葉黃素生物活性和環(huán)境因素對其穩(wěn)定性影響研究進展

于良曉，郭 遠，翟曉娜，裴海生，李媛媛

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地初加工重點實驗室，北京 100125）

葉黃素是C40的萜類化合物，系統(tǒng)命名為3,3’-二羥基-β,α-胡蘿卜素，分子式為C40H56O2，相對分子質(zhì)量為568.87，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。葉黃素由兩個不同的紫羅酮環(huán)和一個含多個共軛雙鍵的碳鏈連接構(gòu)成，有3個手性中心，8個立體異構(gòu)體[1-2]。近年來，葉黃素對改善認知、治療年齡相關(guān)的黃斑疾病、緩解心血管疾病等的作用越來越明顯，因此，科學(xué)界推薦葉黃素為理想膳食的一種基本營養(yǎng)素[3-6]。

圖1 葉黃素的分子結(jié)構(gòu)[7-8]Fig.1 Molecular structure of lutein[7-8]

葉黃素生物合成包括多步復(fù)雜的次生代謝反應(yīng)，涉及多種生化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，如八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、番茄紅素β環(huán)化酶、胡蘿卜素β環(huán)羥化酶等[7,9]。由于人體中不存在葉黃素生物合成的關(guān)鍵酶，因此，葉黃素在體內(nèi)無法合成，必須通過膳食補充。葉黃素膳食來源如表1所示。

表1 葉黃素膳食來源[10-13]Table 1 Dietary sources of lutein[10-13] 單位：μg/100 g

在菠菜、甘藍等蔬菜及部分水果中，葉黃素主要以自由態(tài)形式存在；在萬壽菊、南瓜等植物花朵或果實中，葉黃素以酯化形式存在[14]。與自由型葉黃素相比，葉黃素酯的生物利用度較低。臨床試驗發(fā)現(xiàn)，人體推薦葉黃素的每日劑量為6 mg，然而，通過膳食補充，大多數(shù)人僅可獲得每日所需葉黃素的10%[8]。鑒于膳食葉黃素的平均攝入量遠低于人體所需的攝入量，開發(fā)富含天然葉黃素的膳食營養(yǎng)補充劑勢在必行。葉黃素目前以各種補充劑形式商業(yè)化，其市場被細分為食品、醫(yī)藥以及動物飼料等行業(yè)。2015年，葉黃素的全球市場價值約為1.35 億美元，預(yù)計到2024 年將以6%的增長率逐年增長，在歐盟，葉黃素的市場價值估計為2.55 億歐元，預(yù)計到2027 年將達到4.05 億歐元，可見，葉黃素有著廣闊的市場前景[5-6,15-16]。然而，在功能食品開發(fā)過程中，由于葉黃素結(jié)構(gòu)中具有共軛雙鍵組成的長發(fā)色團，使得葉黃素呈現(xiàn)橙黃色的同時也使其易于異構(gòu)化和氧化，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易被溫度、氧氣、pH 和光照等因素影響而發(fā)生降解，導(dǎo)致其在食品加工和醫(yī)藥等方面的應(yīng)用受到很大的限制[17-18]。

本文從葉黃素的提取方法著手，綜述葉黃素對預(yù)防多種疾病，如眼睛疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、腫瘤疾病、肥胖相關(guān)疾病等的功能作用，闡明影響天然葉黃素穩(wěn)定性的主要因素的研究進展，以期為天然葉黃素的推廣應(yīng)用和產(chǎn)品研發(fā)提供理論支撐。

1 葉黃素的提取方法

葉黃素的傳統(tǒng)提取方法是有機溶劑提取，為了提高效率，通常將有機溶劑提取法與其他方法聯(lián)合使用。本文系統(tǒng)總結(jié)了有機溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、酶輔助提取和超臨界CO2萃取5種葉黃素提取方法的提取原理及應(yīng)用實例，詳見表2。上述提取方法盡管較為常用，但是各有優(yōu)缺點。例如：有機溶劑提取法工藝簡單，成本低，但其提取時間長，提取率低，雜質(zhì)多，有機溶劑易殘留[19-20]；通過微波、超聲波或酶輔助提取葉黃素時會將植物細胞壁破碎，以促進有效成分溶出，其速度快，提取率高，但也存在缺點，如微波電場存在尖角集中性，微波加熱可能使原料受熱不均發(fā)生熱劣變，超聲波使用過程中不采取安全措施可能會損傷操作員的聽力；酶過量可能導(dǎo)致可溶性糖和酸的釋放，從而抑制酶活性，降低葉黃素提取率[21-25]；使用超臨界CO2萃取法無溶劑殘留，無污染，避免了萃取物質(zhì)在高溫下發(fā)生熱劣變，不破壞活性成分，但也存在成本高的缺點[25-26]。據(jù)此，在未來研究中，應(yīng)創(chuàng)新葉黃素提取工藝及提取技術(shù)，提高產(chǎn)業(yè)效率，拓寬其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。

