王 穎，王 強(qiáng)，蔣珍秀，陳 軍，雒 彧

（1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD） 又稱老年癡呆，是一種最常見的老年慢性神經(jīng)退行性疾病，65 歲以上人群發(fā)病率約11%，85 歲則達(dá)到了32%［1］，患者晚期喪失生活自理能力，給其親屬和家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，影響社會發(fā)展［2］。目前，仍然沒有合適的臨床藥物能防治AD，現(xiàn)有的也只能延緩發(fā)病。作為多病因神經(jīng)退行性疾病，AD 的治療具有多靶點(diǎn)性［3-4］。

銀杏葉為銀杏科植物銀杏的葉，有斂肺氣、平喘咳功效，用于治療心悸怔忡、肺虛咳喘?，F(xiàn)代藥理研究證明，銀杏提取物具有神經(jīng)保護(hù)作用，對學(xué)習(xí)記憶障礙和老年癡呆癥具有一定的防治作用。銀杏內(nèi)酯是銀杏葉提取物的主要活性成分，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液主要成分為銀杏內(nèi)酯，由銀杏內(nèi)酯 A （35%）、B （60%）、C （2%）、K（2%） 等二萜內(nèi)酯組成［5］。已有研究表明，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺能改善缺血再灌注大鼠腦缺血引起的行為缺陷，降低谷氨酸、天冬氨酸等興奮性氨基酸水平，增加γ-氨基丁酸等抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，并通過calpain 通路抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡［5-8］。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺能激活PI3K/Akt/Nrf2 信號通路，發(fā)揮抗氧化和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用［9-10］。課題組前期研究表明，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺能減輕老年小鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶功能［11］。但銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對AD 影響的研究較少，本研究通過建立AD 大鼠模型，探討銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對AD 大鼠認(rèn)知功能障礙的影響，并對其相關(guān)分子機(jī)制作進(jìn)一步研究。

1 材料

1.1 動物 清潔級SD 大鼠，3 月齡，雌雄各半，體質(zhì)量230～270 g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （甘） 2018-0002］，飼養(yǎng)于溫度20～24 ℃、自然光照的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，自由進(jìn)食、飲水。本研究涉及的動物實(shí)驗(yàn)操作均遵守蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)和使用規(guī)范。

1.2 試劑與藥物 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液 ［批號181005，5 mL （25 mg） /支，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司］。Aβ1-42（批號171596，美國Sigma 公司）； 兔單克隆抗體NMDA 受體2B （NR2B）、兔單克隆抗體NMDA 受體2Bphospho S1248 （p-NR2B）、鼠單克隆抗體p44/p42 MAPK（ERK1/2）、兔多克隆抗體p44/p42 MAPK- Thr202/Tyr204（p-ERK1/2） （貨號145445、5355S、4696S、9101S，美國Cell Signaling Technology 公司）； 鼠單克隆抗體鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）、兔多克隆抗體CaMKⅡ-phospho T286 （p-CaMK Ⅱ）、兔多克隆抗體cAMP 反應(yīng)結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）、兔單克隆抗體CREB-phospho S133（p-CREB）、兔多克隆抗體PSD95、兔單克隆抗體腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、兔多克隆抗體TrkB、兔單克隆抗體TrkB-phospho Y705 （p-TrkB）、鼠單克隆抗體β-actin （貨號ab22609、ab32678、ab31387、ab32096、ab18258、ab108319、ab18987、ab229908、ab8226，英國Abcam 公司）； IRDyeTM（800CW）染料標(biāo)記的羊抗鼠/兔二抗（美國LI-COR 公司）。

1.3 儀器 Odyssey 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)（美國LICOR 公司）； WM-100 型水迷宮視頻分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將大鼠（雌雄各半） 隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和銀杏二萜內(nèi)酯葡胺低、中、高劑量組，每組8 只。假手術(shù)組行腦立體定位注射手術(shù)，但不注射任何藥物，其余各組大鼠側(cè)腦室注射Aβ1-42（5 nmol/L） 建立AD 模型。造模后第2 天，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺低、中、高劑量組大鼠分別尾靜脈注射1.5、3.0、6.0 mg/kg 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺，假手術(shù)組和模型組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，連續(xù)4 周。給藥結(jié)束后進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，第1～6 天為學(xué)習(xí)能力檢測，第7 天為記憶能力檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，分離腦組織海馬體。

2.2 腦立體定位注射Aβ1-42大鼠腹腔注射6% 水合氯醛（30 mg/kg） 進(jìn)行麻醉，仰臥位固定在腦立體定位儀上，剃去頭部毛發(fā)并進(jìn)行消毒，縱向切開皮膚暴露前囟顱骨，根據(jù)大鼠立體定位圖譜的側(cè)腦室坐標(biāo)點(diǎn)（前囟后1.4 mm、矢狀線旁左側(cè)1.5 mm、深4 mm） 進(jìn)行注射，注射速度0.2 μL/min，注射完畢后留針5 min，再緩慢移出注射器，縫合頭皮并消毒，將大鼠從腦立體定位儀上取下，放回飼養(yǎng)籠中待蘇醒。

