基于16S rRNA測序分析CRE定植對ICU患者腸道微生物的影響

康 佳,趙志軍,2,賈 偉,2

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心,寧夏 銀川 750000; 2.寧夏病原微生物重點實驗室,寧夏 銀川 750000)

耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistantEnterobacterales,CRE)感染治療可選擇的藥物非常少,病死率高,給公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]?；颊吣c道CRE定植是發(fā)生CRE感染常見的來源[2],且多項研究[3-5]表明,腸道CRE定植會增加重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)患者感染及死亡的風(fēng)險。然而,CRE定植的機(jī)制及其發(fā)展為感染的機(jī)制尚不明確。

腸道微生物群的改變不僅與多種感染性疾病相關(guān)[6-7],而且腸道菌群失調(diào)與克羅恩病[8]和慢性阻塞性肺疾病[9]的進(jìn)展相關(guān)。此外,有研究[10]證明,腸道微生物群與炎癥相關(guān),可以利用腸道微生物的特定分類和功能譜的鑒定區(qū)分細(xì)菌性肺炎和病毒性肺炎[11]。最近的一項研究[12]表明,通過改變腸道微生物的組分(糞便菌群移植)可有效去除腸道CRE定植。這些證據(jù)都提示腸道微生物可能在CRE定植及感染中扮演重要角色。因此,本研究的目的是基于16S rRNA測序分析CRE定植對ICU患者腸道微生物的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2020年6—12月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院入住ICU時間>48 h患者的糞便或肛拭子標(biāo)本,每例收集一份,剔除同一患者的重復(fù)標(biāo)本。納入患者標(biāo)準(zhǔn):在排除污染的情況下,糞便或肛拭子中檢測出CRE但患者無感染相關(guān)的臨床表現(xiàn),則被認(rèn)為CRE定植。排除標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)國家衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》[13]判定為 CRE感染的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 CRE篩查及鑒定 用無菌棉拭子采集ICU患者新鮮的糞便或肛拭子標(biāo)本,直接接種于含有2 μg/mL厄他培南的MacConkey平板上培養(yǎng)。若培養(yǎng)基上有菌落生長,對生長出的菌落進(jìn)行分離純化后采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進(jìn)行菌種鑒定,并采用紙片擴(kuò)散法對菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗;針對初步鑒定為CRE的菌株,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增菌株16S rDNA片段,并采用微量肉湯稀釋法最終確定CRE。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上進(jìn)行比對。質(zhì)控菌株大腸埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705均來自該院醫(yī)學(xué)實驗中心。藥敏試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)指南[14]。引物序列為27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,1492R:GGTTACCTTGTTACGACT;擴(kuò)增條件:94℃ 5 min,(94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 45 s)×30,72℃ 5 min。

1.2.2 腸道微生物群檢測 采用QIAamp cador Pathogen Mini Kit試劑盒提取糞便或肛拭子標(biāo)本基因組DNA約30 ng,質(zhì)檢合格后使用其對應(yīng)的融合引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后使用Agencourt AMPure XP磁珠對擴(kuò)增產(chǎn)物純化后完成建庫。Agilent 2100 Bioanalyzer檢測合格的文庫在HiSeq平臺進(jìn)行16S rRNA測序。數(shù)據(jù)過濾后得到的Cleandata用于后期分析。分析時先將雙末端測序得到的成對reads用FLASH軟件組裝成一條序列,得到高變區(qū)的Tags。再用USEARCH軟件將拼接好的Tags聚類為OTU,并將其與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。最后,根據(jù)OTU比對和注釋結(jié)果對標(biāo)本進(jìn)行物種注釋、物種復(fù)雜度分析、組間物種差異分析,以及關(guān)聯(lián)分析。此部分由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用R軟件對微生物豐度差異及通路差異進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗,P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICU患者腸道CRE定植 共收集ICU患者糞便或肛拭子標(biāo)本241份,其中CRE陽性標(biāo)本17份,陽性率為7.05%。17株CRE陽性標(biāo)本中大腸埃希菌9株(52.94%),肺炎克雷伯菌7株(41.18%),陰溝腸桿菌1株(5.88%)。CRE來源科室分別為綜合ICU(12株)、呼吸科ICU(3株)、兒科ICU(2株),冠心病ICU、精神科ICU及急診ICU未篩查出。見表1。

