腎氣丸加減方對高糖高脂誘導(dǎo)的MIN6細胞保護作用及PI3K/AKT/GSK-3β信號通路的影響

張月穎 張珊 溫志歌 史佩玉 王皓朔 倪青

胰島β細胞功能受損是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),故保護和恢復(fù)胰島β細胞功能是改善和治療2型糖尿病的重要策略。近年來研究者認為胰島內(nèi)分泌細胞間命運轉(zhuǎn)換是導(dǎo)致糖尿病胰島功能下降的重要原因[1-2],胰島β細胞“去分化”的發(fā)現(xiàn)拓展了β細胞功能損傷的機制范圍,去分化即β細胞在應(yīng)激狀態(tài)下退化成具有多分化潛能的前體細胞,喪失部分或全部胰島素分泌的能力,當(dāng)應(yīng)激環(huán)境解除后,其可再分化為具有正常分泌功能的β細胞,此過程與遺傳基因和后天環(huán)境因素有關(guān)[3-4]。既往研究證實,補腎法在糖尿病治療中可以起到降血糖、保護胰島細胞功能作用[5-7]。金匱腎氣丸出自經(jīng)書《金匱要略》,功用補腎填精,助陽化氣,本研究中藥腎氣丸加減方以金匱腎氣丸為基礎(chǔ)方加減化裁,去炮附子以防止其辛熱傷津,加黃芪、黨參健脾益氣,氣津雙補,胡蘆巴溫腎陽助氣化和馬齒莧清熱利濕以應(yīng)標(biāo)本兼顧治則。

胰島β細胞去分化機制為β細胞功能富集基因的下調(diào),其中比較關(guān)鍵的兩個基因為胰腺十二指腸同源盒基因(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)和肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物 A(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A,MafA),PDX-1是胰腺發(fā)育成熟過程中重要轉(zhuǎn)錄因子,對β細胞增殖和胰島素分泌功能起重要作用[8-9],MafA特異存在于胰島β細胞,與PDX-1共同促進胰島素基因表達,是胰島β細胞分化過程中重要激活因子[10-11],PDX-1和MafA可作為量化β細胞再生和功能“再恢復(fù)”的標(biāo)志物[12],其穩(wěn)定性受糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的影響。GSK-3β是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶,在能量代謝、細胞生長和凋亡中起重要作用[13],GSK-3β可調(diào)節(jié)胰島β細胞中PDX-1的穩(wěn)定性,其過度激活可導(dǎo)致胰島β細胞增殖減少和功能下降[14-15]。在此基礎(chǔ)上,本研究從β細胞凋亡角度基于磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸—蘇氨酸激酶/糖原合成激酶3β(phosphoinositide3-kinase/threonine-protein kinase/glycogen synthase kinase-3,PI3K/Akt/GSK-3β)信號通路探究腎氣丸加減方對高糖高脂作用下MIN6細胞功能影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

小鼠胰島β細胞(MIN6),購于上海雅吉生物科技有限公司,完成細胞及種屬鑒定。

1.2 實驗藥物

腎氣丸加減方藥物組成:生地黃24 g、生山藥12 g、山茱萸12 g、茯苓9 g、澤瀉9 g、牡丹皮9 g、桂枝3 g、黃芪12 g、黨參9 g、胡蘆巴6 g、馬齒莧9 g。含藥血清制備:健康SD大鼠20只,6～8周齡,體質(zhì)量300～350 g,購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后,隨機分為腎氣丸加減方含藥血清組及空白血清組。根據(jù)大鼠與人的藥物用量換算比(6.25∶1),每只大鼠的每日使用中藥灌胃劑量按以下公式計算:6.25×成人每日劑量(114 g生藥)/成人平均體重(70 kg)=10.2 g/(kg·d)?？瞻捉M予純凈水同等計量灌胃,每12小時灌胃一次,連續(xù)灌胃3.5天,使血藥濃度穩(wěn)定。最后一天灌胃結(jié)束2小時后,使用3%戊巴比妥鈉按照30 mg/kg腹腔注射進行麻醉,行腹主動脈取血,室溫靜置2小時,使用低溫高速離心機離心,3 500 rpm,離心15分鐘,使用無菌移液槍吸取上清至新的離心管,即為血清,凍存于-80°C冰箱。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco,11875-093),胎牛血清FBS(Gibco,10099141),高糖高脂試劑盒(鯤創(chuàng),KT002),0.25%胰酶+0.02%EDTA(Gibco,25300054),CCK-8試劑盒(北京翱擎生物,AQ308),胰島素放射免疫分析盒(北方生物技術(shù)研究所,國藥準(zhǔn)字S10930046),ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒(Solarbio,CA1020),Anti-β Actin(Abcam, ab8245),Anti-PI3K(CST, 4257),Anti-p-PI3K(CST, 4228s),Anti-Akt(CST, 4691),Anti-p-Akt(CST, 4060s),Anti-GSK-3β(Abcam,ab93926),Anti-p-GSK-3β(ser-9)(CST,5558T),Anti-PDX-1(Abcam,ab134150),Anti-MafA(Abcam,ab264418),LY294002(Abcam,ab120243)。

