金芪降糖片調控AMPK/NOX4/IRS1信號通路改善2型糖尿病大鼠肝臟胰島素抵抗機制研究

史麗偉 布天杰 史佩玉 連心逸 張美珍 倪青

2013年我國成人糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率為10.4%,DM患病人數(shù)約為1.144億,居全球首位[1]。從2000至2019年的20年間,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的患病率每年增長超過1.5%[2]。T2DM約占成人DM發(fā)病類型的90%以上。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)伴隨胰島β細胞功能缺陷所致的胰島素分泌減少是T2DM顯著的病理生理學特征[3]。目前積極改善IR仍是T2DM治療的關鍵策略之一[4]。金芪降糖片源自《備急千金要方》中治療消渴癥的經(jīng)典名方,由黃連、黃芪、金銀花組成,具有清熱益氣作用,用于治療消渴病氣虛內(nèi)熱證。研究發(fā)現(xiàn),金芪降糖片對T2DM具有一定療效,可以改善T2DM糖脂代謝、減輕IR及保護胰島β細胞功能[5-7]。氧化應激是T2DM大鼠糖脂代謝紊亂及IR的重要機制之一[8],研究擬探討金芪降糖片改善T2DM大鼠糖脂代謝、IR、氧化應激的作用以及改善T2DM大鼠肝臟IR的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

6周齡SPF級雄性SD大鼠40只,體質量(160±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號:SCXK(京)2012-0001],飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院SPF II級實驗動物中心,每籠5～6只。實驗前適應性飼養(yǎng)1周,飼喂標準大鼠合成飼料(購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司),自由飲用純凈水,環(huán)境溫度(22±2)℃,相對濕度45%～70%,人工控制室內(nèi)照明,予晝夜各12小時的規(guī)律光照,保持良好通風,實驗動物均受人道對待。

1.2 藥物

金芪降糖片由天津中新藥業(yè)集團股份有限公司隆順榕制藥廠生產(chǎn),0.56 g/片×12片×3板/盒,國藥準字Z10920027。鹽酸二甲雙胍片由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn),500 mg/片×20片/盒,國藥準字H20023370。鹽酸二甲雙胍成人(70 kg)每日常用劑量為1.5 g,金芪降糖片每日常用劑量為5.04 g,以成人(70 kg)每日每公斤體重用藥量的7倍作為大鼠等效劑量。臨用時用0.9%生理鹽水配制成混懸液,灌胃體積10 mL/kg。

1.3 試劑與儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、戊巴比妥鈉由美國SIGMA公司生產(chǎn);糖化血紅蛋白(hemoglobin a1c, HbA1c)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測試盒、丙二醛(malonaldehyde, MDA)測試盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)測試盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn);大鼠胰島素測試盒由上海睿鉑賽生物科技有限公司生產(chǎn)。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)α抗體、p-AMPKα(Thr172)抗體、胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)抗體、p-IRS-1(Ser307)抗體購自CST公司,還原型輔酶Ⅱ氧化酶-4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase type 4, NOX4)抗體購自Abcam公司,β-Actin內(nèi)參均購自博奧森生物技術有限公司;羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP均購自索萊寶生物有限公司。SynergyTMH1全功能酶標儀(BioTek公司,美國),離心機(TOMOS公司,美國),電熱恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠),磁力加熱攪拌器(江蘇金城國勝實驗儀器廠),高速恒溫冷凍離心機(eppendorf公司,德國),蛋白印跡電泳系統(tǒng)(Bio-rad公司,美國),全自動凝膠成像系統(tǒng) (Bio-rad公司,美國)轉移電泳儀(北京六一儀器廠),電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.4 分組與模型制備

將40只SPF級雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周,隨機分為正常飲食組10只和高脂飼料飲食組30只。正常飲食組飼喂標準普通飼料,高脂飲食組飼喂高脂飼料(購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司,配方如下:基礎飼料68.1%、蔗糖10%、豬油10%、蛋黃粉10%、1.5%膽固醇、0.4%膽酸鹽)。各組大鼠分別飼養(yǎng)4周后禁食12小時,高脂飲食組大鼠一次性予30 mg/kg STZ(0.1 mol/L pH 4.0檸檬酸緩沖液配制,現(xiàn)配現(xiàn)用)腹腔注射,正常飲食組大鼠予30 mg/kg 檸檬酸緩沖液腹腔注射。STZ注射72小時后,尾靜脈采血測定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),若FBG>11.1 mmol/L,即認為T2DM造模成功。高脂飼料組大鼠30只共建模成功24只T2DM大鼠,將其隨機分為模型組、二甲雙胍組、金芪降糖片組,每組8只,正常飲食組大鼠10只作為空白對照組?？瞻讓φ战M、模型組分別予0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃,二甲雙胍組和金芪降糖片組分別予10 mL/kg的鹽酸二甲雙胍片、金芪降糖片混懸液,干預7周。