表1 腸道CRE定植菌株科室來源分布

2.2 ICU患者腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)特征 采用16S擴(kuò)增子V3～V4區(qū)測序共分離到726 OTUs,未定植組有631 OTUs,定植組有480 OTUs,兩組間共有385 OTUs,見圖1。Shannon多樣性指數(shù)曲線提示數(shù)據(jù)量足夠大,可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息,見圖2。

圖1 CRE定植組與非定植組Venn圖

圖2 CRE定植組與非定植組Alpha多樣性稀釋曲線圖

物種組成分析顯示,檢出OTUs絕大多數(shù)屬于厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門及放線菌門,見圖3a。CRE定植組與非定植組共有OTUs主要屬于腸球菌科、擬桿菌科、毛螺菌科和紫單胞菌科。定植組腸桿菌科、腸球菌科和擬桿菌科的優(yōu)勢更明顯,而非定植組瘤胃菌科、普雷沃菌科、肽鏈球菌科及梭狀芽孢桿菌科的優(yōu)勢更明顯,見圖3b。

注:a為門水平上物種組成柱形圖;b為科水平上物種組成柱形圖。

2.3 CRE定植對ICU患者腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 物種差異分析顯示,CRE定植組γ‐變形菌綱、擬桿菌綱、梭狀芽孢桿菌相對豐度較大,而非定植組梭狀芽孢桿菌、擬桿菌綱相對豐度較大;Wilcoxon秩和檢驗后得到兩組間γ-變形菌綱(W=193.000,P<0.001,FDR=0.004)和互營養(yǎng)菌綱(W=37.500,P=0.001,FDR=0.018)相對豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖4。

在種水平上,選取豐度前10的物種對比作圖發(fā)現(xiàn),CRE定植前后,肺炎克雷伯菌(W=195.000,P<0.001)、解糖腸球菌(W=153.000,P=0.038)及彎曲桿菌(W=63.500,P=0.050)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖5。

圖5 關(guān)鍵物種差異比較柱形圖

2.4 CRE定植對腸道代謝功能的影響 KEGG功能差異分析結(jié)果顯示,CRE定植組與未定植組富集到的KEGG通路非常相似,碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素的代謝相對豐度較高,而傳染病、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)退行性疾病相對豐度較低。對CRE定植組與未定植組的各個通路分別進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗,未發(fā)現(xiàn)ICU患者腸道CRE定植對腸道微生物KEGG功能通路有顯著影響,見圖6。

圖6 KEGG功能差異分析圖

3 討論

患者腸道CRE定植是發(fā)生CRE感染的一個重要危險因素[15]。在流行地區(qū),住院患者的 CRE 定植率為3%～7%[16],而 ICU患者的CRE定植率及分離率高于普通病房[17]。本研究中ICU總體CRE定植率為7.05%,低于國內(nèi)文獻(xiàn)[18-19]報道的10.90%和20.00%。呼吸科ICU與綜合ICU定植率最高,兒科ICU次之,而冠心病ICU、神經(jīng)科ICU和急診ICU未發(fā)現(xiàn)CRE定植患者,這可能與各科室床位數(shù)及采樣例數(shù)有關(guān)。此外,由于ICU工作人員多且流動性大,ICU患者病情危重、免疫力低下、侵入性治療操作多,這些原因?qū)е翴CU患者較普通科室患者更易發(fā)生感染。通過對ICU患者進(jìn)行CRE主動篩查,并對篩查陽性患者嚴(yán)格執(zhí)行感染預(yù)防與控制干預(yù)措施可以顯著減少ICU患者CRE感染的發(fā)生[16]。本研究篩查到的CRE為大腸埃希菌(52.94%)、肺炎克雷伯菌(41.18%)和陰溝腸桿菌(5.88%),與本地區(qū)報道的CRE流行病學(xué)調(diào)查[20]結(jié)果基本一致。