倒置相差顯微鏡(Nikon,日本),T25/T75細胞培養(yǎng)瓶(430641,CORNING),細胞培養(yǎng)箱(HERAcell150i,Thermo),酶標(biāo)儀(680,Bio-Rad),電泳儀(PowerPacTM,Bio-Rad),蛋白垂直電泳槽(MINI SUB,Bio-Rad)。

1.4 細胞造模建立與分組干預(yù)

參考制備糖脂毒性細胞模型相關(guān)實驗文獻,本實驗選用30 mmol/L葡萄糖(Glu)+棕櫚酸鈉(PA)進行造模,結(jié)合細胞活力及半數(shù)抑制率,設(shè)計實驗梯度進行PA造模條件摸索。為觀察腎氣丸加減方含藥血清促進MIN6增殖的最佳藥物濃度,根據(jù)藥物和大鼠血清的占比,含藥培養(yǎng)基設(shè)計2.5%、5%、10%、15%、20%不同濃度梯度預(yù)培養(yǎng)24小時后,根據(jù)上述最佳造模條件繼續(xù)干預(yù)24小時觀察最佳作用時間,實驗重復(fù)5次,按照腎氣丸加減方含藥血清促進MIN6增殖的最佳濃度進行后續(xù)實驗。

根據(jù)上述結(jié)果,實驗干預(yù)分組如下:空白組:培養(yǎng)基+15%空白血清;模型組:30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA+培養(yǎng)基+15%空白血清;腎氣丸加減方低劑量組:5%腎氣丸加減方含藥血清預(yù)培養(yǎng)24小時,后使用30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA+5%腎氣丸加減方含藥血清+10%空白血清培養(yǎng)基培養(yǎng);腎氣丸加減方中劑量組:10%腎氣丸加減方含藥血清預(yù)培養(yǎng)24小時,后使用30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA+10%腎氣丸加減方含藥血清+5%空白血清+培養(yǎng)基培養(yǎng);腎氣丸加減方高劑量組:15%腎氣丸加減方含藥血清預(yù)培養(yǎng)24小時,后使用30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA+15%腎氣丸加減方含藥血清+培養(yǎng)基培養(yǎng);通路阻滯劑組(LY294002):15%腎氣丸加減方含藥血清預(yù)培養(yǎng)24小時,后使用30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA +15%腎氣丸加減方含藥血清+培養(yǎng)基+50 μmol/L LY294002培養(yǎng)。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 CCK-8法檢測細胞活力 CCK-8法評估空白組、模型組及腎氣丸加減方低、中、高劑量組MIN6細胞活力:取對數(shù)生長期的MIN6細胞按照濃度1×105個細胞/mL(預(yù)實驗確定細胞個數(shù))接種于96孔板,每孔加入100 μL細胞混懸液,每組設(shè)5個復(fù)孔,邊緣留空白孔加入PBS,以免細胞混懸液蒸發(fā)。

CCK-8反應(yīng):按照預(yù)定時間取出孵育細胞,棄去孔中培養(yǎng)基,每孔加入10% CCK-8液在空白培養(yǎng)基中(孔中不能有氣泡),培養(yǎng)板繼續(xù)按照規(guī)定時間孵育。