1.5 血清及組織標本的制備

各組大鼠干預7周后禁食12小時,30 mg/kg 3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。麻醉滿意后分離腹主動脈取血,將血樣置于EP管中室溫靜置30分鐘,隨后在4℃條件下,3 000 rpm離心10分鐘,取上清分裝,-80℃保存?zhèn)溆?。各組大鼠處死后,取下整個胰腺、肝臟。各組分別從大鼠胰腺中、尾部相同部位及肝臟中葉相同部位迅速剪取部分胰腺和肝臟組織,生理鹽水漂洗干凈,浸泡于10%福爾馬林中固定,行胰腺、肝組織蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色及肝糖原染色(periodic acid schiff, PAS)。剩余胰腺、肝組織置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀測指標

觀察給藥前后大鼠的一般情況,各組大鼠給藥前、給藥后4周及7周各測FBG。采用HbA1c、空腹胰島素(fasting blood insulin,FINS)、SOD、MDA、GSH檢測試劑盒分別檢測HbA1c、FINS、SOD、MDA、GSH水平。應用胰島素抵抗指數(shù)(homeostatic model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)評估IR,HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS (μU/mL)/22.5。采用全自動生化分析儀檢測肝功能、血脂四項[總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglycerides, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)]。肝臟、胰腺HE染色及肝臟PAS染色按照標準操作流程進行。

各組大鼠干預7周后禁食12小時,麻醉取血樣后處死,迅速取下整個肝臟,-80℃保存?zhèn)溆?。空白對照組、模型組及藥物干預組每組選取3只大鼠,采用免疫蛋白印跡法檢測肝組織AMPK/NOX4/IRS1相關信號通路蛋白表達水平。肝組織預處理及細胞蛋白提取均在冰上或4℃進行。加入裂解液1 mL進行研磨,BCA法測定蛋白濃度并將各組濃度調平,蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳后轉移至PVDF膜,用封閉液按照 1∶1 000比例稀釋一抗AMPK、p-AMPK(Thr172)、NOX4、IRS-1、p-IRS-1(Ser307)蛋白表達,4℃搖床過夜。一抗孵育結束,室溫下TBST洗膜3次,每次10分鐘。按照 1∶2 000比例稀釋山羊抗兔IgGHRP抗體,室溫孵育1小時,以TBST洗膜3次,每次10分鐘。ECL化學發(fā)光法顯影,采用ImageJ 1.52軟件進行蛋白條帶分析。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 金芪降糖片對T2DM大鼠體質量的影響

實驗中發(fā)現(xiàn),正常組大鼠毛發(fā)光澤,活動正常,對外界環(huán)境刺激反應靈敏;模型組大鼠毛發(fā)枯槁,多飲、多尿,行動遲緩,易驚易躁。大鼠造模成功后,各組大鼠體質量無統(tǒng)計學差異。藥物干預2周、4周、7周后,金芪降糖片組大鼠、二甲雙胍組大鼠與模型組大鼠體質量變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05),對照組大鼠體質量明顯大于模型組和各藥物干預組大鼠體質量(P<0.01),見表1。

表1 金芪降糖片對T2DM大鼠體質量的影響

2.2 金芪降糖片對T2DM大鼠FBG的影響

與空白組比較,模型組大鼠FBG明顯升高(P<0.01)。各組藥物干預前FBG水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。金芪降糖片組、二甲雙胍組分別干預4周、7周后FBG水平均較模型組明顯下降(P<0.01)。二甲雙胍組藥物干預4周、7周后FBG水平低于金芪降糖片組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 金芪降糖片對T2DM大鼠FBG的影響

