白術(shù)對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠母胎界面輔助性T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

余甜 楊小頎 馬曉軍 胥冰

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)在我國是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次及以上的自然流產(chǎn)(流產(chǎn)發(fā)生于產(chǎn)婦孕28周前,且胎兒體重小于1 000 g)[1]。RSA病因復(fù)雜,且有半數(shù)以上的患者病因不明[2]。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)所分泌的白細(xì)胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatorycells,Treg)分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)共同參與調(diào)節(jié)母胎界面免疫耐受狀態(tài)的形成和維護(hù)[3],是RAS免疫致病因素中的重要影響因果。中藥白術(shù)可影響體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)[4-6],中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血?dú)庾阋责B(yǎng)胎,而脾為氣血生化之源,中藥白術(shù)為健脾良藥[7]。故筆者從中醫(yī)學(xué)角度推測(cè)白術(shù)可能通過健脾固攝、療養(yǎng)氣血安胎,并通過免疫學(xué)方法觀察RSA模型小鼠母胎界面的免疫狀態(tài),深入研究白術(shù)對(duì)異常妊娠免疫的恢復(fù)和維持作用,從而佐證中藥白術(shù)“健脾安胎”的理論。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取40只處于8周齡的清潔級(jí)CBA/J雌性小鼠、16只DBA/2雄性小鼠和4只BALB/C雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物,三種小鼠均購于南京卡文斯生物技術(shù)有限公司(由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營部培育出售)。許可證號(hào)碼:SCXK(滬)2018-0006。

1.2 主要藥品及試劑

中藥白術(shù)提取物購自西安德生元,7∶1水提;IL-17A及TGF-β1 ELISA試劑盒(上海艾萊薩,批號(hào):EIA-2223;EIA-2747);兔抗小鼠CD4及大鼠抗小鼠FOXP3(Servicebio,批號(hào):GB13064-2;GB13445);兔抗小鼠RORγt(Bioss,批號(hào):BS-23110R)。

1.3 動(dòng)物建模及分組給藥

雌性CBA/J與雄性DBA/2小鼠按照2∶1比例合籠為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型;雌性CBA/J與雄性BALB/C小鼠按照2∶1比例合籠為正常妊娠模型。10～12小時(shí)后檢查,見陰道栓的CBA/J則直接判定為成功懷孕,未見陰道栓者取陰道分泌物進(jìn)行染色鏡檢,見精子者與前者同判定為孕0天。后將受孕小鼠分為正常妊娠組、流產(chǎn)模型組及白術(shù)低劑量組、白術(shù)中劑量組、白術(shù)高劑量組,每組8只。白術(shù)灌胃量根據(jù)公式計(jì)算如下。見表1。

1.4 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 小鼠大體組織的觀察及計(jì)算 各組雌鼠于孕14天行最后一次灌胃后處死小鼠(頸椎脫臼),觀察陰道口是否出血。解剖暴露子宮后按照公式計(jì)算各組流產(chǎn)情況及胚胎吸收比例。右側(cè)子宮組織加入對(duì)應(yīng)量的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)(0.75 μg/mg,6倍于組織重量)后冷凍勻漿(4℃、2 000 rpm、20分鐘),用于ELISA法因子含量測(cè)定;左側(cè)子宮置入4%組織固定液中固定10小時(shí),然后轉(zhuǎn)入70%酒精中保存,用于石蠟包埋及切片染色。

1.4.2 HE染色對(duì)組織切片進(jìn)行病理觀察 將組織放入自動(dòng)脫水機(jī)中梯度脫水,后放于2組二甲苯中各30分鐘,再轉(zhuǎn)入65°石蠟2小時(shí),冷卻后設(shè)定4 μm為厚度進(jìn)行切片。染色:經(jīng)二甲苯20分鐘浸泡兩組后,轉(zhuǎn)入無水乙醇中浸泡5分鐘,重復(fù)2組,再轉(zhuǎn)入95%乙醇、90%乙醇和85%乙醇中各1分鐘;蘇木素3分鐘,自來水沖洗1分鐘,經(jīng)分化液處理20秒后再次用自來水沖洗1分鐘,再經(jīng)返藍(lán)30秒后自來水沖洗。85%乙醇和95%乙醇各5分鐘浸泡,再用伊紅染液染色5分鐘,自來水沖洗雜余染料后無水乙醇浸泡5分鐘,重復(fù)3組,二甲苯浸泡5分鐘,重復(fù)2組,最終使用中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.4.3 ELISA法測(cè)定 按照試劑套盒說明書,檢測(cè)小鼠子宮組織中IL-17A和TGF-β1細(xì)胞因子表達(dá),操作完成后用酶標(biāo)儀于450 nm波長處讀取吸光度(optical density,OD)值,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式,以獲得對(duì)應(yīng)細(xì)胞因子的含量。

