熊蘇玥，米瑞芳，陳 曦*，戚 彪，李金春，李家鵬*，喬曉玲，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，國家肉類加工工程技術(shù)研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

食源性致病菌引發(fā)的食品安全事件一直是公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的焦點[1-2]。由金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌和大腸桿菌O157:H7等細菌性食物中毒引起的疾病在我國約占食品安全事件的30%～90%，也是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題[3-4]。曲霉和青霉是食物成品貯藏過程中出現(xiàn)的主要致腐菌[5-7]，其次級代謝產(chǎn)物通常是容易引起疾病的致癌、致畸、致突變的霉菌毒素。因此，加強食品中致病微生物檢測技術(shù)的研究對預(yù)防和控制食源性疾病具有重要意義。

傳統(tǒng)檢測方法時間長，工作量大，準確度較低[8]。近年來，隨著針對食源性致病菌的分子生物學檢測手段快速發(fā)展與應(yīng)用，多重聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測技術(shù)取得很大進展。在食源性致病細菌檢測方面，Wei Caijiao等[9]利用多重PCR同時檢測牛乳中的大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，檢測方法的靈敏度為103CFU/mL，與食品樣品中的單重PCR靈敏度結(jié)果相同。Nguyen等[10]通過12 h的增菌培養(yǎng)可將雞肉等食品中PCR檢測沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7與單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限由增菌前的102CFU/mL降低至101CFU/mL。閆琳等[11]將人工染菌的禽肉食品樣本在增菌12 h后，利用PCR檢測沙門氏菌的檢出限可低至100CFU/25 g。增菌-PCR檢測方法可顯著提高致病菌的檢出限，然而由于不同微生物生長特性存在差異，需要研究開發(fā)通用型培養(yǎng)基應(yīng)用于多種致病菌的同時增菌培養(yǎng)，并抑制其他非靶標菌的生長，而且增菌-PCR方法無法定量致病菌的初始數(shù)量；另外，增菌培養(yǎng)時殘留的食品基質(zhì)成分，也有可能影響菌體生長速率和后續(xù)PCR擴增，因此該檢測方法還有待進一步完善[12]。在食源性霉菌檢測方面，顧雙等[13]利用ITS和pksCT基因引物進行PCR擴增，以監(jiān)測發(fā)酵食品中的霉菌，敖特根巴雅爾等[14]所建立的PCR體系對檢測干肉制品中霉菌的靈敏度為2 ng/μL。目前，細菌和霉菌的多重PCR檢測在醫(yī)學中已有報道[15]，但尚鮮見利用多重PCR法同時檢測食品中致病細菌和霉菌的報道。

因此，本研究針對食品中的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單核細胞增生李斯特氏菌及常見霉菌，建立一種快速、穩(wěn)定且特異性良好的多重PCR體系，對快速、準確同時檢測肉制品、豆制品和面制品中5 種致病微生物污染情況進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

香腸、豆腐、面包 北京市購；所用菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）和丹麥科漢森公司，詳見表1。

表1 菌種來源及用于引物設(shè)計的靶標基因Table 1 Strains tested in this study and their target genes used for primer design

引物由Invitrogen公司合成；2×TaqPCR MasterMix（含染料）、RNase-free水、細菌DNA提取試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；DNeasy Plant Mini Kit試劑盒（69104） 德國QIAGEN公司；DL 2000（plus 100）、DL 500 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；DuRed染料北京全品速生物科技有限公司；腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（NB）、李斯特氏菌增菌肉湯（LEB）、營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf 5417R冷凍離心機 艾本德中國有限公司；Synergy H4多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；T100梯度PCR儀 伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；電泳儀 六一（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)

取活化的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7分別于NB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)3、5 h和2 h，單核細胞增生李斯特氏菌于BHI培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)6 h，取處于對數(shù)生長期的新鮮菌液用于細菌基因組DNA提取。黃曲霉、島青霉和構(gòu)巢曲霉于利用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，黃曲霉培養(yǎng)條件為29 ℃，其他霉菌為25 ℃。黃曲霉、島青霉和構(gòu)巢曲霉取培養(yǎng)基上的新鮮菌落，納地青霉則直接利用凍干菌粉進行霉菌基因組DNA提取。

1.3.2 DNA提取

細菌取新鮮菌液后，利用細菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取。霉菌經(jīng)玻璃珠振蕩破壁后，利用DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取霉菌DNA。

