5%依維菌素微乳劑注干預(yù)防松材線蟲(chóng)病效果評(píng)價(jià)

趙正萍，夏永剛，張 敏，江雅琴，李鑌洋，李興紅

（1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004； 2.國(guó)家林業(yè)和草原局南方天敵繁育與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410004； 3.浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311302； 4.順毅股份有限公司，浙江 臺(tái)州 318000）

松材線蟲(chóng)病是由松材線蟲(chóng) （Bursaphelenehus xylophilus）引起的、極具危險(xiǎn)性和毀滅性的國(guó)際檢疫性林業(yè)有害生物災(zāi)害，被稱為松樹(shù)“癌癥”［1］。自1982年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，疫情快速擴(kuò)散，并呈西進(jìn)北擴(kuò)之勢(shì)。根據(jù)國(guó)家林業(yè)和草原局公告（2023年第7號(hào)） （2023年松材線蟲(chóng)病疫區(qū)），截至2022年底，全國(guó)19個(gè)省（自治區(qū)、直轄市）737個(gè)縣（區(qū)、市）552 6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)28.39萬(wàn)個(gè)松林小班發(fā)生松材線蟲(chóng)病疫情［2-3］，張家界、泰山、黃山、秦巴山區(qū)、三峽庫(kù)區(qū)等國(guó)家重要生態(tài)區(qū)均發(fā)生疫情［4］。松材線蟲(chóng)病已成為威脅我國(guó)生態(tài)安全、生物安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的嚴(yán)重隱患。

當(dāng)前，注干施藥已成為保護(hù)生態(tài)景區(qū)名松樹(shù)和古松樹(shù)不受松材線蟲(chóng)病危害的主要措施之一［5］，注干藥劑成分主要有阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（以下簡(jiǎn)稱甲維鹽）、吡蟲(chóng)啉等［6-14］。但單一的藥劑長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生抗性，防治成本增加，防治效果欠佳。本試驗(yàn)測(cè)定和比較依維菌素和甲維鹽對(duì)松材線蟲(chóng)的室內(nèi)生物活性，通過(guò)林間打孔注藥試驗(yàn)，篩選5%依維菌素微乳劑對(duì)松材線蟲(chóng)病林間預(yù)防的最佳用量，以期為預(yù)防松材線蟲(chóng)病的新型注干藥劑的篩選、推廣應(yīng)用提供參考。

1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)地位于湖南省長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)坪塘街道栽培山小班（地理坐標(biāo)為112.838°E、28.037°N）。該地土壤為紅壤，排水條件好，林分為針闊葉混交林，其中馬尾松（Pinusmassoniana）占比為75%左右，樹(shù)齡13～15 a，長(zhǎng)勢(shì)基本一致，平均胸徑約18 cm。2020年，長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)被確定為松材線蟲(chóng)病疫區(qū)。

2 材料與方法

2.1 供試材料

試驗(yàn)藥劑分別為92%依維菌素原藥、71%甲維鹽原藥、5%依維菌素微乳劑和2.2%甲維鹽微乳劑，藥劑由順毅股份有限公司生產(chǎn)和提供。

供試靶標(biāo)為松材線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)，室內(nèi)用灰葡萄孢菌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（23±1）℃。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 依維菌素和甲維鹽對(duì)松材線蟲(chóng)的室內(nèi)活性測(cè)定

依據(jù)《農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則 殺線蟲(chóng)劑 第1部分：抑制植物病原線蟲(chóng)試驗(yàn) 浸蟲(chóng)法》［15］開(kāi)展本試驗(yàn)。具體方法為：用分析天平稱取一定質(zhì)量的92%依維菌素原藥、71%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽原藥，分別用二甲基亞砜溶解配制成1%母液，然后用含0.1%吐溫的蒸餾水配成預(yù)設(shè)濃度備用。依維菌素濃度分別為0.125、0.25、0.50、1.0、2.0 mg·L-1；甲維鹽濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg·L-1。采用浸蟲(chóng)法，在96孔板內(nèi)同時(shí)加入10μL上述濃度的供試藥劑和90 μL線蟲(chóng)懸浮液（3 000條·mL-1），混合后于（23±1）℃培養(yǎng)48 h，在顯微鏡下檢查線蟲(chóng)的存活情況，觸碰仍不能彎曲運(yùn)動(dòng)的計(jì)為死亡。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理的活蟲(chóng)數(shù)和死蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算各處理的校正死亡率，使用DPSV18.10數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，求出毒力回歸方程、LC50值、95%置信區(qū)間。