表2 葉黃素提取方法的原理及應(yīng)用實例Table 2 Principle and application of lutein extraction method

2 葉黃素的功能作用

近年來，我國居民生活水平逐漸提高，營養(yǎng)供給能力顯著增強，膳食相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展備受關(guān)注?；诖?，我國實施了健康中國戰(zhàn)略的重大決策部署，制定了《國民營養(yǎng)計劃（2017—2030年）》，印發(fā)了《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》，發(fā)布了《中國居民膳食指南（2022）》，以期通過膳食營養(yǎng)干預(yù)改善我國居民營養(yǎng)健康問題。大量研究報道了葉黃素的健康效應(yīng)，本文重點關(guān)注天然葉黃素預(yù)防和改善眼睛疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、腫瘤疾病、肥胖相關(guān)疾病作用效果，其主要功能作用總結(jié)如圖2所示。

圖2 葉黃素的功能作用[11,18,35-38]Fig.2 The function of lutein[11,18,35-38]

2.1 預(yù)防眼睛疾病

黃斑是人類和靈長類動物視網(wǎng)膜中的一種特殊結(jié)構(gòu)，它的中心是視力最高的區(qū)域，年齡相關(guān)性黃斑疾?。ˋMD）會導(dǎo)致階段性的視力損害甚至失明。此外，白內(nèi)障由晶狀體渾濁引起，可導(dǎo)致漸進性視力損害、視力模糊等，是目前另一個嚴重的眼睛健康問題，也是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致失明的主要眼疾[13,39]。一些流行病學(xué)和干預(yù)研究表明，葉黃素與AMD 和白內(nèi)障的發(fā)病率降低有關(guān)，每天膳食中補充10～20 mg 葉黃素可能會阻止AMD 的發(fā)展，且葉黃素攝入量與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病率呈負相關(guān)[12,40-41]。葉黃素減少黃斑變性和白內(nèi)障形成的機制是通過增加眼部組織的黃斑色素沉著，這有助于過濾有害的藍光，從而減少組織的氧化損傷[42-43]。Widomska 等[42]通過對患有AMD和未患AMD的人群對比研究發(fā)現(xiàn)，患有AMD的人群眼睛中葉黃素含量比未患AMD 的人群含量低，進而證實了葉黃素對AMD的改善作用。Li等[37]通過體外試驗評估了葉黃素對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞抗氧化應(yīng)激和缺氧的影響，發(fā)現(xiàn)采用10、20 μmol/L的葉黃素處理后細胞數(shù)量明顯增加，當(dāng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞受到CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)缺氧或H2O2觸發(fā)的氧化應(yīng)激時，葉黃素可以保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞免受損傷。Sahin等[44]發(fā)現(xiàn)，葉黃素可通過調(diào)節(jié)大鼠G蛋白偶聯(lián)受體和生長因子來減輕光氧化視網(wǎng)膜損傷，因此葉黃素可被認為是預(yù)防早期感光細胞變性和中和氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基的輔助療法。

2.2 預(yù)防神經(jīng)退行性疾病

隨著世界人口老齡化問題的日益突出，阿爾茲海默癥、帕金森癥等與衰老緊密相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病正在嚴重威脅著老年人的健康。二十二碳六烯酸（DHA）是一種存在于大腦中的多不飽和脂肪酸，對兒童的發(fā)育和功能改善及維持成年人的神經(jīng)功能至關(guān)重要。然而，DHA 的存在和強烈的代謝活動會產(chǎn)生攻擊大腦的自由基。研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素是神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高的類胡蘿卜素，是可變的定位膜區(qū)域內(nèi)豐富的多不飽和脂肪酸，葉黃素可通過提高負責(zé)細胞內(nèi)自由基清除過程的谷胱甘肽水平、通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、通過抑制核因子κB（NF-κB）發(fā)揮清除自由基和抗氧化應(yīng)激的作用[38，45]，抑制DHA氧化，提高膜的穩(wěn)定性和流動性，并使DHA能夠儲存以供使用且進一步轉(zhuǎn)化為抗炎化合物，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和維持正常功能都具有重要意義[45]。此外，武萬強[46]研究表明，葉黃素可以顯著改善脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷，也能夠顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞中炎癥因子水平，同時葉黃素通過激活蛋白激酶B信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Liu等[47]研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素可以通過調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮細胞中NF-κB的表達來抑制淀粉樣β蛋白的誘導(dǎo)毒性，進而改善線粒體膜電位和細胞活性，發(fā)揮改善神經(jīng)退行性疾病的作用。