上機檢測:按照預(yù)定時間觀察細胞顏色并上酶標(biāo)儀檢測,吸光值設(shè)定為450 nm,測定不同組別吸光度值。

1.5.2 細胞上清液胰島素含量測定 采用胰島素放射免疫分析試劑盒檢測空白組、模型組、腎氣丸加減方低、中、高劑量組MIN6細胞上清液胰島素含量。(1)藥品準(zhǔn)備:Ins.標(biāo)準(zhǔn)品、125I-Ins、豚抗-Ins.抗體、驢抗豚免疫分離劑、Ins.質(zhì)控血清、Ins.緩沖液。(2)測定步驟:取圓底聚苯乙烯試管若干,用記號筆或特殊鉛筆編號NSB、S0-S5和待測樣品管等,然后用微量加樣器按表1加樣。加樣前所有試劑(尤其分離劑)包括待測樣品要搖勻,并且最好平衡到室溫,每組重復(fù)3次。(3)數(shù)據(jù)處理: 由電腦自動處理得出結(jié)果,使用log-logit處理模式。

表1 加樣程序表 (單位:μL)

1.5.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 細胞以2×105個/mL接種于6孔板中,每孔加2 mL細胞混懸液,待細胞貼壁后按照1.4實驗分組給予不同處理,干預(yù)24小時后根據(jù)Annexin V FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書進行實驗:(1)使用細胞刮刀輕輕仔細刮下細胞(避免胰酶對細胞消化的傷害)轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,同上清液一起離心,離心結(jié)束后棄去上清,用預(yù)冷的含2%FBS的PBS洗滌細胞2次,第2次離心結(jié)束后使用1 × Buffer重懸細胞,進行細胞計數(shù),每組重復(fù)3次。(2)按照說明書調(diào)整細胞上機濃度為1×106個/mL,取100 μL轉(zhuǎn)移至Falcon流式管(提前在F管中加入AV、PI各5 μL),輕彈管身,充分混勻。(3)室溫避光孵育15分鐘后各管加入200 μL× Buffer,過濾后上機檢測。

1.5.4 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路和PDX-1/MafA蛋白表達檢測 免疫蛋白印跡法樣本收集:對數(shù)生長期的MIN6細胞以2×105個/mL接種于6孔板中,每孔加2 mL細胞混懸液,待細胞貼壁后按照實驗分組給予不同處理,干預(yù)24小時后處理細胞。BCA 法測定蛋白濃度并將各組濃度調(diào)平,蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉后加入一抗按一定比例稀釋抗體的抗體稀釋液中,置于4°C冰箱搖床上,搖蕩過夜。次日洗膜后孵育二抗(1∶5 000), 孵育結(jié)束洗膜后利用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,采用 Image J軟件統(tǒng)計蛋白條帶的灰度值及其相對應(yīng)的內(nèi)參蛋白條帶的灰度值。目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值,即為每個樣本所含目的蛋白的相對含量。每個目的基因至少測定3個樣本。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MIN6細胞模型的成功構(gòu)建

30 mmol/L Glu聯(lián)合PA呈梯度依賴性抑制MIN6細胞增殖,PA濃度越高細胞活力越低,直線回歸分析得出PA抑制細胞增殖的IC50值為0.38 mmol/L,故最終本實驗選取0.4 mmol/L PA聯(lián)合30 mmol/L Glu對MIN6細胞進行造模。見表2。

表2 PA造模法各濃度MIN6細胞活力吸光度值

2.2 腎氣丸加減方含藥血清改善MIN6細胞損傷模型的作用

與空白組相比,模型組細胞存活率顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,不同濃度腎氣丸加減方組含藥血清干預(yù)細胞后,細胞存活率均有不同程度的升高,其中2.5%含藥血清組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),5%、10%、15%以及20%組細胞存活率均有提升(P<0.05或P<0.01),其中5%～15%組細胞存活率呈升高趨勢,20%組細胞存活率較15%組出現(xiàn)下降,因此,選用15%組作為實驗中藥高劑量組,10%、5%依次作為實驗中、低劑量組。見表3。

表3 各組MIN6細胞活力吸光度值

2.3 腎氣丸加減方含藥血清對MIN6細胞胰島素分泌的影響

胰島素放射免疫分析結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組MIN6細胞胰島素分泌水平顯著下降(P<0.01)。與模型組細胞比較,腎氣丸加減方各組MIN6細胞胰島素分泌水平均升高(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 各組MIN6細胞胰島素分泌水平