1.3.3 引物設(shè)計

選取文獻[16-18]中報道的4 種細菌的菌種特異性基因，包括金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因（nuc）、沙門氏菌的侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白基因（hilA）、大腸桿菌O157:H7鞭毛基因（flic）、單核細胞增生李斯特氏菌的毒力調(diào)控蛋白基因（prfA），作為靶標基因設(shè)計引物進行PCR擴增。由于需要同時檢測到不同種屬的霉菌，選擇霉菌18S rRNA基因V5區(qū)設(shè)計特異性引物[19]用以擴增食品中常見霉菌。利用Premier 5.0對目的基因進行引物設(shè)計以及評價[20]，參考引物的特異性檢測擴增結(jié)果，選取5 對擴增片段大小有一定差異、退火溫度相近且特異性較高的引物，引物序列見表2。

表2 多重PCR引物序列Table 2 Multiplex PCR primer sequences

1.3.4 多重PCR體系的建立

對每組引物的添加量、退火溫度、P C R循環(huán)數(shù)、延伸時間等因素進行優(yōu)化。最終確定的最適反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR MasterMix（含染料）12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.25 μL，由單核細胞增生李斯特氏菌prfA0.23 μL、沙門氏菌hilA0.42 μL、金黃色葡萄球菌nuc0.20 μL、大腸桿菌O157:H7flic0.20 μL、霉菌18S V5 0.20 μL組成，DNA模板1 μL，雙蒸水ddH2O補足至25 μL。采用降落PCR提高擴增的特異性、靈敏度和產(chǎn)量[21]，降落PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，初始退火溫度59 ℃，經(jīng)過6 個循環(huán)且每個循環(huán)減0.4～57 ℃，保持退火溫度為57 ℃擴增30 個循環(huán)，退火時間均為30 s，72 ℃延伸25 s，共擴增36 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。

1.3.5 多重PCR體系特異性檢測

為確定所建立多重PCR方法的特異性，隨機選擇三類及四類目的菌株DNA進行組合作為DNA模板進行多重PCR擴增，觀察擴增產(chǎn)物有無交叉錯配現(xiàn)象。同時對非目標菌DNA模板進行擴增，選擇玫瑰色庫克菌、變異庫克菌和藤黃微球菌等其他共15 種菌株驗證菌種特異性。

1.3.6 多重PCR體系靈敏度檢測

將得到的5 種致病菌DNA質(zhì)量濃度調(diào)整到40 ng/μL后進行10 倍梯度稀釋，作為擴增DNA模板。即進行靈敏度實驗的DNA質(zhì)量濃度分別為4×101～4×10－5ng/μL，每個質(zhì)量濃度的DNA各取1 μL按最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進行實驗。

1.3.7 多重PCR檢測人工污染食品

將培養(yǎng)至對數(shù)期的5 種致病菌分別用生理鹽水10 倍梯度稀釋，使?jié)舛葹?00CFU/mL。參照Kumar等[22]的方法，經(jīng)檢測無菌的香腸樣品均質(zhì)后，分別接種5 種菌，接種量均為100CFU/25 g，污染香腸樣品于營養(yǎng)肉湯中在37 ℃培養(yǎng)9、14 h和20 h后，取每種菌的培養(yǎng)液1 mL混合后分別提取細菌和霉菌DNA，在人工污染肉制品中驗證建立的多重PCR方法。在面包和豆腐中同法進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR特異性檢測結(jié)果

采用單一目的菌株DNA擴增以檢測多重PCR引物的特異性，擴增結(jié)果顯示大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌與納地青霉、島青霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉4 種霉菌在相應(yīng)位置處均出現(xiàn)清晰的單一條帶（圖1），且片段大小與理論值相符，分別為73、143、192、220 bp與280 bp，未發(fā)現(xiàn)非特異性擴增條帶。泳道5～8中以納地青霉、島青霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉4 種不同種屬的霉菌DNA為模板，均成功擴增出單一條帶，泳道9中同時擴增出5 種DNA清晰且有明顯區(qū)分度的條帶，證明該引物對食品中常見的5 種細菌和霉菌有良好的特異性與較高的擴增效率。

1.大腸桿菌O157:H7（Ec）；2.金黃色葡萄球菌（Sa）；3.沙門氏菌（Se）；4.單核細胞增生李斯特氏菌（Lm）；5.納地青霉（Pn）；6. 黃曲霉（Fa）；7.島青霉；8.構(gòu)巢曲霉；9. Fa＋Ec＋Sa＋Se＋Lm；M. Marker DL500。