2.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 參考Morris 等［12］報道方法設(shè)置水迷宮圓柱形水箱直徑1.6 m，水溫23～25 ℃，測試平臺固定于第三象限內(nèi)水面下2.0 cm。第1～6 天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每天在固定時間訓(xùn)練4 次，在每個象限的固定點(diǎn)將大鼠面向水池壁放入水箱中，60 s 內(nèi)讓其自由游動并尋找隱藏的平臺，記錄找到平臺時間（逃避潛伏期），并讓其在平臺上停留休息20 s； 如果60 s 內(nèi)找不到平臺（逃避潛伏期記為60 s），則由實(shí)驗(yàn)人員將其引導(dǎo)到平臺上并停留休息20 s。第7 天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺，將大鼠于第一象限放入水池中，在60 s 內(nèi)使用視頻跟蹤系統(tǒng)軟件描記其游動路徑軌跡圖，記錄穿越平臺次數(shù)、在目標(biāo)象限停留時間、游程比例。

2.4 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 將大鼠海馬體于冰浴條件下使用電動勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，加入組織裂解液提取總蛋白，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液，BCA 法測定樣品蛋白濃度，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。取部分蛋白樣本，加入上樣緩沖液煮沸10 min 變性。蛋白樣本經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至NC 膜，加4%脫脂牛奶-TBS 溶液室溫封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入兔或鼠IgG 熒光二抗室溫孵育1 h，加入ECL 發(fā)光試劑，使用奧德賽掃描成像系統(tǒng)掃描免疫印跡條帶，檢測并記錄條帶的相對灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 由表1 可知，水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)第2 天起，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長（P＜0.01），學(xué)習(xí)能力下降；與模型組比較，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺中、高劑量組逃避潛伏期縮短（P＜0.01），學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)。由表2 可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間和游程比例均降低（P＜0.01），記憶能力下降； 與模型組比較，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺中、高劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間和游程比例增加（P＜0.01），記憶能力增強(qiáng)。

表1 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠逃避潛伏期的影響（s，±s，n＝8）

表1 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠逃避潛伏期的影響（s，±s，n＝8）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別第1 天第2 天第3 天第4 天第5 天第6 天假手術(shù)組56.352±3.54342.045±2.48135.534±3.05331.376±3.53523.621±4.37516.036±2.682模型組58.542±2.05456.654±2.241** 48.854±1.614** 44.582±3.402** 36.853±3.225** 33.278±5.105*銀杏二萜內(nèi)酯葡胺低劑量組 56.358±2.05855.542±2.82145.357±4.68142.258±2.31236.571±2.35730.365±2.482銀杏二萜內(nèi)酯葡胺中劑量組 55.245±1.65248.351±1.852＃＃40.243±2.256＃＃34.365±2.351＃＃26.358±1.251＃＃ 21.874±1.632＃＃銀杏二萜內(nèi)酯葡胺高劑量組 56.851±2.02646.778±2.225＃＃41.527±3.324＃＃35.667±2.629＃＃26.278±3.244＃＃ 22.823±3.624＃＃

表2 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間、游程比例的影響（±s，n＝8）

表2 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間、游程比例的影響（±s，n＝8）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別穿越平臺次數(shù)/次目標(biāo)象限游程比例/%目標(biāo)象限停留時間比例/%假手術(shù)組5.254±0.21456.654±1.51457.084±3.811模型組3.674±0.651**39.028±2.743**40.110±2.892**銀杏二萜內(nèi)酯葡胺低劑量組3.852±0.25440.521±1.95441.645±1.657銀杏二萜內(nèi)酯葡胺中劑量組4.580±0.361＃＃47.368±2.036＃＃49.921±2.641＃＃銀杏二萜內(nèi)酯葡胺高劑量組4.636±0.547＃＃48.625±3.012＃＃50.541±3.325＃＃

3.2 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠海馬組織NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白表達(dá)的影響 由圖1、表3 可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織p-NR2B、p-ERK1/2、p-CaMKⅡ、p-CREB 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺中、高劑量組大鼠海馬組織p-NR2B、p-ERK1/2、p-CaMK Ⅱ和p-CREB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠海馬組織NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白條帶

表3 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠海馬組織NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝8）

表3 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠海馬組織NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝8）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別p-NR2B/NR2Bp-ERK1/2/ERK1/2p-CaMKⅡ/CaMKⅡp-CREB/CREB假手術(shù)組1.067±0.1461.004±0.0830.992±0.1331.013±0.087模型組0.618±0.029**0.624±0.022**0.665±0.026**0.651±0.015**銀杏二萜內(nèi)酯葡胺低劑量組0.652±0.030**0.629±0.013**0.710±0.036**0.661±0.042**銀杏二萜內(nèi)酯葡胺中劑量組0.815±0.053＃＃0.796±0.045＃＃0.902±0.030＃＃0.857±0.081＃＃銀杏二萜內(nèi)酯葡胺高劑量組0.876±0.034＃＃0.883±0.064＃＃0.827±0.071＃＃0.832±0.047＃＃