1.4.4 免疫熒光雙染法檢測(cè)子宮組織內(nèi)Th17和Treg細(xì)胞 取石蠟切片脫蠟后送入微波爐行抗原修復(fù),后畫圈封閉,孵育30分鐘。兩種細(xì)胞均先進(jìn)行CD4染色,經(jīng)一抗、二抗、FITC后,加熱封閉。Th17細(xì)胞進(jìn)行FOXP3核抗體染色,Treg細(xì)胞進(jìn)行RORγt染色。后將自發(fā)熒光淬滅5分鐘,沖洗,行DAPI染色。最后用PBS脫色,封片,使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像,借助于圖像處理軟件Image J軟件將原圖片轉(zhuǎn)為灰度圖片,定量分析各圖像中熒光信號(hào)強(qiáng)度,計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠大體組織觀察與流產(chǎn)情況計(jì)算結(jié)果

各組孕鼠解剖后正常妊娠組的子宮胚胎完整連續(xù),大小一致,排列緊密,串如橢圓珍珠,整體色澤紅潤,透過子宮壁可見深色胎盤緊貼子宮內(nèi)壁。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組流產(chǎn)征象明顯,子宮體積減小,見部分胚胎明顯小于正常妊娠組,呈黑色或深血色,子宮整體顏色偏深呈淤血色,陰道口有不同程度出血。白術(shù)低、中、高劑量治療組中被吸收的胚胎情況較復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組有所緩解,胚胎流失較少,胚胎大小及發(fā)育情況較為正常。

經(jīng)公式計(jì)算后得出復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組流產(chǎn)率顯著高于其他各組,白術(shù)給藥各組流產(chǎn)率較復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組有所降低。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組胚胎吸收率明顯高于正常組(P<0.05);白術(shù)低、中劑量組胚胎吸收率均低于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組(P<0.05),而白術(shù)高劑量組與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組相比較差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),卻較正常妊娠組顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各處理組流產(chǎn)及胚胎吸收結(jié)果(鼠只=8)

2.2 各組孕鼠子宮組織HE染色光鏡觀察結(jié)果

下圖中1A為正常妊娠組子宮,見內(nèi)膜增厚且連續(xù),形態(tài)結(jié)構(gòu)完整正常,蛻膜細(xì)胞增多、排列規(guī)則正常,妊娠蛻膜化明顯,子宮腺體及血管清晰可見,未見異常炎性細(xì)胞。圖1B為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組子宮,見變薄斷裂脫落的子宮內(nèi)膜,蛻膜化程度低,蛻膜細(xì)胞數(shù)量少,排列雜亂模糊,有明顯的壞死,可見血管異常出血。圖1C1、C2、C3分別為白術(shù)低、中、高劑量治療組子宮圖片,與正常妊娠蛻膜化表現(xiàn)相似,圖1C1可見排列整齊的蛻膜細(xì)胞,圖1C2見蛻膜化和腺體增生同時(shí)存在、子宮內(nèi)膜呈給藥后的分泌反應(yīng),圖1C3可見蛻膜與炎性細(xì)胞浸潤,表明白術(shù)治療組小鼠較正常小鼠仍存在一定程度的流產(chǎn)征象。

注:A為正常妊娠模型組,B為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型組,C1為白術(shù)低劑量組,C2為白術(shù)中劑量組,C3為白術(shù)高劑量組。

2.3 各組孕鼠子宮組織中IL-17A、TGF-β1含量的比較

發(fā)性流產(chǎn)組子宮組織中的IL-17A含量明顯高于正常妊娠組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。白術(shù)給藥各劑量組與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組的IL-17A含量相比,前者均顯著低于后者(P<0.01);其中白術(shù)低劑量組與白術(shù)高劑量組組間無差異(P>0.05),但均顯著高于白術(shù)中劑量組(P<0.05)。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組中TGF-β1的含量與正常妊娠組相比較低(P<0.01)。白術(shù)低、中劑量組子宮組織中的TGF-β1含量高于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組,差異極明顯(P<0.01),白術(shù)中劑量組的TGF-β1含量雖高于白術(shù)低劑量組與白術(shù)高劑量組,但各劑量組組間差異較小,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠子宮組織中IL-17A及TGF-β1的含量鼠只=8)