2.3 預(yù)防心血管疾病

人體內(nèi)膽固醇、脂蛋白的堆積等是造成動脈粥樣硬化，進而產(chǎn)生心血管疾病的重要原因。流行病學(xué)、體外試驗和動物模型研究表明，葉黃素在一定程度上能夠通過防止動脈粥樣硬化的發(fā)生來降低心腦血管疾病的發(fā)病率[45]。Zou等[48]在隨機臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，按時定量服用葉黃素的治療組的動脈內(nèi)膜中層厚度顯著降低，說明葉黃素對于心血管疾病具有預(yù)防作用。如圖3所示，葉黃素通過以下幾個途徑發(fā)揮預(yù)防和調(diào)節(jié)心血管疾病的作用：①調(diào)節(jié)清道夫受體-B1（SR-B1）；②調(diào)節(jié)細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK），參與細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子Nrf2信號通路的激活；③通過抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶等活性，阻斷NF-κB通路；④通過抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）參與CJUN氨基末端激酶（JNK）的活性；⑤通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α（PGC-1α）并隨后促進肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A（CPT1A）的產(chǎn)生。

圖3 葉黃素調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的可能機制[36]Fig.3 Possible mechanisms by which lutein regulates atherosclerosis[36]

此外，葉黃素由于極性高、共軛雙鍵多，比其他類胡蘿卜素的抗氧化活性更強，有著較強的自由基清除能力[36]?；谌~黃素抗氧化作用，其發(fā)揮預(yù)防心血管疾病作用的途徑是共軛多烯鏈失去一個電子形成陽離子自由基，使氧自由基還原，從而抑制活性氧的活性，阻止活性氧對正常細胞的破壞[45]。其中，活性氧可與脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生反應(yīng)，削弱它們的生理功能，進而引發(fā)心血管疾病等慢性病。葉黃素能猝滅單線態(tài)氧，捕獲氧自由基，防止自由基對生物膜的損害，從而發(fā)揮預(yù)防心血管疾病的作用[1]。

2.4 預(yù)防腫瘤疾病

近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素具有抑制結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的作用，葉黃素主要通過抑制腫瘤細胞增殖和分化、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等途徑抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[20,49]。紐約大學(xué)藥物學(xué)院通過試驗發(fā)現(xiàn)，葉黃素低攝入量組的乳腺癌發(fā)病率是高攝入量組的2.08～2.21 倍，這說明二者緊密相關(guān)，所以在膳食中攝入葉黃素可以一定程度上預(yù)防腫瘤的發(fā)生[20]。Madaan等[50]提出，葉黃素能夠抑制EC9706 細胞的增殖，表明參與食道癌細胞增殖和分化的蛋白會受到葉黃素的調(diào)節(jié)，從而有效抑制食道癌。Sumantran 等[51]研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素可在低分化的乳腺細胞中選擇性地誘導(dǎo)細胞凋亡，但不會誘導(dǎo)正常人的乳腺細胞凋亡，這說明葉黃素在癌細胞凋亡的調(diào)節(jié)中起重要作用。