3.3 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠海馬組織PSD95、BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)的影響 由圖2、表4 可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織PSD95、BDNF、p-TrkB 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺中、高劑量組大鼠海馬組織PSD95、BDNF 和p-TrkB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠海馬組織PSD95、BDNF、TrkB 蛋白條帶

表4 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠海馬組織PSD95、BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝8）

表4 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對大鼠海馬組織PSD95、BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝8）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別PSD95BDNFp-TrkB/TrkB假手術(shù)組1.033±0.1761.002±0.0890.998±0.114模型組0.648±0.038**0.636±0.041**0.778±0.050**銀杏二萜內(nèi)酯葡胺低劑量組0.703±0.051**0.695±0.052**0.721±0.087**銀杏二萜內(nèi)酯葡胺中劑量組0.961±0.053＃＃0.905±0.043＃＃0.896±0.038＃＃銀杏二萜內(nèi)酯葡胺高劑量組0.970±0.077＃＃0.942±0.021＃＃0.960±0.103＃＃

4 討論

隨著我國快速進(jìn)入老齡化社會，包括AD 在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率持續(xù)升高。海馬體位于大腦顳葉內(nèi)，對于記憶、空間定位、定向發(fā)揮關(guān)鍵作用，AD 患者海馬內(nèi)嗅皮層區(qū)域最先、最易出現(xiàn)損傷［13］。

N-甲基-D-門冬氨酸受體（NMDAR） 家族蛋白屬于谷氨酸受體，在腦組織中普遍表達(dá)，與包括學(xué)習(xí)、認(rèn)知在內(nèi)的大腦高級功能具有高度的相關(guān)性。NMDAR 家族蛋白NR2B 與谷氨酸相互作用，能激活CaMK Ⅱ和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）信號通路并誘發(fā)長時程增強(qiáng)效應(yīng)（long-term potentiation，LTP）。CaMK Ⅱ和ERK1/2 下游最重要的分子是CREB，CREB 活化（磷酸化水平增強(qiáng)） 也與LTP、記憶的形成相關(guān)［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)在老齡動物模型和AD 動物模型中，NR2B 以及CaMK Ⅱ、ERK1/2、CREB 的活性均下降［16-18］。本研究結(jié)果顯示，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺上調(diào)了AD 大鼠海馬組織p-NR2B 表達(dá)，激活了下游CaMKⅡ/ERK/CREB 信號通路，而該信號通路激活具有促進(jìn)突觸的形成，增強(qiáng)突觸可塑性、LTP 等效應(yīng)。同時水迷宮實(shí)驗(yàn)表明銀杏二萜內(nèi)酯葡胺能改善AD 大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

PSD95 是突觸后聯(lián)合的主要構(gòu)成組件，與學(xué)習(xí)記憶形成、神經(jīng)信息傳遞和突觸可塑性等過程具有密切聯(lián)系，在老年人和阿爾茨海默病患者腦內(nèi)表達(dá)減少［19］。本研究結(jié)果顯示，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺能上調(diào)AD 大鼠海馬組織PSD95蛋白表達(dá)。BDNF 在學(xué)習(xí)和記憶的形成中發(fā)揮重要的作用［20-21］，轉(zhuǎn)BDNF 基因小鼠的認(rèn)知功能和突觸可塑性有明顯的提升，而敲除BDNF 基因小鼠則表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降［22-23］。BDNF 能和神經(jīng)元表面TrkB 結(jié)合并激活TrkB 和ERK/CREB 信號通路，在海馬刺激突觸發(fā)生和強(qiáng)化突觸間聯(lián)系、增加樹突棘密度和體積大小、參與神經(jīng)發(fā)生、促進(jìn)突觸可塑性、LTP 和記憶的形成中起關(guān)鍵作用。BDNF在海馬中的表達(dá)和認(rèn)知功能呈現(xiàn)正相關(guān)性，在部分AD 轉(zhuǎn)基因動物和老齡動物的海馬中表達(dá)降低，且TrkB 的活性受到抑制［24］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，AD 大鼠海馬組織BDNF 蛋白表達(dá)降低，TrkB 信號通路受到抑制（即TrkB 磷酸化水平降低）； 而銀杏二萜內(nèi)酯葡胺則能升高BDNF 蛋白表達(dá)并激活TrkB 通路。

綜上所述，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺可改善AD 大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制可能與增加突觸相關(guān)蛋白NR2B 磷酸化水平和PSD95、BDNF 表達(dá)，并激活下游CaMK Ⅱ/ERK/CREB 和TrkB 信號通路相關(guān)。