2.4 各組孕鼠子宮組織中Th17、Treg細(xì)胞熒光定量比較分析

熒光強(qiáng)度定量平均值比較中復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組RORγt的熒光強(qiáng)度高于正常妊娠組(P<0.05)及白術(shù)各給藥組(P<0.05),白術(shù)低劑量組和高劑量組顯著高于中劑量組(P<0.05),但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組FOXP3熒光強(qiáng)度顯著低于正常妊娠組(P<0.05),白術(shù)各給藥組中高劑量組熒光強(qiáng)度雖高于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);三種治療劑量組相比較,白術(shù)中劑量組的免疫熒光強(qiáng)度為其中最高,且高劑量組與中劑量組間差異明顯(P<0.05。詳見表4。

表4 各組中子宮組織中RORγt和FOXP3免疫熒光平均光密度值鼠只=8)

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者通常在孕早、中期即會(huì)發(fā)生胚胎丟失的現(xiàn)象[8],其中包括早期因種植失敗發(fā)生的生化妊娠。盡管現(xiàn)調(diào)查顯示在妊娠婦女已至少有1%～5%會(huì)診斷為該疾病,但由于生化妊娠及人文等因素的存在,患病率可能遠(yuǎn)不止如此。本實(shí)驗(yàn)采用國際公認(rèn)的自然流產(chǎn)小鼠模型CBA/J雌鼠×DBA/2雄鼠,胚胎吸收率可達(dá)36.49%[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中RSA流產(chǎn)模型組流產(chǎn)小鼠所占百分比達(dá)62.5%(5/8),胚胎吸收率為34.6%(18/52),均顯著高于正常妊娠組,且符合當(dāng)前文獻(xiàn)調(diào)查結(jié)果范圍。本實(shí)驗(yàn)中白術(shù)中等劑量灌胃液根據(jù)人的臨床常用白術(shù)劑量經(jīng)公式轉(zhuǎn)化而來,在三組中胚胎吸收率最低(10.5%,6/57),且相對(duì)流產(chǎn)模型組具有顯著改善。說明中等劑量白術(shù)對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療具有積極的改善作用,可能于胚胎種植開始抵抗小鼠先天流產(chǎn)傾向。

中藥白術(shù)具有健脾功效,自古被稱為“安胎妙藥”,可從“健脾固攝,補(bǔ)氣安胎”的角度治療“滑胎”“數(shù)墮胎”[11]。《中華人民共和國藥典》(2020版)指明白術(shù)具有胎兒保護(hù)作用,尤其在調(diào)節(jié)平滑肌收縮方面已然得到了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明[12]。中醫(yī)治療RSA依照“預(yù)培其損,辨證論治”原則進(jìn)行。多項(xiàng)基于中醫(yī)傳承平臺(tái)的數(shù)據(jù)挖掘中顯示[13-14],無論在中醫(yī)藥古籍記載明方或是現(xiàn)代醫(yī)者用方中,白術(shù)均排在“RSA用藥頻次表”前列,可見白術(shù)在中醫(yī)藥治療RSA中的重要性和實(shí)用性。經(jīng)過本次實(shí)驗(yàn)證明,白術(shù)單藥給藥后各組與流產(chǎn)模型相比均降低了胚胎吸收率,進(jìn)一步證明白術(shù)可能在復(fù)方中起到重要作用,也為白術(shù)用于配伍提供了充足的理論依據(jù)。