2.5 預(yù)防肥胖相關(guān)疾病

近年來，全球居民膳食結(jié)構(gòu)變化顯著，高脂食物攝入量陡然增加。過量的脂肪攝入會破壞機體能量代謝和物質(zhì)代謝平衡，增加肥胖、Ⅱ型糖尿病和一些癌癥的發(fā)病風(fēng)險[52]。Gopal 等[53]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食（HFD）同時補充葉黃素16 周（每日10 mg/kg）可顯著降低HFD 誘導(dǎo)的肥胖小鼠的食欲和食物攝取量；與未口服葉黃素的高脂組小鼠相比，葉黃素干預(yù)組可顯著降低HFD 誘導(dǎo)的體重增加（體重降低45%），該作用主要歸因于葉黃素部分地提高了瘦素（LP）的敏感性。LP 是機體受到胰島素刺激時，由脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類飽食誘導(dǎo)激素[14]，葉黃素通過引起下丘腦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少和LP受體信號傳導(dǎo)活化，LP進一步調(diào)控體內(nèi)荷爾蒙黑色素細胞刺激激素的活躍程度，產(chǎn)生飽腹感，發(fā)揮減肥的作用。Cheng等[54]研究表明，葉黃素可通過激活A(yù)MPK途徑來減輕游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細胞氧化應(yīng)激和抑制脂質(zhì)堆積。Sindhu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素通過抑制負責(zé)激活脂肪細胞的轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）的活性，起到抑制前脂肪細胞增殖分化的作用。PPARγ的活化可下調(diào)炎癥因子，如TNF-α、LP和白細胞介素-6（IL-6）的表達，并誘導(dǎo)脂聯(lián)素（一種使肝臟和肌肉對胰島素敏感的脂肪因子）的表達，進而調(diào)節(jié)胰島素的敏感性，干預(yù)脂肪細胞分化，發(fā)揮降脂作用[52]。此外，一些研究發(fā)現(xiàn)：葉黃素也可提高高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠血清中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，保護小鼠免受高脂飲食導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷；抑制高脂喂養(yǎng)大鼠體內(nèi)脂肪吸收代謝相關(guān)酶和胰脂肪酶的活性；降低血清中甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平，起到減肥的作用[49-52]。上述研究均表明，給予膳食補充葉黃素是預(yù)防肥胖的一種潛在策略。

3 影響葉黃素穩(wěn)定性的因素

雖然葉黃素具有多種生物活性，但由于其獨特的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，在加工過程中易被降解[18]，為了更好地發(fā)揮葉黃素的生物活性，現(xiàn)對影響葉黃素穩(wěn)定性的因素進行分析。葉黃素具有多個共軛雙鍵，結(jié)構(gòu)上有全反式和順式構(gòu)象之分，常見的有全反式、9-順式、9’-順式、13-順式、13’-順式葉黃素等。天然的葉黃素以全反式構(gòu)象為主，它不僅結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，在生物體內(nèi)的活性也更強[16]。在加工過程中，全反式葉黃素會發(fā)生一定的異構(gòu)化反應(yīng)，造成葉黃素的降解[40,55]，生物活性下降。其中，影響葉黃素穩(wěn)定性的主要環(huán)境因素如圖4所示。

圖4 環(huán)境因素對葉黃素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of environmental factors on stability of lutein

3.1 氧氣

由于葉黃素含有許多不飽和雙鍵，且兩個紫羅酮環(huán)均連有羥基，因此葉黃素降解最常見的原因是氧化。水果和蔬菜干燥過程中，葉黃素暴露于空氣中，可能會發(fā)生非酶氧化，導(dǎo)致葉黃素結(jié)構(gòu)發(fā)生異構(gòu)化。氧化發(fā)生的速率與光照、溫度、pH及促氧化劑和抗氧化劑的存在有關(guān)[13,17]。Kobori 等[56]研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素在加工過程中除了最基本的環(huán)氧化、羥基化外，葉黃素多烯鏈的直接斷裂還會形成無色的小分子化合物，同時葉黃素的生物活性也會喪失。Boon等[3]研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素一旦開始氧化，便可能會進一步與自身或環(huán)境中的其他化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成更多的產(chǎn)物，從而影響葉黃素品質(zhì)。因此，為了減少損失，加工過程中應(yīng)減少葉黃素與空氣的接觸。