如圖2所示，以庫克菌、乳桿菌和葡萄球菌等食品中可能出現(xiàn)的其他菌種作為陰性對照，驗證擴增體系的菌種特異性。1～15泳道中除低于50 bp的引物二聚體無其他條帶出現(xiàn)，說明該PCR擴增體系菌種特異性良好，可避免擴增出發(fā)酵食品生產(chǎn)中常用的植物乳桿菌等乳酸菌，或者非目標致病菌如庫克菌、糞腸球菌等從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

圖2 多重PCR體系菌間特異性Fig. 2 Specificity of strains in multiplex PCR

利用已建立的多重PCR體系對目標菌株進行引物間特異性的檢測，檢測結(jié)果如圖3所示。泳道1～10的擴增結(jié)果表明該體系可擴增出任意組合的3 種目標菌，泳道11～15的擴增結(jié)果表明該體系可擴增出任意組合的4 種目標菌，泳道16顯示該體系可同時擴增出5 種目標菌，引物間未發(fā)生交叉錯配現(xiàn)象的情況，同時無非特異性擴增條帶出現(xiàn)，陰性對照無擴增條帶。結(jié)果表明建立的多重PCR體系具有非常好的菌種特異性。

圖3 多重PCR引物間特異性Fig. 3 Specificity of primers in multiplex PCR

2.2 多重PCR靈敏度檢測結(jié)果

將5 種菌的基因組DNA進行10 倍梯度稀釋后，分別取101、100、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5ng作為模板進行多重PCR擴增。如圖4所示，5 種致病菌中霉菌（黃曲霉）的檢出限可達10－5ng，而當模板量低于10－3ng時金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌的目標條帶消失，大腸桿菌O157:H7存在微弱的擴增條帶，因此同時檢測5 種菌的最低模板量為10－2ng。

圖4 多重PCR分別檢測大腸桿菌O157：H7（A）、金黃色葡萄球菌 （B）、沙門氏菌（C）、單核細胞增生李斯特氏菌（D）、 黃曲霉（E）以及多重PCR同時檢測5 種微生物（F）的靈敏度 Fig. 4 Sensitivity of multiplex PCR for E. coli O157：H7 (A), S. aureus (B), Salmonella enterica subsp. enterica (C), Listeria monocytogenes (D), Aspergillus flavus (E), and multiplex DNA (F)

2.3 人工污染食品的多重PCR靈敏度檢測結(jié)果

為驗證建立的多重PCR方法在食品中應(yīng)用的效果，選取香腸、豆腐和面包分別作為常見肉制品、豆制品和面制品的代表。經(jīng)檢測確認無4 種致病細菌和霉菌的香腸、豆腐和面包中，分別接種5 種目標菌，其中接種霉菌為納地青霉，初始接種量均為100CFU/25 g食物。

如圖5所示，增菌9 h后，3 種人工污染食物樣品中均可檢出大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌與霉菌。其中香腸人工污染樣品在增菌9 h時，金黃色葡萄球菌與沙門氏菌的擴增條帶較豆腐和面包弱；增菌14 h后，3 種食物中均可檢出沙門氏菌，豆腐中已經(jīng)可以檢測出單核細胞增生李斯特氏菌；增菌20 h后，3 種食物中均可檢出單核細胞增生李斯特氏菌。因此，經(jīng)過20 h增菌培養(yǎng)，5 種致病微生物檢出限均可達到100CFU/25 g。同時提取未接菌的食物樣品DNA進行PCR擴增，結(jié)果顯示未出現(xiàn)任何條帶，說明所建立的多重PCR體系可適用于常見食品中這5 種致病微生物的快速檢測。

通過觀察食物基質(zhì)加入培養(yǎng)基混勻后的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)3 種食品中豆腐的加入對培養(yǎng)基的影響最小，無溶出物且形態(tài)保持不變，而面包浸于培養(yǎng)基后經(jīng)過振蕩破碎分散使培養(yǎng)基變得渾濁，香腸的加入則會在培養(yǎng)基表面形成明顯的油脂層，對菌體的培養(yǎng)及菌液的收集造成影響，進一步影響提取DNA的質(zhì)量，這可能是導(dǎo)致3 種食物基質(zhì)中檢測致病菌靈敏度差異的主要原因。在Lee等[23]進行的6 重PCR檢測技術(shù)研究中也得到相似的實驗結(jié)果，該研究以單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙門氏菌等致病菌污染辣子雞、牡蠣和生菜，分別在SEB富集培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)4、8、12 h后，發(fā)現(xiàn)生菜中8 h即可檢出6 種初始含量為100CFU/mL的致病菌，而在牡蠣中檢出同樣初始含量的單核細胞增生李斯特氏菌至少需培養(yǎng)12 h，在辣子雞中同樣初始含量的副溶血弧菌與沙門氏菌也需培養(yǎng)12 h才可以檢出，可見食物基質(zhì)的復(fù)雜性對檢測方法的靈敏度會產(chǎn)生一定影響。