Th17/Treg細(xì)胞之間的平衡對(duì)機(jī)體維持自身穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。Th17細(xì)胞分泌促炎性因子IL-17A,與多種自身免疫性疾病的發(fā)生相關(guān)[15];而Treg細(xì)胞分泌TGF-β1、IL-10等細(xì)胞因子,有抗炎和維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用,在妊娠過程中增強(qiáng)母體免疫耐受并防止妊娠母體對(duì)胎兒的免疫排斥[16]。有研究表明Th17細(xì)胞可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng),并在功能上對(duì)抗Treg細(xì)胞[17];以IL-17抗體對(duì)自然流產(chǎn)小鼠進(jìn)行治療,胚胎流失率得到顯著改善[18]。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA方法檢測(cè)子宮局部IL-17A和TGF-β1的表達(dá)可間接反應(yīng)機(jī)體Th17和Treg細(xì)胞的水平。其中復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組子宮局部IL-17A含量較高,其余各組相比都表現(xiàn)為顯著增多的現(xiàn)象。白術(shù)給藥后,IL-17A含量有所降低,說明白術(shù)可能通過影響Th17細(xì)胞分泌IL-17A功能或直接影響Th17分化,從而起到對(duì)抗流產(chǎn)發(fā)生的作用。白術(shù)中劑量組降低IL-17A的效果優(yōu)于其他兩組,表現(xiàn)為更好地促進(jìn)妊娠效果。

近年來有研究發(fā)現(xiàn),Treg與其他T細(xì)胞亞群相比分化更為復(fù)雜,在特定環(huán)境下可重新分化回Th細(xì)胞,并留有Treg細(xì)胞的免疫抑制功能特征。所以在FOXP3+Treg細(xì)胞中除起到本身控制免疫排斥的作用外,還可能存在Th1樣、Th2樣,甚至是與之功能相反的Th17樣的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[19],提示我們應(yīng)從更廣更深的角度研究不同種Treg對(duì)于母胎免疫的影響。Treg細(xì)胞群對(duì)于成功懷孕的重要性已經(jīng)在人類和動(dòng)物模型中得到證實(shí)[20-21],且在RSA患者體內(nèi)較Th17細(xì)胞變化更為顯著,提示其對(duì)妊娠結(jié)局的影響更為重大。Treg細(xì)胞除了可以抑制炎癥,防止母體對(duì)胎兒過度免疫外,還被證明在妊娠期間有助于調(diào)節(jié)母體血管功能,支持正常胎兒和胎盤發(fā)育[22]。本實(shí)驗(yàn)中,正常妊娠組TGF-β1表達(dá)含量遠(yuǎn)高于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組小鼠,白術(shù)給藥后均比模型組有所上升,趨于正常妊娠組正常含量。三組劑量雖有不同,所得TGF-β1含量差異卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此說明,白術(shù)可調(diào)控TGF-β1值由流產(chǎn)象趨于正常妊娠狀態(tài)進(jìn)行變化,在局部發(fā)揮促進(jìn)免疫的作用。但由于TGF-β1來源及功能復(fù)雜,應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合更特異性的檢測(cè)方法來判定妊娠免疫時(shí)Treg的情況。

除此之外,本實(shí)驗(yàn)結(jié)合免疫熒光雙染法,通過各細(xì)胞特征性表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子RORγt、FOXP3來確定Th17和Treg細(xì)胞在母胎界面局部具體的分布情況。其中以RORγt平均光密度代表CD4+RORγt+Th17細(xì)胞的相對(duì)含量,FOXP3平均光密度代表CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞的相對(duì)含量[23]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組內(nèi)RORγt熒光強(qiáng)度顯著高于其他各組,FOXP3的熒光強(qiáng)度低于其他各組,尤其與正常妊娠組形成鮮明對(duì)比。白術(shù)各給藥組RORγt熒光強(qiáng)度的情況與ELISA法分析IL-17A含量的情況一致,且兩種方法對(duì)Th17的相對(duì)檢測(cè)具有一致性,提示可用兩種檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)RSA患者Th17水平進(jìn)行檢測(cè),從而對(duì)疾病起到一定診斷作用;而對(duì)Treg而言建議進(jìn)一步做詳盡的分型檢查,以確定Treg的分化與分泌情況。

綜上所述,根據(jù)本研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知:對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型進(jìn)行不同濃度的白術(shù)干預(yù)后,其流產(chǎn)率和胚胎吸收率顯著降低,這充分說明白術(shù)能夠有效改善和預(yù)防復(fù)發(fā)性流產(chǎn)行為發(fā)生。白術(shù)在抑制Th17的同時(shí),又能夠刺激Treg的表達(dá)水平,使得耐受型免疫反應(yīng)在母胎界面中占據(jù)優(yōu)勢(shì),起到良好的固胎效果。