3.2 溫度

在加工過程中，食品需要通過煮、炒或蒸等方式暴露在高溫下。葉黃素會不可避免地受到加熱、空氣等影響，其中前者影響更為顯著[4,40]，由于葉黃素的所有雙鍵都以異構(gòu)體的形式存在，高溫加熱能使全反式葉黃素異構(gòu)化為順式異構(gòu)體，甚至裂解為環(huán)氧化物、羥基氧化物[4,57-60]。李秀鑫等[57]研究發(fā)現(xiàn)，60 ℃時葉黃素的保留率為96.5%，而100 ℃時下降至67%，說明葉黃素在高溫條件下較不穩(wěn)定。Barba 等[58]發(fā)現(xiàn)，熱處理會引起類胡蘿卜素的大量損失，但適當(dāng)?shù)臒崽幚頃黾宇惡}卜素的生物利用度。Kim 等[59]發(fā)現(xiàn)，在菠菜熱加工過程中，溫度從4 ℃上升至55 ℃會導(dǎo)致葉黃素的半衰期從116 d 下降至10 d，降解十分明顯。分析原因為熱處理下導(dǎo)致菠菜細胞壁和細胞膜破壞，促使葉黃素溶出，全反式構(gòu)象會部分轉(zhuǎn)變成順式結(jié)構(gòu)（9-順式和13-順式葉黃素），其穩(wěn)定性下降，從而導(dǎo)致葉黃素的降解，生物活性顯著降低。綜上可知，葉黃素的熱降解是一種常見的現(xiàn)象，在食品加工過程中，將葉黃素保持在安全的溫度范圍至關(guān)重要。

3.3 pH

在食品加工過程中，pH影響著許多現(xiàn)象和過程，例如，蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變（變性、凝膠化、酶活性）、微生物的生長和死亡以及美拉德反應(yīng)等。不同的pH條件下，葉黃素會產(chǎn)生不同的變化，低于4.0 或高于8.0的極端pH 值情況下，葉黃素會發(fā)生去酯化和順/反異構(gòu)化，導(dǎo)致顏色損失[60-61]。李季楠等[61]研究發(fā)現(xiàn)，pH 6.0～12.0范圍內(nèi)對葉黃素納米乳液體系中葉黃素穩(wěn)定性的影響不顯著，而當(dāng)以pH 2.0處理后，葉黃素的降解量明顯增大，且此時自由基清除活性明顯降低。因此，在食品加工過程中，要控制合適的pH，否則不僅會導(dǎo)致葉黃素的降解，對于食品的顏色和風(fēng)味等也會造成不利影響。

3.4 光照

光照對于葉黃素具有明顯的降解作用，這是由于光加速葉黃素分子鏈的氧化，載色體降解斷裂，形成低分子量化合物，使葉黃素失去顏色。同時，葉黃素的共軛多烯鏈發(fā)生去質(zhì)子化、失去電子的同時葉黃素的穩(wěn)定性降低[35,62]。Kline 等[63]研究發(fā)現(xiàn)，隨著光照時間的延長，葉黃素在提取液中的保留量逐漸減少，放置2周時，于448 nm 下測定日光照射的葉黃素損失率達37.24%。Ma 等[64]在探究細胞培養(yǎng)條件時發(fā)現(xiàn)，光照易引起葉黃素的色素分解，高光照強度（750 μmol·m-2·s-1）會降低葉黃素含量。Xiao 等[13]用紫外燈（365 nm）照射葉黃素2 h后，發(fā)現(xiàn)游離葉黃素的保留率為8.62%，表明90%以上的游離葉黃素被破壞，而同等條件下的葉黃素-多糖復(fù)合體的保留率達79.93%，這也為今后葉黃素的應(yīng)用提供了新的思路。綜上可知，在食品加工過程中應(yīng)盡量避免光照，以提高葉黃素的穩(wěn)定性。

4 結(jié)束語

隨著消費者對天然、綠色、健康食品需求的增加，天然葉黃素的潛在市場空間巨大。盡管現(xiàn)有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葉黃素在預(yù)防眼睛疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、腫瘤疾病、肥胖相關(guān)疾病等方面的功能作用，然而關(guān)于葉黃素生物活性實現(xiàn)機制及其在人體中的吸收、代謝途徑和作用機制等的研究值得深入探索。此外，葉黃素的開發(fā)利用還存在諸多問題，如加工過程中氧氣、溫度、pH、光照等都會對葉黃素產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致其發(fā)生降解。因此，應(yīng)更廣泛地探索可提高葉黃素穩(wěn)定性和生物利用度且又不影響葉黃素生物活性的加工技術(shù)，如納米乳液和微膠囊等技術(shù)。同時，來自同一基質(zhì)的葉黃素的生物可及性和生物利用度受食物基質(zhì)的內(nèi)在特性、加工方式以及某些膳食成分的影響，所有這些因素都不是單獨作用，而是相互影響。因此，在未來研究中，應(yīng)該進一步研究葉黃素與食品組分的相互作用，基于上述探索，期望未來不斷實現(xiàn)葉黃素的工業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)。