2.2.2 林間預(yù)防試驗(yàn)

（1）試驗(yàn)區(qū)設(shè)置

試驗(yàn)區(qū)共設(shè)5個(gè)處理，分別標(biāo)為A、B、C、D、E，每個(gè)處理為30棵馬尾松，設(shè)4個(gè)重復(fù)，按隨機(jī)區(qū)組排列。供試松樹(shù)均首次實(shí)施注干藥劑。林間試驗(yàn)藥劑處理方式及用量見(jiàn)表1。

表1 林間試驗(yàn)藥劑用量Tab.1 Dosage of trunk injection on pine w ilt disease

試驗(yàn)前，對(duì)項(xiàng)目區(qū)松材線蟲(chóng)病發(fā)生情況進(jìn)行本底調(diào)查，然后嚴(yán)格按照國(guó)家林業(yè)和草原局印發(fā)的《松材線蟲(chóng)病防治技術(shù)方案（2021年版）》對(duì)小班內(nèi)所有已經(jīng)枯死的松樹(shù)進(jìn)行清除。2021年12月10日，用電鉆在樹(shù)干基部距離地面20 cm處，斜向下45°打孔，孔直徑0.4～0.5 cm，孔深5～8 cm，每孔注射藥量最多為40 mL。擰斷藥劑瓶瓶尖，將瓶體插入孔中，按瓶子底部預(yù)留打孔點(diǎn)鉆孔通氣，3 d后待瓶中藥劑全部流入樹(shù)體后拔除空瓶并堵住插孔。

（2）效果調(diào)查

2022年12月2日，對(duì)試驗(yàn)區(qū)所有馬尾松逐株進(jìn)行調(diào)查，對(duì)明顯枯死和有枝條枯黃的全部進(jìn)行取樣檢測(cè)，鑒定其是否由松材線蟲(chóng)引起，排除干旱和其他致死原因。處理前病死數(shù)量參照該小班2021年冬季松材線蟲(chóng)病自然病死率（18.00%），即30株樹(shù)中因松材線蟲(chóng)病平均死亡5.40株。調(diào)查統(tǒng)計(jì)藥劑處理前后馬尾松病死樹(shù)情況及防治效果，計(jì)算公式為：病死樹(shù)減退率＝（處理前病死樹(shù)數(shù)量-處理后病死樹(shù)數(shù)量）／處理前病死樹(shù)數(shù)量×100%；防治效果＝（處理區(qū)病死樹(shù)減退率-空白對(duì)照區(qū)病死樹(shù)減退率）／（1-空白對(duì)照區(qū)病死樹(shù)減退率）×100%。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010和SPSS 24.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)各處理防治效果進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 依維菌素和甲維鹽對(duì)松材線蟲(chóng)的室內(nèi)活性比較

兩種藥劑對(duì)松材線蟲(chóng)的室內(nèi)活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。依維菌素濃度為 2.0、1.0、0.50、0.25、0.125 mg·L-1時(shí)，松材線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)校正死亡率分別為 87.69%、61.05%、46.32%、15.63%、6.25%；甲維鹽濃度為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 mg·L-1時(shí)，松材線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)校正死亡率分別為 70.53%、62.96%、46.15%、41.41% 和39.66%。松材線蟲(chóng)的死亡率均隨著依維菌素濃度和甲維鹽濃度的升高而增加。濃度-死亡率回歸分析顯示，依維菌素的回歸方程為y＝5.428 6+2.218 4 x，甲維鹽的回歸方程為y＝4.843 8+0.714 7 x。依維菌素和甲維鹽對(duì)松材線蟲(chóng)的LC50分別為0.640 9 mg·L-1和1.654 1 mg·L-1，表明依維菌素的活性顯著高于甲維鹽的活性。

表2 依維菌素和甲維鹽對(duì)松材線蟲(chóng)的室內(nèi)活性測(cè)定結(jié)果Tab.2 Indoor activity of ivermectin and emamectin against Bursaphelenehus xylophilus