圖5 人工污染香腸、面包、豆腐中5 種致病菌多重PCRFig. 5 Multiplex PCR detection of five artificially contaminated pathogens in sausage, bread and tofu

3 討 論

傳統(tǒng)致病菌檢測工作量大、耗時長且操作繁瑣，相比之下，多重PCR作為一種能夠快速、同時檢測多種致病菌的可靠手段，已在實際檢測中得到廣泛應(yīng)用[24]，隨著PCR技術(shù)的日益發(fā)展與成熟，能夠同時檢測的微生物種類與檢測靈敏度都在不斷提高[25]，在監(jiān)測食品危害、保障食品安全方面具有良好的應(yīng)用前景。本研究建立的多重PCR技術(shù)實現(xiàn)了同時檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7和霉菌，并成功應(yīng)用于豆腐、香腸、面包3 種食品的檢測，經(jīng)增菌培養(yǎng)20 h后，5 種致病微生物的的檢出限均可達到100CFU/25 g。

在多重PCR檢測食源性致病菌的相關(guān)研究中，Zhang等[26]將建立的多重PCR方法應(yīng)用于油菜葉等多種食物檢測，增菌24 h后對大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌4 種致病細菌的檢出限可達到100CFU/mL。胡冰雪等[27]對人工污染的冷卻肉進行過夜培養(yǎng)增菌，其熒光假單胞菌、沙門氏菌檢出限可達101CFU/mL，而單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限為70 CFU/mL，這與本實驗中檢測單核細胞增生李斯特氏菌所需增菌時間最長的結(jié)果一致。馮可等[28]對初始染菌量為100CFU/g的鮮切果蔬進行增菌培養(yǎng)，而后采用多重PCR檢測，包括單核細胞增生李斯特氏菌在內(nèi)的4 種致病菌能檢出的增菌培養(yǎng)時間為9 h，時間較短，這可能是由于其PCR體系中的Taq酶含量為1 U/μL，而本實驗PCR體系中Taq酶含量僅為0.1 U/μL，雖然增加了檢出時間，但降低了試劑成本。由于不同菌株間生長特性具有差異，往往還需對增菌培養(yǎng)基進行優(yōu)化[29]。Kawasaki等[30]利用一種自制的培養(yǎng)基NO.17肉湯對接種量為101CFU/mL單核細胞增生李斯特氏菌進行培養(yǎng)，在24 h時活菌數(shù)相比于TSB培養(yǎng)基的2.9（lg（CFU/mL））提高為6.7（lg（CFU/mL））。本研究中采用營養(yǎng)肉湯對5 種微生物進行增菌，未來還將進一步對培養(yǎng)基進行選擇優(yōu)化以縮短增菌時間。

目前鮮見利用多重PCR法同時檢測食品中致病細菌和霉菌的報道，本實驗實現(xiàn)了多重PCR同時擴增檢測4 種致病細菌和常見霉菌，該體系可檢測曲霉、青霉等食品中常見的霉菌。之后可進一步研究建立食品中細菌與霉菌DNA的同時提取方法[31-32]，最終實現(xiàn)食品中細菌與霉菌從培養(yǎng)到DNA提取、PCR擴增的同時檢測。

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)不同菌株的特異性基因設(shè)計引物，建立了一種能夠同時檢測大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌4 種致病細菌及常見霉菌的多重PCR檢測方法在香腸、豆腐和面包中，分別利用營養(yǎng)肉湯增菌9 h后，大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌與霉菌的檢出限可達到100CFU/25 g；增菌14 h后，沙門氏菌的檢出限可達到100CFU/25 g；增菌20 h后，單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限可達到100CFU/25 g。該方法相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法縮短了檢測時間，并可同時檢測食物中4 種致病細菌和常見霉菌，在食品衛(wèi)生監(jiān)督等領(lǐng)域具有較廣闊的應(yīng)用前景。