2.3 金芪降糖片對T2DM大鼠HbA1c及FINS的影響

模型組大鼠HbA1c、FINS、HOMA-IR明顯高于空白對照組(P<0.05)。與模型組比較,金芪降糖片組與二甲雙胍組HbA1c、FINS、HOMA-IR水平均低于模型組(P<0.05),兩藥物組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。兩藥物干預組HbA1c水平與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。金芪降糖片組FINS水平高于空白對照組(P<0.05)。金芪降糖片組、二甲雙胍組HOMA-IR均高于空白對照組(P<0.05)。見表3。

表3 金芪降糖片對T2DM大鼠HbA1c、FINS、HOMA-IR的影響

2.4 金芪降糖片對T2DM大鼠氧化應激指標的影響

模型組T2DM大鼠SOD、GSH水平明顯低于空白對照組(P<0.05),MDA水平明顯高于空白對照組(P<0.05)。金芪降糖片干預7周后T2DM大鼠SOD、GSH水平明顯高于模型組(P<0.05),MDA水平明顯低于模型組(P<0.05),且金芪降糖片組GSH水平明顯高于二甲雙胍組(P<0.05)。二甲雙胍干預7周后T2DM大鼠MDA水平明顯低于模型組(P<0.05),但SOD、GSH水平與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表4。

表4 金芪降糖片對T2DM大鼠SOD、GSH、MDA的影響

2.5 金芪降糖片對T2DM大鼠血脂的影響

模型組TC、TG水平明顯高于空白對照組(P<0.05)。金芪降糖片組TC、TG水平明顯低于模型組(P<0.05)。二甲雙胍組TC、TG水平與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？瞻讓φ战M、模型組、金芪降糖片組、二甲雙胍組LDL-C、HDL-C水平均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表5。

表5 金芪降糖片對T2DM大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響

2.6 金芪降糖片對T2DM大鼠肝功的影響

空白對照組、模型組、金芪降糖片組、二甲雙胍組ALT、AST差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表6。

表6 金芪降糖片對T2DM大鼠ALT、AST的影響

表7 金芪降糖片對T2DM大鼠AMPK、NOX4、IRS-1蛋白表達的影響

2.7 金芪降糖片對T2DM大鼠肝臟及胰腺組織病理形態(tài)的影響

空白對照組大鼠胰腺組織內(nèi),胰島多呈圓形或橢圓形細胞團,細胞團大小不一,結構規(guī)整,分散于胰腺腺泡之間,數(shù)量較多,胰島界限清晰,胰島內(nèi)細胞豐富,大小均勻,形態(tài)飽滿,排列緊密。與正常組大鼠比較,模型組胰島數(shù)目減少,分布稀疏,部分胰島組織萎縮,胰島呈不規(guī)則形,邊界不清,結構紊亂,胰島內(nèi)細胞腫脹,變形,胞質著色變淺,并可見核固縮或核缺失的死亡細胞。與模型組大鼠比較,各藥物干預組大鼠胰島數(shù)目及胰島內(nèi)細胞數(shù)目增加,胰島萎縮程度有所好轉,胰島結構較為完整,見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色、PAS染色及胰腺HE染色情況(×200倍)

空白對照組大鼠肝組織結構完整,肝小葉結構清晰,肝細胞以中央靜脈為中心向四周以放射狀整齊排列,肝竇規(guī)則,肝細胞索排列整齊。模型組大鼠肝細胞索排列紊亂,肝細胞多數(shù)腫脹,出現(xiàn)中到重度彌漫小泡性脂肪變性、空泡變性,胞漿內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂滴空泡,甚至部分肝細胞出現(xiàn)氣球樣、纖維化壞死。與模型組比較,各藥物干預組大鼠肝細胞排列較為均勻有序,細胞水腫及脂肪變性較模型組明顯減輕,見圖1。

空白對照組大鼠肝細胞胞質內(nèi)糖原顆粒呈紫紅色,含量豐富,顆粒分布均勻,染色深,細胞間界線清晰。T2DM模型組大鼠肝細胞存在明顯脂肪樣變性,細胞腫脹,胞質內(nèi)糖原顆粒分布較對照組明顯減少,部分肝細胞甚至出現(xiàn)糖原顆粒缺失。與模型組比較,金芪降糖片組、二甲雙胍組肝細胞糖原顆粒均呈增加趨勢,但糖原顆粒在肝細胞內(nèi)分布略差,分布欠均勻,見圖1。