2.4 腎氣丸加減方含藥血清對糖脂毒性誘導(dǎo)的MIN6細胞凋亡的影響

流式細胞實驗結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組MIN6細胞凋亡顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,腎氣丸加減方低、中、高劑量組MIN6細胞凋亡率均出現(xiàn)下降(P<0.05或P<0.01),其中高劑量組MIN6細胞凋亡率最低。見表5,圖1。

表5 各組MIN6細胞凋亡率

2.5 腎氣丸加減方含藥血清對MIN6細胞PI3K/AKT/GSK-3β信號通路蛋白表達的影響

2.5.1 MIN6細胞PI3K/AKT/GSK-3β信號通路蛋白表達檢測 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與空白組對比,模型組中PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT及p-GSK-3β蛋白表達均降低(P<0.05或P<0.01),GSK-3β表達量升高(P<0.05)。與模型組對比,腎氣丸加減方中劑量組、高劑量組中PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT及p-GSK-3β蛋白表達均升高(P<0.05或P<0.01),GSK-3β表達量降低(P<0.01)。通路阻滯劑組中腎氣丸加減方上述結(jié)果被抵消(P<0.05或P<0.01)。見表6,圖2。

注:A為空白組,B為模型組,C為腎氣丸加減方低劑量組,D為腎氣丸加減方中劑量組,E為腎氣丸加減方高劑量組,F為通路阻滯劑組。

表6 不同干預(yù)措施下MIN6細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的蛋白表達 目標(biāo)蛋白/Actin)

2.5.2 MIN6細胞PDX-1/MafA蛋白表達檢測 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與空白組對比,模型組中PDX-1及MafA蛋白表達均降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組對比,腎氣丸加減方各組中PDX-1及MafA蛋白表達均升高(P<0.05或P<0.01)。LY組中腎氣丸加減方上述結(jié)果被抵消(P<0.05或P<0.01)。見表7,圖3。

注:A為空白組,B為模型組,C為腎氣丸加減方低劑量組,D為腎氣丸加減方中劑量組,E為腎氣丸加減方高劑量組,F為通路阻滯劑組。

表7 不同干預(yù)措施下MIN6細胞PDX-1/MafA蛋白的表達 目標(biāo)蛋白/Actin)

3 討論

2型糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇,病因包括先天稟賦不足、后天失養(yǎng),病及五臟,尤與脾腎二臟密切相關(guān)?！捌⒅鬟\化”是維持胰島功能和血糖穩(wěn)態(tài)的核心環(huán)節(jié),恢復(fù)脾主運化功能可改善糖尿病胰島功能衰竭[16]。胰島β細胞衰竭原因是去分化而非凋亡,去分化過程與基因表達及結(jié)構(gòu)功能蛋白變化相關(guān),結(jié)合中醫(yī)腎主先天基礎(chǔ)理論,因此本研究選方腎氣丸加減方,源于《金匱要略》經(jīng)方金匱腎氣丸加減,本方補腎氣基礎(chǔ)上去大辛大熱的附子,改用胡蘆巴溫陽化氣,加用黃芪、黨參健脾助氣化,馬齒莧清熱利濕,全方補泄兼施,共奏補腎健脾,助陽化氣之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明,腎氣丸君藥生地有效成分環(huán)烯醚萜苷類具有促胰島素分泌和保護胰島細的胞功能[17-18],胡蘆巴的有效成分胡蘆巴堿能有效改善糖尿病大鼠糖脂代謝[19],馬齒莧有效成分馬齒莧多糖可促進胰島β細胞PDX-1蛋白表達,對胰島β細胞的增殖再生有促進作用[20],這為本研究選用腎氣丸加減方提供了理論基礎(chǔ)和實驗穩(wěn)定性。