研究[21]報道,健康個體往往具有較高的微生物多樣性。另有研究[22]將CRE攜帶者與健康人群進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)CRE攜帶者的腸道菌群多樣性降低。本研究發(fā)現(xiàn)在ICU患者中,CRE非定植組比定植組具有更多的OTUs,CRE非定植組的微生物群組分更豐富。人體腸道微生物的組成相對恒定,以厚壁菌門和擬桿菌門為主,其次是放線菌門和疣微菌門[23]。本研究發(fā)現(xiàn)在ICU患者中,無論是CRE定植還是非定植患者,除了上述4類細(xì)菌以外,變形菌門都占有重要比例。有研究[24]指出變形菌門的豐度與炎癥相關(guān),可能在一定程度上解釋了這一現(xiàn)象。相對于CRE定植組,本研究在非定植組中發(fā)現(xiàn)瘤胃菌科更具優(yōu)勢,而這種菌對抗感染有幫助[21]。

為了探究CRE定植對ICU患者腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,本研究對物種差異進(jìn)行了分析,研究結(jié)果顯示兩組間γ-變形菌綱和互營養(yǎng)菌綱相對豐度存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。γ-變形菌綱的軍團(tuán)菌,如嗜肺軍團(tuán)菌(軍團(tuán)菌病的病原體)和貝氏柯克斯菌(Q熱的病原體),被廣泛認(rèn)為是人類病原體[25]。而目前對于互營養(yǎng)菌綱知之甚少。本研究顯示,在種水平上,肺炎克雷伯菌、解糖腸球菌及彎曲桿菌具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),與Sindi等[26]的研究結(jié)果類似,Sindi等[26]將造成這一差異的原因歸結(jié)為抗菌藥物的使用。研究[22]表明,某些腸桿菌目家族成員比其他成員更容易駐留在人類腸道中,一些細(xì)菌聚集在一起,形成一個由代謝產(chǎn)物驅(qū)動的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)互惠共生[27],而菌群的差異可以決定微生物群特異性代謝能力的改變,這些改變與全身感染的患病率增加有關(guān)[22]。本研究通過對KEGG功能差異進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)CRE定植組與非定植組各個通路的相對豐度高度相似,CRE定植組在營養(yǎng)物質(zhì)代謝方面相對豐度較高,而與疾病相關(guān)的功能通路相對豐度很低。對兩組間差異進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,并未發(fā)現(xiàn)腸道CRE定植對ICU患者腸道微生物KEGG功能通路有顯著影響,后期可通過增加樣本量,同時對患者臨床信息進(jìn)行分析以期有新的發(fā)現(xiàn)。

本研究表明,腸道CRE定植組患者腸道微生物多樣性降低,且與非定植組患者相比,肺炎克雷伯菌、解糖腸球菌及彎曲桿菌豐度上具有統(tǒng)計學(xué)差異。這些結(jié)果為以特定的細(xì)菌表達(dá)譜來區(qū)分CRE是否定植提供理論基礎(chǔ),但是否可以將以上幾種菌作為特定的標(biāo)志,以及通過改變細(xì)菌組成是否會影響CRE定植都有待進(jìn)一步研究。另外,通過重新引入特定菌株和/或用益生菌或糞便菌群移植來改變腸道微生態(tài),從而影響CRE定植及感染狀態(tài),也為CRE的預(yù)防及治療提供了新的思路。

另外,本研究存在一定的局限性,收集的病例數(shù)相對較少且缺乏對臨床數(shù)據(jù)的分析。后期可通過增加研究病例,同時結(jié)合患者臨床數(shù)據(jù)如基礎(chǔ)疾病及抗菌藥物使用情況等進(jìn)行分析,以期發(fā)現(xiàn)更加有意義的成果,為臨床CRE診治和防控提供支持依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。