2.8 金芪降糖片對T2DM大鼠AMPK、NOX4、IRS-1蛋白表達的影響

T2DM模型組大鼠p-AMPK(Thr172)蛋白表達較空白對照組明顯下調(P<0.05),NOX4、p-IRS-1(Ser307)蛋白表達明顯上調(P<0.05)。與模型組比較,金芪降糖片組p-AMPK(Thr172)蛋白表達明顯上調(P<0.05),金芪降糖片組、二甲雙胍組NOX4、p-IRS-1(Ser307)蛋白表達明顯下調(P<0.05),兩藥物組在NOX4、p-IRS-1(Ser307)蛋白表達方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組AMPK/NOX4/IRS1相關蛋白表達電泳見圖2。

注:A為空白對照組,B為模型組,C為金芪降糖片組,D為二甲雙胍組。

3 討論

DM屬于中醫(yī)“消渴病”范疇,且“病由熱生”,其發(fā)病與稟賦不足、臟腑柔弱、飲食失節(jié)、情志失調、勞逸過度、外感邪毒導致熱毒熾盛、陰虛燥熱有關,病程日久熱盛耗氣傷陰[9]。研究顯示,益氣養(yǎng)陰法治療T2DM可以顯著改善糖脂代謝及降低相關炎癥因子,改善IR,提高胰島素敏感性,修復胰島β細胞功能[10]。金芪降糖片出自《備急千金要方》,是治療消渴癥的經(jīng)典名方,由黃連、黃芪、金銀花組成,全方共奏清熱益氣之功,用于治療消渴病氣虛內(nèi)熱證。研究發(fā)現(xiàn),金芪降糖片單藥或聯(lián)合西藥用于消渴病氣虛內(nèi)熱證具有一定療效[11]。網(wǎng)絡藥理學研究發(fā)現(xiàn)金芪降糖片可多成分、多靶點、多通路改善IR、保護胰島β細胞功能[6,12],其治療DM的作用機制可能與調節(jié)細胞增殖與凋亡、減輕氧化應激及炎癥反應等有關[13]。氧化應激是由于機體受到刺激,細胞中的活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生過多和/或抗氧化防御機制減弱,導致ROS的生成和清除之間失衡,機體出現(xiàn)氧化應激狀態(tài)[14]。高血糖會上調慢性炎癥標志物,增加ROS產(chǎn)生,高濃度ROS誘導的氧化應激可以直接損傷胰腺β細胞功能、加重胰島素信號傳導通路障礙引起IR[14-16]。T2DM高脂、高糖、促炎因子等導致ROS產(chǎn)生過多造成氧化應激,同時使機體總抗氧化應激能力下降,包括SOD、GSH降低及MDA升高,從而加重氧化應激損傷,致使胰島β細胞損傷和加重T2DM IR[17]。因此,在改善T2DM糖脂代謝的同時,積極增強機體的總抗氧化應激能力具有重要意義。