慢性應(yīng)激環(huán)境是胰島β細胞去分化的主要誘導(dǎo)因素,糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)的高血糖和脂代謝紊亂是人體處于氧化應(yīng)激內(nèi)環(huán)境的主要原因之一[21],慢性應(yīng)激環(huán)境的解除是胰島β細胞再分化的前提基礎(chǔ),基于此,本研究選用高糖聯(lián)合棕櫚酸鈉來模擬糖尿病人體內(nèi)高糖高脂內(nèi)環(huán)境,觀察在高糖高脂作用條件下,腎氣丸加減方對胰島細胞功能的保護作用及作用機制。本研究選用30 mmol/L 葡萄糖聯(lián)合0.4 mmol/L棕櫚酸鈉作用24小時作為構(gòu)建體外細胞損傷模型的條件,CCK-8法測定模型組細胞活力值明顯下降,流式細胞實驗顯示模型組細胞凋亡率上升,說明成功構(gòu)建了穩(wěn)定的體外胰島β細胞損傷模型。在上述造模條件下,加入不同濃度腎氣丸加減方含藥血清干預(yù)24小時后,通過CCK-8法和流式細胞實驗觀察不同組MIN6細胞活力和凋亡率,結(jié)果顯示與模型組比較,腎氣丸加減方中、高劑量組細胞活力明顯升高,細胞凋亡水平下降,結(jié)合胰島素分泌水平的測定,證實腎氣丸加減方可提高高糖高脂造模條件下MIN6細胞活力,減少細胞凋亡率,顯著促進胰島素分泌,保護胰島β細胞功能。本研究中模型組細胞凋亡率為30%左右,但胰島素分泌水平卻下降很多,因此,是否有一部分細胞未發(fā)生凋亡,但已經(jīng)失去了胰島素分泌水平,無論胰島細胞凋亡還是去分化都屬于胰島β細胞功能障礙,腎氣丸加減方起到了恢復(fù)胰島β細胞功能的作用。

PDX-1與MafA基因被認為是胰島素基因轉(zhuǎn)錄“調(diào)節(jié)器”,其中PDX-1主要參與胰島細胞生理功能的維持,是胰腺發(fā)育形成的開關(guān)基因[22],對胰島β細胞具有促增生和抗凋亡的作用[23],PDX-1表達減少會造成胰島β細胞功能減退,自我修復(fù)能力減弱,使胰腺組織在高血糖環(huán)境中自我修復(fù)能力減弱,進而加重糖尿病進展,因此在調(diào)控胰島β細胞成熟、保護胰島β細胞功能以及促進胰島β細胞再生中,PDX-1因子的重要性處于核心位置。MafA作為胰島β細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,是葡萄糖刺激胰島β細胞進行胰島素基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一,與PDX-1分別結(jié)合胰島素基因啟動子調(diào)控區(qū)域的C1、A3順式作用元件,協(xié)同激活胰島素基因表達,促進胰島β細胞分泌胰島素,它在β細胞分化的最后階段胰島素生成細胞成批發(fā)育時才有所表達,對β細胞的生存、增殖有重要作用[24]。PI3K/AKT作為胰島β細胞中經(jīng)典代謝通路,其參與胰島β細胞增殖、胰島素代謝、葡萄糖利用等多個環(huán)節(jié),對胰島β細胞功能維持具有重要作用,這個信號通路的開啟信號通路調(diào)控著下游蛋白,包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和GSK-3β,GSK-3β通路調(diào)節(jié)細胞凋亡和炎癥等多種生物活性[25],活化的AKT作為GSK-3β的上游因子,與GSK-3β結(jié)合后使GSK-3β絲氨酸9位點磷酸化而失活,因此p-GSK-3β可發(fā)揮抗凋亡作用。同時,GSK-3β調(diào)節(jié)著胰島β細胞中PDX-1的穩(wěn)定性,GSK-3β作為糖原合成酶激酶的一種亞型,其過度激活對其他蛋白有降解作用[23]。本研究中模型組的GSK-3β蛋白表達升高,GSK-3β被激活同時PDX-1、MafA表達受抑制,其機制可能是由于GSK-3β參與了PDX-1和MafA蛋白的降解;腎氣丸加減方干預(yù)后,GSK-3β表達受到抑制,p-GSK-3β蛋白、PDX-1和MafA蛋白表達均上調(diào),且加入通路阻滯劑LY294002后,腎氣丸加減方以上作用被抵消,證明腎氣丸加減方可能通過PI3K/AKT/GSK-3β通路提高了PDX-1和MafA蛋白的表達,以此恢復(fù)胰島β細胞功能。

綜上所述,腎氣丸加減方含藥血清可以提高糖脂毒性作用下MIN6細胞活力,減少細胞凋亡,促進胰島素分泌。作用機制與 PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路的激活、抑制GSK-3β的表達有關(guān),進而升高PDX-1和MafA的蛋白表達,保護和恢復(fù)胰島β細胞功能。