3.2 林間預(yù)防效果

兩種藥劑注干施用對(duì)松材線蟲(chóng)病的預(yù)防效果見(jiàn)表3。一年后的試驗(yàn)調(diào)查可知：不同劑量5%依維菌素微乳劑和2.2%甲維鹽微乳劑均對(duì)松材線蟲(chóng)病具有一定的預(yù)防效果。A、B、C和D處理的平均病死樹(shù)減退率分別為 86.11%、95.37%、100.00%、86.11%，C處理的減退率最高。A、B、C和D處理對(duì)松材線蟲(chóng)的預(yù)防效果分別為92.11%、97.37%、100.00%和92.11%，各處理效果大小為C＞B＞A＝D。其中，C處理效果最好，顯著高于A處理和D處理，而C處理與B處理之間差異不顯著，因此5%依維菌素微乳劑的用量以1.5～2.0 mL·cm-1胸徑較為適宜。

表3 注干藥劑對(duì)林間松材線蟲(chóng)病預(yù)防效果Tab.3 Effect of trunk-injection agent against pine w ilt disease in field

4 結(jié)論與討論

依維菌素是阿維菌素的衍生物，也是一種新型廣譜、高效、低毒的大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲(chóng)藥。研究表明，依維菌素比阿維菌素結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、毒副作用更小、使用更安全且殺蟲(chóng)效果更好［16-17］，已廣泛用于牛、羊、馬、豬等家畜的胃腸道線蟲(chóng)、肺線蟲(chóng)和體外寄生蟲(chóng)的驅(qū)殺［18-19］，但尚未有用于松材線蟲(chóng)病預(yù)防的研究報(bào)道。本研究通過(guò)室內(nèi)活性測(cè)定和林間打孔注藥的方式，驗(yàn)證了依維菌素對(duì)松材線蟲(chóng)病的預(yù)防效果。處理48 h后依維菌素對(duì)松材線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的LC50為0.640 9 mg·L-1，5%依維菌素微乳劑林間打孔注藥對(duì)松材線蟲(chóng)病預(yù)防效果最高可達(dá)100%，建議在使用5%依維菌素微乳劑打孔注藥預(yù)防松材線蟲(chóng)病時(shí)，制劑用量以 1.5 ～2.0 mL·cm-1胸徑為宜，選擇在松材線蟲(chóng)病預(yù)防期或侵染初期的冬季使用。

目前，松材線蟲(chóng)病的防治工作困難大，疫情仍有可能進(jìn)一步擴(kuò)散，究其原因：一是主要寄主植物馬尾松在南方各地種植面積較大；二是傳播松材線蟲(chóng)病的主要媒介昆蟲(chóng)松褐天牛 （Monochamus alternatus）在松林均有分布，且部分縣市區(qū)的蟲(chóng)口密度較大；三是部分群眾防疫意識(shí)淡薄，人為攜帶病原傳播風(fēng)險(xiǎn)較大；四是目前能徹底除治松材線蟲(chóng)病的防控技術(shù)和特效藥劑少，特別是防治用的化學(xué)藥劑，40年來(lái)重復(fù)使用，存在有效成分單一、藥量不斷加大、持效期較短、環(huán)境污染較重、防治效率低、成本較高等嚴(yán)重問(wèn)題［20］。

當(dāng)前，注干施藥已成為名松樹(shù)和古松樹(shù)不受松材線蟲(chóng)病危害的主要措施之一，防治松材線蟲(chóng)病的注干藥劑成分主要為阿維菌素、甲維鹽、吡蟲(chóng)啉等。其主要機(jī)理是將此類內(nèi)吸性藥劑注入松樹(shù)木質(zhì)部后傳輸?shù)綐?shù)體其他部位，使松樹(shù)保持一定時(shí)期的毒效，當(dāng)松材線蟲(chóng)或天牛幼蟲(chóng)在樹(shù)體內(nèi)取食時(shí)，藥劑隨之進(jìn)入害蟲(chóng)體內(nèi)使其中毒死亡。本研究是在室內(nèi)生物活性測(cè)定的基礎(chǔ)上進(jìn)行林間藥效試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程中也未發(fā)現(xiàn)其對(duì)馬尾松產(chǎn)生藥害。試驗(yàn)結(jié)果表明，一定量的5%依維菌素微乳劑對(duì)松材線蟲(chóng)病具有良好的預(yù)防效果，可以作為替代阿維菌素、甲維鹽、吡蟲(chóng)啉類打孔注藥劑的新型藥劑。值得說(shuō)明的是，本次研究只進(jìn)行了小面積的試驗(yàn)，至于對(duì)施藥后藥劑在樹(shù)體不同部位的分布情況以及對(duì)松材線蟲(chóng)病防治的持久性，還有待進(jìn)一步深入研究。