金芪降糖片組及二甲雙胍組大鼠精神狀態(tài)、活動狀況及多飲、多尿癥狀較T2DM組大鼠明顯改善,這可能與高血糖狀態(tài)得到改善有關?？瞻讓φ战M大鼠體質量從第2周開始明顯高于模型組及各藥物干預組,模型組大鼠從第2周開始體質量逐漸緩慢增長,這可能與胰島β細胞功能損傷后有所恢復有關[18],金芪降糖片組、二甲雙胍片組體重增加與各組大鼠一般狀況、糖脂代謝、氧化應激以及肝臟、胰腺組織形態(tài)學改善相一致。T2DM早期血清高胰島素血癥是IR的重要標志,金芪降糖片與二甲雙胍組血糖水平、胰島素水平及HOMA-IR明顯低于模型組,藥物干預組血糖水平改善可能與IR減輕有關。同時,金芪降糖片組、二甲雙胍組血糖水平較模型組顯著下降,但是治療7周末血糖仍明顯高于空白對照組,然HbA1c水平治療7周末兩藥物干預組較模型組顯著降低,但與空白對照組無統(tǒng)計學差異,究其原因可能為HbA1c是血液中葡萄糖與血紅蛋白的氨基之間的非酶催化反應產(chǎn)物,反映過去8～12周總的血糖水平,然該實驗從建模成功到干預結束時間7周多,HbA1c未能充分體現(xiàn)出造模后總的血糖水平。T2DM模型組大鼠血清SOD、GSH水平降低而MDA水平升高,提示氧化應激存在。金芪降糖片組能顯著增加GSH、SOD水平而降低MDA水平,二甲雙胍組能顯著降低MDA水平,金芪降糖片組可以顯著改善T2DM大鼠氧化應激水平,這對于改善IR具有重要作用。各組大鼠ALT、AST水平無統(tǒng)計學差異,AST水平均高于正常值,這可能與空白對照組大鼠肥胖、模型組及各藥物干預組高脂飼養(yǎng)后肝臟脂肪變性有關。金芪降糖片組TC、TG水平明顯低于模型組,金芪降糖片對脂代謝改善可能有益于減輕IR。T2DM常合并非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD),IR是T2DM和NAFLD的共同病理基礎,IR可導致糖脂代謝紊亂、大量TG在肝臟沉積隨之引起氧化應激及炎癥反應,促使NAFLD發(fā)生發(fā)展,同時NAFLD促使糖脂代謝紊亂、加重IR,加劇T2DM并發(fā)癥發(fā)生[19-22]。結合肝臟HE染色、肝臟PAS染色可知,本實驗T2DM大鼠合并出現(xiàn)NAFLD,肝臟脂肪變性導致肝臟IR,金芪降糖片改善肝臟組織形態(tài)學、降低TG水平、增加肝糖原含量、減輕氧化應激等,從而對肝臟IR具有很好改善作用。此外,金芪降糖片組、二甲雙胍組胰腺組織形態(tài)學與模型組比較,大鼠胰島數(shù)目及胰島內(nèi)細胞數(shù)目增加,胰島萎縮程度有所好轉。

AMPK是調節(jié)能量代謝的重要蛋白分子,其激活主要調節(jié)肝糖異生和肝糖原合成而維持血糖穩(wěn)態(tài),同時也可以抑制NOX4源性氧化應激對機體損傷[23]。NOX4源性高濃度ROS可能是引起肝臟氧化應激損傷和肝臟IR的關鍵氧化酶。單一NOX4蛋白分子表達失調足以干擾肝臟IRS/磷脂酰肌醇-3-羥激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B, AKT)胰島素信號通路十幾種關鍵分子蛋白功能[24]。既往研究顯示,T2DM大鼠肝臟AMPK磷酸化蛋白表達下調,影響肝糖異生和肝糖原合成,同時影響肝臟氧化應激能力,是T2DM發(fā)生發(fā)展的重要機制[23]。T2DM大鼠肝臟IR與IRS1信號通路障礙有關,T2DM肝臟p-IRS-1(Ser307)蛋白過表達,會抑制IRS1酪氨酸磷酸化對PI3K/AKT信號通路的激活作用而影響胰島素信號傳導,引起IR[25]。本研究發(fā)現(xiàn),T2DM模型組大鼠p-AMPK(Thr172)蛋白表達明顯下調(P<0.05),而NOX4、p-IRS-1(Ser307)蛋白表達明顯上調(P<0.05),與既往研究結果一致,同時提示T2DM大鼠肝臟IR可能與AMPK/NOX4/IRS1信號通路蛋白表達異常進而影響胰島素信號傳導及氧化應激對胰島β細胞損傷有關。金芪降糖片組、二甲雙胍組分別干預7周后,其肝臟p-AMPK(Thr172)蛋白表達明顯上調(P<0.05),NOX4、p-IRS-1(Ser307)蛋白表達明顯下調(P<0.05),兩組上述蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。本研究結果顯示,金芪降糖片可能通過調控AMPK/NOX4/IRS1信號通路,進而改善胰島素信號傳導及減輕氧化應激對胰島β細胞損傷而改善T2DM肝臟IR。

綜上所述,金芪降糖片可以改善T2DM大鼠糖脂代謝,減輕氧化應激,改善肝臟及胰腺組織形態(tài)學,增加肝糖原含量,從而改善肝臟IR。金芪降糖片改善T2DM 肝臟IR的作用機制可能與其調控AMPK/NOX4/IRS1信號通路,激活相關蛋白表達有關。