液O血清型多重PCR電泳圖Fig. 1 Electrophoresis profile of multiplex PCR-amplified products for O-groups of some fecal enrichment broths

2.2 菌株O血清型檢測(cè)結(jié)果

圖2 部分菌株O血清型多重PCR電泳圖Fig. 2 Electrophoresis profile of multiplex PCR-amplified products for O-groups of some isolates

陽(yáng)性樣本增菌液用mRBA選擇性培養(yǎng)基3 次劃線純化后，煮沸法提取DNA后采用多重PCR和血清凝集實(shí)驗(yàn)共鑒定出陽(yáng)性菌株30 株，包括5 種O血清型，其中O26占73.3%（22/30），O121占16.7%（5/30），O103占6.7%（2/30），O157占3.3%（1/30），O111未檢出，部分菌株O血清型多重PCR見圖2。結(jié)果顯示O26是優(yōu)勢(shì)血清型。

2.3 菌株鞭毛抗原分型

經(jīng)圖譜對(duì)照及血清凝集實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在O26中，O26:H11是主要污染菌株，占59.1%（13/22），其次是O26:H-，占22.7%（5/22），O26:H14與O26:H19均占9.1%（2/22）。2 株O103鞭毛抗原均為H2。5 株O121中，3 株為O121:H19，另2 株則為O121:H-。1 株O157為O157:NM。

2.4 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

如圖3所示，分離自牛肉的2株O26:H11，1 株stx1、hly陽(yáng)性（泳道3），另1 株hly陽(yáng)性（泳道4），而牛糞分離菌中，僅發(fā)現(xiàn)1 株O26:H11菌株呈現(xiàn)hly陽(yáng)性（泳道6）。因此，30 株菌株中帶毒菌株陽(yáng)性率為10.0%（3/30），非O157 STEC陽(yáng)性率為3.4%（1/29）。

1. 1 000 bp ladder Marker；2.大腸桿菌O157:H7（CICC 21530）；3.牛肉分離菌1；4.牛肉分離菌2；5.牛糞分離菌1；6.牛糞分離菌2；7.陰性對(duì)照菌DH5α；8. PCR陰性對(duì)照。

3 討 論

近年來(lái)，關(guān)于非O157 STEC，尤其是“big six”STEC爆發(fā)流行的報(bào)道逐漸增多，國(guó)外尤其是發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)大腸桿菌“big six”的關(guān)注度越來(lái)越高，據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心2010年報(bào)告，在非O157 STEC中，患病率依次為O26（22%）、O111（16%）、O103（12%）、O121（8%）、O45（7%）和O145（5%）[23]，與O157患病率大體一致，表明非O157 STEC對(duì)人類的健康威脅不容忽視。然而我國(guó)對(duì)非O157 STEC尚未引起足夠重視。

反芻類動(dòng)物，如牛、羊，是非O157 STEC的主要宿主，在屠宰過程中，通過去皮或去內(nèi)臟等污染肉類，牛糞中STEC是污染動(dòng)物性食物的主要來(lái)源[24-25]。牛源性非O157 STEC的流行數(shù)據(jù)尚未完善，原因在于分離鑒定非O157 STEC方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化，如何有效地從含有大量背景菌中的糞便中分離出目的菌株，對(duì)選擇性增菌液以及分離純化培養(yǎng)基有著較高的要求[26]，Zelyas等[27]對(duì)4 種顯色培養(yǎng)基分離非O157 STEC的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，表明mRBA培養(yǎng)基與CHROMagar?STEC培養(yǎng)基能有效分離非O157 STEC。本實(shí)驗(yàn)參考美國(guó)農(nóng)業(yè)部[17]及Svoboda等[18]方法，采用多重PCR方法，預(yù)先篩選非O157陽(yáng)性樣本，再利用mRBA培養(yǎng)基分離篩選，挑取特征顏色菌落，并進(jìn)一步鑒定。有研究報(bào)道從食品安全角度考慮，先采用多重PCR檢測(cè)毒力基因進(jìn)行初篩，再對(duì)毒力基因陽(yáng)性的樣本進(jìn)行分離鑒定，而本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖橇私馕覈?guó)非O157大腸桿菌的污染情況，故對(duì)毒力基因陰性的樣本也進(jìn)行調(diào)查。

Elder等[28]研究發(fā)現(xiàn)牛糞中腸出血性大腸桿菌O157的污染與牛胴體污染情況存在顯著正相關(guān)，其他較多研究也表明糞便中非O157 STEC會(huì)導(dǎo)致牛肉受到一定污染[24-25]。因此本實(shí)驗(yàn)牛糞中較高的檢出率，提示其相應(yīng)牛肉及其制品存在著一定安全風(fēng)險(xiǎn)。然而糞便中致病菌污染牛肉由于屠宰加工過程中屠宰環(huán)境、屠宰工藝、衛(wèi)生管理等不同，其污染概率亦不相同，所以有必要加強(qiáng)其屠宰加工的衛(wèi)生管理，以有效控制其牛肉產(chǎn)品的安全。

非O157大腸桿菌的污染調(diào)查，國(guó)外已有較多報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)非O157的污染率明顯高于O157，這與Svoboda等[18]的報(bào)道相似。較多關(guān)于非O157 STEC污染情況有不同的報(bào)道，牛糞中非O157 STEC的檢出率為0.0%～16.9%[29-31]。牛肉中非O157 STEC污染調(diào)查也有不同報(bào)道，有的報(bào)道檢出率較高，達(dá)到15.5%～33.3%，如Koohmaraie[32]、Barlow[33]、Auvray[34]等的研究報(bào)道。然而還有一些非O157 STEC低檢出率的報(bào)道，如Jiang Yun等[35]調(diào)查美國(guó)小型牛肉加工廠非O157 STEC檢出率為3.5%，歐洲食品安全局[36]關(guān)于歐盟食品中檢出率為0%～5.9%。Hussein等[37]發(fā)現(xiàn)屠宰的牛非O157 STEC檢出率在2.1%～70.1%之間，環(huán)境因素、管理措施等可能會(huì)影響STEC污染率的變化。本實(shí)驗(yàn)非O157 STEC檢出率為3.4%，但采樣地點(diǎn)和樣本量均有限，尚需加大調(diào)查規(guī)模和監(jiān)測(cè)力度才能更全面反映我國(guó)非O157大腸桿菌尤其是非O157 STEC的污染情況。

大腸桿菌O157和非O157感染劑量低、致病力強(qiáng)，雖然不耐熱，但肉在加工烹調(diào)過程中（如生熟未分開）、肉熟制后的包裝過程、熟肉制品的再次切配等均可能存在交叉污染，因此在實(shí)際生產(chǎn)、銷售及家庭加工過程中仍應(yīng)該重視其安全防范。

4 結(jié) 論

牛糞和牛肉中非O157大腸桿菌的污染率明顯高于O157，尤其是O26:H11血清型最高，且檢出含志賀毒素基因的菌株，這提示零售牛肉市場(chǎng)存在非O157大腸桿菌污染的安全風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加大對(duì)小型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)肉類食品監(jiān)管，改善生產(chǎn)銷售條件，預(yù)防大腸桿菌的污染。